TRÍCH YẾU LUẬN ÁN 1. Tóm tắt mở đầu - Tên tác giả: Nguyễn Thị Hồng Thắm - Tên luận án: Nghiên cứu chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 hiện đang lưu hành tại Việt Nam tạo được đáp ứng miễn dịch bảo hộ cao trên vịt - Chuyên ngành: Vi sinh vật thú y - Mã số: 62 62 50 10 - Tên cơ sở đào tạo: Viện Thú y 2. Nội dung trích yếu 2.1. Vấn đề nghiên cứu Cúm gia cầm do vi rút cúm A/H5N1 là một bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nặng nề ở Việt Nam từ 2003. Theo OIE, tính đến tháng 10/2014, Việt Nam là nước có nhiều ổ dịch cúm gia cầm nhất (2720 ổ dịch) và đã có 127 người nhiễm cúm A/H5N1 trong số đó 64 tử vong. Phòng bệnh cúm gia cầm bằng văc xin là một trong những biện pháp chủ động và hữu hiệu, nhưng cho đến thời điểm hiện tại, Việt Nam vẫn sử dụng chủ yếu nguồn văc xin nhập ngoại, có hiệu lực không ổn định trên vịt, một loài được coi là lưu cữu nguồn bệnh. Văc xin nội địa sử dụng chủng nhập ngoại (có nguồn gốc từ chủng xuất hiện đầu ổ dịch năm 2003) chỉ phù hợp với một số vùng vẫn còn chủng cũ lưu hành. Để phát triển văc xin phòng bệnh (với bất kỳ công nghệ nào), khâu đầu tiên vẫn là lựa chọn và tạo đư ợc chủng giống gốc phù hợp với các vi rút đang lưu hành. Nghiên cứu này tập trung vào việc chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 hiện đang lưu hành tại Việt Nam tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cao trên vịt. 2.2. Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án Mục tiêu nghiên cứu của luận án là chọn được chủng vi rút cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ cao ở vịt nhằm tiến tới chủ động chế tạo vắc xin phòng bệnh cho gia cầm, đặc biệt là cho thủy cầm nuôi ở nước ta. Đối tượng nghiên cứu: Vi r út cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam; Gene HA của vi rút cúm A/H5N1, và đáp ứng miễn dịch bảo hộ của gia cầm được tiêm văc xin cúm A/H5N1 vô hoạt tự tạo. 2.3 Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng Các phương phá p và kỹ thuật nghiên cứu đã sử dụng gồm các kỹ thuật truyền thống và hiện đại liên quan công nghệ vi sinh, tế bào, văc xin và sinh học phân tử bao gồm: Nuôi cấy vi rút Cúm gia cầm trên phôi trứng và tế bào dòng, chuẩn độ vi rút, bất hoạt vi rút, cô đặc vi rút, nhũ hóa, gây miễn dịch, thử thách cường độc; Phương pháp RT-PCR, realtime RT-PCR, giải trình tự gene, phân tích di truyền và xây dựng cây phả hệ. 2.4 Các kết quả chính và kết luận: Đã đư ợc lựa chọn được chủng vi rút cúm A/H5N1 (A/Dk/VN/Qb7412) đại diện cho clade 2.3.2.1c mới xuất hiện và đang lưu hành; sau 10 lần tiếp đời trên phôi trứng gà và tế bào MDCK đã tạo được hai chủng gốc 7412PG và 7412TB sản xuất văc xin vô hoạt Vi rút cúm A/H5N1 chủng A/Dk/VN/QB7412 có genome gồn 8 phân đoạn bình thường, không có đoạn thêm hoặc khuyết thiếu, trình tự genome của vi rút 13.067 bp đã đăng ký tại Genbank và có thể truy cập theo mã số KF182738 đến KF182745). Đây là chủng có độc lực cao, có khả năng gây chết 83% vịt tại liều 200 µl ở độ pha loãng 1/8 x 8log2HA và gây chết 100% gà ở liều 100 LD50. Văc xin vô hoạt, nhũ dầu chế từ hai chủng giống có khả năng bảo hộ 92,31% vịt khi công cường độc với chủng nguyên gốc. Kết quả thử nghiệm đã được kiểm chứng và lặp lại trong điều kiện t hực địa. Ngoài ra văc xin còn có khả năng bảo hộ chéo với vi rút cúm A/H5N1 thuộc các clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b và clade 1 đã lưu hành trước đây. Ý nghĩa khoa học: Thà nh công của đề tài đã chứng minh được khả năng chọn lựa chủng để sản xuất văc xin từ các chủng phâ n lập tại Việt Nam, có khả năng bảo hộ đối với đồng và dị clade vi rút cúm A/H5N1 lưu hành trước đó, mở ra khả năng nghiên cứu phân lập và tạo chủng sản xuất văc xin động vật các chủng mới xuất hiện. Ý nghĩa thực tiễn: Cung cấp 2 giống gốc sẵn sàng cho sản xuất văc xin văc xin vô hoạt trên phôi trứng gà và trên tế bào, hoặc là nguofng chủng cho ứng dụng kỹ thuật reverse genetic tạo chủng sản xuất văc xin a n toàn hơn. Đóng góp mới của luận án: Kết quả của đề tài có 4 đóng góp mới: 1. Thiết lập đư ợc quy trình lựa chọn chủng vi rút cúm A/H5N1 phân lập để làm văc xin. 2. Tạo được hai giống gốc để sản xuất văc xin vô hoạt cho m iễn dịch bảo hộ cao trên vịt. 3. P hát hiện vùng đột biến điểm đặc hiệu cho “thích ứng ký c hủ mới” ở gene HA2. 4. Đã thiết lập được liều gâ y chết trên 80% vịt dùng trong thí nghiệm công cường độc. Thầy hướng dẫn Nghiên cứu sinh Nguyễn Viết Không Nguyễn Thị Hồng Thắm THESIS DISSERTATION 1. Summary of Introduction - Name of the Ph.D candidate: Nguyen Thi Hong Tham - Thesis title: Study to select virus strain avian influenza currently circulating in Vietnam, whic h can generate highly protective immune response in ducks. - Code: veterinary microbiology 62 62 50 10 - Instutution: National Institute of Veterinary Research 2. Contents of abstract 2.1. Introduction Avian influenza type A/H5N1 is dangerous disease that causes tremendous economic losses in Vietnam since 2003; According to OIE update information, to Oct. 2014, Vietnam is the country that has highest number of avian influenza outbreaks, and there have been 127 infection human cases of which 64 death. Prophylaxis by vaccination is one of the active and effective methods, but up to date, most of Avian influenza vaccine used in Vietnam was from imported source, which produces in consistent efficacy for duck (Avian influenza virus reservoir). Local produced vaccines used the imported master seed (generated from the strains emerged since 2003) has effective only in limited area where the corresponding strains are still circulated. To develop a vaccine (by any technology), the first step is always selection of vaccine strain and generate a master seed that has to match to the currently circulating strains. This study focus on the selection of the Avian influenza virus A/H5N1 currently circulating in Vietnam, which can generate highly protective immune response in ducks. 2.2. Aim and objectives The aim of this study is to select a strain of avian influenza A/H5N1 virus isolated from Vietnam that can trigger high protective immune response in duck in order to produce autonomously local inactivated vaccine for poultry and in particular for water fowls. Objectives: Avian influenza A/H5N1 virus isolated from Vietnam; HA Gene of HPAI A/H5N1, and protective immune response of poultry vaccinated by inactivated vaccine. 2.3 Methods Method invol ved the modem and classical techniques including microbiology, cell technology, and molecular biology e.g. cell culture (MDCK), viral titration, inactivation, viral concentration, emulsification, immunization, challenging experiments, RT-PCR, realtime RT- PCR, sequencing, phylogenetic analysis. 2.4 M ajor results and conclusion: We have selected a avian influenza A/H5N1 virus strain (A/Dk/VN/Qb7412), representative strain of clade 2.3.2.1c newly emerging and currently circulated strain, which, after 10 passages on embryonated eggs and MDCK cell lines resulted in two masters seed 7412PG and 7412TB for inactivated vaccine production. Avian influenza A/H5N1 virus, strain A/Dk/VN/QB7412, possess a normal genome of 8 segments without any particular insertions or deletions. The whole genome sequence of 13.067 bp can be retrieved at Genbank with Accession Numbers KF182738 - KF182745. This is a virulent strain, capable of generation the lethal rate of 83% for experimental duck at dose of 200 µl in dilution of 1/8 of the allantoic fluid containing 8log2HA virus antigen and 100% chicken at 100 LD 50 dose. Oil-adjuvanted inactivated vaccine generated from these 2 master seeds can protect 92,31% immunized ducks when challenged with the A/Dk/VN/QB7412 of origin. This laboratory outcome has been verified in the field condition. Furthermore, these inactivated vaccine could generate cross-protection against avian influenza virus type A, clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b and clade 1 previously circulated. Siectific outcome: The successes of the thesis have proven a concept that it is always possible to select a viral strains for vaccine production from the collection of local isolates in Vietnam that have property to give protect poultry from the same or cross-clade ancestor viruses, opening the possibility to select for vaccine strain when there is new strain emerged. Practical outcome: The results have provided 2 master seed strains, readily used for autonomous production of avian influenza inactivated vaccine (on embryonated eggs and MDCK cell line), or alternatively be subjective for further reverse genetic modification to generate a vaccine strains that are safer in performance. New contribution: The out puts may have 4 new contribution: 1. Establisment of protocol of viral selection for vaccinated strain from local isolations. 2. Generati ons of 2 master seeds for inactivated vaccine production that gave high protective immune status in ducks. 3. Reveal a hots pot mutation “new experimental host cell adaptation” in the HA2 gene. 4. Establishment of challenging dose for duck useful in efficacy test Suppervis or PhD candidate Ass Prof. Dr. Nguyen Viet Khong Nguyen Thi Hong Tham