NGHIÊN CỨU CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT AXÍT PHENYLLACTIC ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN NÔNG SẢN VÀ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Do đó, việc nghiên cứu, tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinhhọc để bảo quản nông sản và thực phẩm đã thu hút được sự chú ý của nhiềunhà khoa học trên thế giới, bởi sự an toàn của

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Công tác bảo quản nông sản, thực phẩm luôn là mối quan tâm hàng đầucủa các nước trên thế giới nói chung cũng như ở Việt Nam nói riêng, màtrọng tâm là bảo quản nông sản và thực phẩm tránh khỏi sự xâm nhiễm củacác vi sinh vật (VSV) gây bệnh cho người, động vật và các VSV gây ảnhhưởng đến giá trị dinh dưỡng, giá trị thẩm mỹ của nông sản, thực phẩm

Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằngnhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hoáhọc, trong đó việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổbiến Tuy nhiên do thiếu hiểu biết, nhiều nơi đã dùng cả các hóa chất khôngđược phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định đã gây nguy hiểm cho

người tiêu dùng (Kỹ thuật và công nghệ bảo quản - chế biến – tiêu thụ - Số 3/

III/2009) Một số chất bảo quản thường được sử dụng trong bảo quản các loại

thực phẩm chế biến như axit benzoic, sodium benzoat, sodium propionate,potassium sorbate, methyl paraben, vv Các chất này có thể ức chế hoạtđộng hoặc tiêu diệt vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm mà không làm ảnhhưởng đến trạng thái bên ngoài cũng như mùi vị, chất lượng của thực phẩm.Nhưng trên thực tế nhiều loại thực phẩm trên thị trường phần lớn sử dụngnhững loại chất này với hàm lượng vượt quá mức quy định cho phép đã gây

ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng (Nguyễn Hương- Tạp chí Công

nghiệp hoá chất số 6/2003) Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn

chế, đặc biệt bảo quản bằng phương pháp hoá học có thể làm ảnh hưởng lâudài tới sức khoẻ con người và môi trường

Do đó, việc nghiên cứu, tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinhhọc để bảo quản nông sản và thực phẩm đã thu hút được sự chú ý của nhiềunhà khoa học trên thế giới, bởi sự an toàn của nó đối với sức khỏe con người

và tính thân thiện với môi trường sống Đó là những chất đã được tổ chức

lương thực thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) kiểm định là antoàn, chúng có hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của VSV hoặc bào tử, đôi khitiêu huỷ cả VSV gây bệnh trên nông sản và thực phẩm cũng như các VSV gâyảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng, giá trị thẩm mỹ của nông sản, thực phẩm.

Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu

và bước đầu tìm ra một chất bảo quản mới có ứng dụng và đạt hiệu quả caotrong công tác bảo quản nông sản và thực phẩm, đó là axít phenyllactic(PLA)

PLA là một hợp chất kháng VSV, nó được chứng minh là có khả năng ứcchế sự sinh trưởng và phát triển của một số loài vi khuẩn Gram âm, Gramdương trong đó có một số loài gây bệnh đường ruột cùng nhiều loài nấm men,nấm mốc gây hại nông sản, thực phẩm [12]

Việc ứng dụng PLA trong bảo quản được xem là hướng ứng dụng mớitrong việc sử dụng hợp chất tự nhiên để kiểm soát, ngăn ngừa sự xâm nhiễmcủa vi sinh vật gây hại nhằm kéo dài thời gian bảo quản nông sản và thựcphẩm Đồng thời lại an toàn cho sức khoẻ người sử dụng, không gây ảnhhưởng tới môi trường sống

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu tuyển chọn và phân lập được các chủng vikhuẩn lactic có khả năng sinh PLA đạt hiệu suất cao là mục tiêu và nội dung

nghiên cứu chính của đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất

chế phẩm Phenyllactic acid từ vi khuẩn lactic phục vụ bảo quản nông sản và thực phẩm ” thuộc “Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020” Chúng tôi đã tiến hành lựa

chọn đề tài “Nghiên cứu chọn chủng vi khuẩn lactic để sản xuất axít phenyllactic ứng dụng trong bảo quản nông sản và thực phẩm”, với mong

muốn tìm ra các chất bảo quản nông sản và thực phẩm có nguồn gốc sinh học,

an toàn để thay thế các chất bảo quản hóa học đang sử dụng hiện nay

Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc

nhóm vi khuẩn lactic để sản xuất PLA có khả năng ức chế vi sinh vật gây hại,phục vụ công tác bảo quản nông sản và thực phẩm

Nội dung nghiên cứu chính của đề tài:

Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh PLA hiệu

suất cao từ các nguồn thực phẩm của Việt Nam

Nội dung 2: Nghiên cứu đặc tính sinh học cơ bản của chủng vi khuẩn

lactic tuyển chọn được

Nội dung 3: Nghiên cứu, lựa chọn các điều kiện lên men tối ưu sinh

tổng hợp PLA quy mô phòng thí nghiệm

Nội dung 4: Bước đầu nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn, nấm gây

hại nông sản và thực phẩm của PLA

NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1.Thực trạng về ngộ độc thực phẩm và những tổn thất do ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Trên thế giới

Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của nền kinh tế thế giới, dân sốngày càng đông, lối sống của con người thay đổi, nhu cầu cho cuộc sống tănglên, các hoạt động giao lưu, du lịch, sự phân phối thực phẩm trên phạm virộng, các mầm bệnh do VSV ngày càng nhiều,… đó là những nguyên nhânlàm cho ngộ độc thực phẩm (NĐTP) dễ xảy ra và ngày càng trở lên nghiêmtrọng hơn trên toàn thế giới

Vi khuẩn gây bệnh là nguyên nhân dẫn đầu gây ra NĐTP cho conngười NĐTP có thể đe dọa đến tính mạng con người hoặc làm suy yếu sứckhỏe kéo dài, gây bệnh mãn tính, không chữa trị có thể dẫn đến tử vong, gâytổn thất lớn về kinh tế cho các nước

Theo uỷ ban Khoa học và Công nghệ Hoa Kỳ, ước tính rằng có tới 76triệu trường hợp bị bệnh do NĐTP xảy ra hàng năm với 325.000 người phảinhập viện và 5000 người tử vong Thực phẩm chính là thịt lợn, thịt gia cầm,trứng, hải sản và các sản phẩm sữa bị nhiễm khuẩn đã tiêu tốn từ 6,5 - 34,9 tỷ

đô la [38]

Nguyên nhân chủ yếu là do VSV gây ra, ở Mỹ có 3 tác nhân gây bệnh

chủ yếu là Salmonella, Listeria và Toxoplasma gây tử vong, khoảng 1500

trường hợp mỗi năm Các loại vi khuẩn gây bệnh trên rau và quả gồm:

Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Campylobacter sp [40]

Năm 1999 tại Australia, trên 500 người ngộc độc do uống phải nước

cam nhiễm vi khuẩn Salmonela Năm 2003 ở Hoa Kỳ, hành lá nhiễm khuẩn bị

quy là thủ phạm chính gây ra dịch viêm gan làm 400 người mắc bệnh và 3 ca

tử vong Năm 2004, Hoa Kỳ và Canada, 3 đợt dịch nhiểm khuẩn Salmonela

liên quan tới cà chua Roma làm 561 người bị ngộ độc [40]

Trong những năm gần đây, tình trạng NĐTP có liên quan đến Listeria

monocytogenes đã bùng phát tại nhiều nước trên thế giới Theo thống kê của

Mỹ, hàng năm tại nước này số bệnh nhân nhiễm bệnh do vi khuẩn Listeria

khoảng 2500 người với gần 500 người chết, còn tại Anh từ 2001 - 2005 đã có

1993 người mắc phải vi khuẩn này Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, vi

khuẩn Listeria đã được Tổ chức y tế thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học

có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm Listeria phân tán

rộng rãi trong môi trường đất, nước,… nên rất dễ lây nhiễm qua thực phẩm,nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thựcphẩm mà chúng còn gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: viêm não, nhiễmtrong máu Do đó, việc nghiên cứu để đưa vào sản suất và ứng dụng các hợp

chất có nguồn gốc sinh học có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt Listeria là một

yêu cầu cấp thiết [34]

Trong những ngày cuối tháng 5 và đầu tháng 6, năm 20 vừa qua, ở một

số nước Châu Âu đã xảy ra tình trạng NĐTP do sử dụng thức ăn bị nghi ngờ

là nhiễm vi khuẩn E.coli, đã cướp đi sinh mạng của nhiều người và gây tổn

thất lớn cho nền kinh tế của các quốc gia đó

Theo báo cáo, đợt bùng phát dịch E.coli tại châu Âu đã gây ra 24 trường hợp

tử vong và khiến 2.400 người bị lây nhiễm cho đến nay Theo WHO, có

khoảng 3.255 người nhiễm khuẩn E.coli tại 14 quốc gia ở châu Âu, Mỹ và tại Canada Hầu hết trường hợp nhiễm khuẩn E.coli là ở những người đến từ Đức

hoặc từng du lịch đến nước này, nơi được coi là trung tâm đầu mối phát sinh

vi khuẩn E.coli [35]

1.1.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cùng với mức sống của người dân từng bước được nâng cao,

vệ sinh an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề ngày càng bức xúc của toàn

xã hội, đặc biệt khi Việt Nam gia nhập WTO thì đây là một thách thức to lớn

Ô nhiễm thực phẩm gây tổn thất về kinh tế, ảnh hưởng đến sức khoẻ ngườitiêu dùng, an ninh xã hội và hội nhập kinh tế quốc tế của Việt Nam

Từ năm 1997 đến năm 2000, thống kê cho thấy có 1364 vụ NĐTP với24.514 người mắc và 207 người chết Chỉ tính riêng 5 bệnh (tả, thương hàn, lỵtrực trùng, lỵ amibe và tiêu chảy) đã có 3.540.719 người mắc và 205 ngườichết, những tổn thất về NĐTP mỗi năm ước tính khoảng 500 tỷ đồng [4]

NĐTP xảy ra trên cả nước, với số lượng người mắc lên đến hàng trăm,thậm chí hàng nghìn người Theo tổng kết của Cục an toàn vệ sinh thực phẩm,

từ năm 1999 đến năm 2004, mỗi năm nước ta có từ 145 đến 327 vụ NĐTP với

số lượng người bị ngộ độc từ 3584 đến 7576 người và từ 37 đến 71 người tửvong Nguyên nhân do vi sinh vật (32,8-55,8%) [45]

Bảng 1 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta từ 1999 đến 2005 Năm Số vụ ngộ độc Số nạn nhân Số người tử vong

Số vụ ngộ độc hàng loạt

(Cục An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm, Bộ Y Tế), (-): không thống kê được

Từ đầu năm 2008 tính đến tháng 7 năm 2008, ở nước ta đã có 106 vụNĐTP, gần 5000 người mắc và 43 người đã bị tử vong Trong năm 2009, theothống kê của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, số vụ ngộ độc có giảm nhưng sốngười mắc và tử vong lại tăng lên đến mức lo ngại Trong tổng số 7.828người mắc có đến 61 vụ tử vong [42]

Cùng với đó, từ ngày 21/3/2009 đến ngày 20/4/2009, nguyên Bộtrưởng Bộ y tế Nguyễn Quốc Triệu cho biết cả nước xảy ra 4 vụ ngộ độc thựcphẩm tại 4 tỉnh với 936 người mắc, số người phải nhập viện là 859 người và

số người tử vong là 7 người Tại Hà Giang xảy ra 5 vụ, Đồng Nai 1 vụ, Nghệ

An 1 vụ, thành phố Hồ Chí Minh 1 vụ [39]

Tình trạng NĐTP ngày càng gia tăng, thông tin từ Bộ Y tế cho biếttrong tháng 3/2010 đã xảy ra 9 vụ ngộ độc làm 161 người mắc, 149 ngườiphải nhập viện Như vậy, từ ngày 17/12/2009 đến 17/3/2010 toàn quốc đãxảy ra 23 vụ NĐTP với 738 người mắc, 686 người nhập viện, trong đó có

12 trường hợp tử vong[37]

Theo ông Nguyễn Quốc Triệu, nguyên Bộ Trưởng Bộ Y tế cho biết,trong 3 tháng đầu năm 20, toàn quốc xảy ra 16 vụ ngộ độc thực phẩm với 442người mắc và 5 người tử vong, trong đó có 1 vụ ngộ độc tập thể 30 người[38]

Vì vậy, việc nghiên cứu, tìm ra những công nghệ bảo quản mới để ngănngừa sự hư hỏng và nhiễm độc thực phẩm là vấn đề cấp bách Vấn đề nghiêncứu công nghệ sản xuất và sử dụng PLA, hoặc kết hợp sử dụng PLA với xử lýhoá lý có thể là biện pháp hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng củanguyên liệu thô và thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩnlàm hỏng, gây bệnh cho người tiêu dùng [16]

1.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng axít phenyllactic từ vi sinh vật trên thế giới

1.2.1 Axít phenyllactic và hoạt tính kháng vi sinh vật

PLA là một loại axít thơm, thuộc nhóm chất bảo quản có nguồn gốcsinh học được sinh tổng hợp bởi một số chủng vi sinh vật PLA có công thứcphân tử là C9H10O3, trong phân tử có chứa vòng thơm (thể hiện ở hình 1 dướiđây), nó là chất dễ dàng hoà tan trong nước tạo thành dung dịch, nhiệt độ tan

chảy là 121-1250C, khối lượng phân tử 166,2 đvc, có thể bảo quản ở nhiệt độ2-80C [31]

Hình 1 Công thức cấu tạo của PLA

PLA được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triển củamột số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men, nấmmốc gây hại thực phẩm [14],[21] Paola Lavermicocca cùng cộng sự (2002)

đã nghiên cứu và chỉ ra rằng PLA được sinh ra từ chủng Lactobacillus

plantarum có khả năng ức chế khả năng sinh trưởng và phát triển của 23

chủng nấm mốc thuộc 14 loài của 3 chi Aspergillus, Penicillium, và

Fusarium, đặc biệt có những loài sinh độc tố như Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ các sản phẩm như bánh, bột và ngũ cốc Với

liều lượng thấp hơn 7,5 mg/ml PLA có khả năng ức chế 90% sự phát triển củacác chủng này[20] Dieuleveux và cộng sự (1998) đã chứng minh được rằng

PLA ở liều lượng 13mg/ml có khả năng ức chế Listeria monocytogenes và ở

nồng độ 20 mg/ml ức chế một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở người là

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và Aeromonas hydrophila [12].

PLA có tác dụng gây ra những biến đổi trong cấu trúc và hoạt động của

vi khuẩn Listeria monocytogenes, cơ chế diệt khuẩn này được lý giải như sau:

khi có mặt PLA, vi khuẩn tập hợp thành các khối và các polysaccarit đượctách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, tính linh hoạt, tính bán thấm,

làm cho tế bào trương nước, căng ra, cuối cùng các tế bào vi khuẩn bị vỡ vàtan rã [13] Cũng trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng, ở nồng độ 7mg/ml,

PLA có thể tiêu diệt được Listeria monocytogenes trên môi trường dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm men (TSB – YE) Mật độ Listeria

trên môi trường TSB – YE có PLA, mật độ của vi khuẩn này cũng giảm 1000lần khi có mặt PLA trong giai đoạn vi khuẩn đang tăng trưởng PLA có tácdụng kìm khuẩn trong sữa tiệt trùng, lượng vi khuẩn đã giảm 4,5 lần so vớilượng vi khuẩn ban đầu kiểm tra trong sữa [13]

1.2.2 Tính an toàn của Axít phenyllactic

Bên cạnh việc ứng dụng PLA như là chất kháng vi sinh vật trong thựcphẩm, gần đây PLA còn được sử dụng trong một số dược phẩm như thuốcchữa bệnh Trung Quốc có tên là “Danshensu”[30] hay sản phẩm kem chốngnhăn da [26] Hơn nữa, PLA còn được chứng minh là có ảnh hưởng có lợi đến

hệ thống miễn dịch và khả năng đẻ trứng của gà khi nó được bổ sung vào thức

ăn hàng ngày Tỷ lệ đẻ trứng của gà tăng lên, độ cứng của vỏ trứng cũng tănghơn khi bổ sung 0,3% PLA vào khẩu phần ăn hàng ngày cho gà [29] Một sốkhảo sát nghiên cứu cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc với con người vàđộng vật [24] PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượngtương đối cao [32], an toàn với môi trường

Do đó, PLA hoàn toàn được phép sử dụng trong công tác bảo quản thựcphẩm và nông sản

1.2.3 Công nghệ sản xuất PLA

Quá trình sản xuất PLA được biết đến thông qua hai con đường chính là hoá học và sinh học

1.2.3.1 Sản xuất bằng phương pháp hoá học

PLA được tổng hợp bằng con đường hoá học thông qua quá trình khửcủa kẽm và axít hydrochloric và azlactone [10] hoặc quá trình hydrogen hoádưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim của Pd-C [23] Tuy nhiên, việcsản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiện tiếnhành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng tới môitrường.

1.2.3.2 Sản xuất bằng phương pháp lên men vi sinh vật

Ngược lại với phương pháp hoá học thì quá trình sinh tổng hợp PLAbằng con đường sinh học tỏ ra có nhiều ưu điểm, bởi nó là phương pháp thânthiện với môi trường và sản phẩm tạo ra lại an toàn với người sử dụng Dovậy chúng dễ dàng được người tiêu dùng chấp nhận [9] Ở quá trình này, PLAđược sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông qua quá trình lên men trên.Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng PLA là sản phẩm cuối cùng của quá trìnhbiến đổi phenlalanine, trong đó phenylalanine chuyển hóa thành axítphenylpyruvic (PPA), rồi từ đó PLA được tạo ra nhờ sự hoạt hóa của enzymD-phenyllactic axít dehydrogenase [27] Do vậy, sản lượng PLA được tạo raphụ thuộc rất nhiều vào thành phần và điều kiện môi trường nuôi cấy củachủng vi sinh vật sinh PLA Cơ chế sinh tổng hợp PLA được minh họa ở sơ

đồ hình 2 dưới đây :

Phenylalanine Axít phenylpyruvic

Axít D-phenyllactic dehydrogenaseAxít phenyllactic

Hình 2 Cơ chế sinh tổng hợp Axít phenyllactic

Kamata cùng cộng sự đã đề cập trong Patent No.603896, về việc sử dụng

những chủng đột biến của Brevibacterium lactofermentum để sản sinh ra PLA với sản lượng đạt 1,94 g/l [18] Geotrichum candidum sinh trưởng trên môi

trường dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm men cũng được phát hiện cókhả năng sinh PLA với sản lượng là 0,6 - 1 g/l [14] Nhiều vi khuẩn thuộc

nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh PLA như Lactobacillus

plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis [28] Trong đó, có một số loài vi khuẩn thuộc nhóm

lactic có khả năng sinh PLA với hàm lượng cao Lactobacillus plantarum

được phân lập từ sản phẩm bột mỳ lên men được xác định là có khả năng sinh

PLA [Valerio F et al., 2008] Lactobacillus plantarum FST1.7 được đánh giá

là có khả năng sinh 33,47mg PLA trong 1kg bột mỳ lên men [16]

Lactobacillus sp SK007 được phân lập từ môi trường lên men rau, củ chua có

khả năng sản sinh được 2,3 g/l PLA từ môi trường nuôi cấy tối ưu gồm: 30 g/lglucose, 5 g/l axít phenylpyruvic, 47 g/l nước chiết ngô, 3 g/l K2HPO4, 3 g/l

CH3COONa, 30 g/l bột nấm men và 3 mL/l Tween-80 [30]

Với mục tiêu sản xuất PLA đạt hiệu suất cao, ngoài việc tối ưu hóa môitrường nuôi cấy vi sinh vật và lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp, thì việclựa chọn công nghệ lên men tối ưu để đạt sản lượng PLA cao đồng thời giảmthời gian cũng như giá thành sản xuất đóng vai trò hết sức quan trọng Bo

Jiang et al (2008) đã sử dụng phương pháp lên men gián đoạn 2 pha trong

tăng lên men có dung tích 1-10 lít, tốc độ cánh khuấy đạt 50-150 rpm, điềuchỉnh pH đạt 5,5-6,5, có bổ sung PPA sau 12-54 giờ lên men Kết quả sau 70-

90 giờ lên men, hàm lượng PLA tạo ra đạt 6-20g/l [31] Phương pháp lên men

gián đoạn chủng Lactobacillus sp SK007 có bổ sung dinh dưỡng là 100 g/l

PPA và 500 g/l glucose sau 2 giờ một lần và điều chỉnh pH tối ưu đạt 6.0 đểđạt được sản lượng PLA cao nhất là 17,38 g/l

Gần đây nhóm nghiên cứu ở Nhật đã phân lập được gen mã hoá cho

enzyme D-phenyllactic axít dehydrogenase (D-PLDH) từ sợi nấm Mycelia

sterilia Đây là enzyme có khả năng chuyển hoá trực tiếp PPA thành PLA.

Trong quá trình này, enzym tác động lên PPA và khử nó để chuyển hoá thànhPLA PLA và đồng đẳng của nó như: axít p- aminophenyllactic, axít p-nitrophenyllactic và axít p- hydroxyphenyllactic có thể được tạo ra nhờ quátrình biến đổi của cơ chất Để nâng cao sản lượng PLA, nhóm tác giả đã sản

xuất enzyme D-PLDH tái tổ hợp từ chủng E coli và sử dụng enzyme này cho

chuyển hoá PPA và cũng thu được kết quả rất khả quan [27]

1.3 Thực trạng nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng axít phenyllactic để bảo quản nông sản ở Việt Nam

Năm 2008, Bộ môn nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện

Cơ điện nông nghiệp & Công nghệ sau thu hoạch, Bộ Nông nghiệp và pháttriển nông thôn đã bước đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩnlactic có khả năng sinh PLA từ một số mẫu nước dưa, nước cà muối chua vàbột bánh mỳ Kết quả đã tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn lactic có khả

năng sinh PLA Thời gian lên men tối thích cho sự tạo PLA cao là 90 giờ, ở

320C bằng phương pháp lên men tĩnh Nhưng do điều kiện còn nhiều hạn chế,hiệu suất sinh PLA của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được chưa cao, côngnghệ lên men và thu hồi sản phẩm chưa được nghiên cứu hoàn thiện, Vìvậy, nhóm nghiên cứu mới dừng ở nghiên cứu công nghệ lên men yếm khí

chủng Lactobacillus sp phân lập được, mà chưa có điều kiện nghiên cứu sâu

về các yếu tố khác của công nghệ lên men trong sản xuất PLA Vì những lý

do trên, nên sản lượng PLA của các chủng phân lập trên còn rất thấp (đạtkhoảng 0,46g PLA thô/l), hàm lượng của PLA trong dịch lên men rất thấp

PLA đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và ứngdụng bảo quản nhiều loại thực phẩm để ngăn ngừa các vi sinh vật gây ngộ độcthực phẩm ở người Ở Việt Nam, sản phẩm này hoàn toàn mới chưa có trênthị trường, việc nhập khẩu sản phẩm này đòi hỏi chi phí rất cao, hơn 40000USD/kg PLA tinh khiết [36] Do đó, việc chủ động sản xuất PLA trong nước

là rất cần thiết

1.4 Vi sinh vật sinh tổng hợp axít phenyllactic

1.4.1 Phân loại vi khuẩn lactic

Các chủng thuộc loài vi khuẩn lactic đều là các loài ưu nhiệt, chúng hôhấp yếm khí hoặc vi hiếu khí, phần lớn chúng đều thuộc họ lactobacillaceae

và chúng được xếp vào 4 chi là: Streptococus, pediococus, lactobacillus và

leuconostoc [1].

Một số giống vi khuẩn lactic thường gặp là:

Lactobacillus: Giống lactobacillus bao gồm 52 loài trực khuẩn phổ

biến nhất, hình dạng tế bào của chúng có thể thay đổi từ hình bầu dục cho đến

hình que dài, như loài lactobacillus plantarum tế bào hình que, kích thước

(0,7 – 1,0)x(3,0 – 8,0) µm xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ.

Streptococus: Tế bào có hình tròn hoặc hình ôvan, đường kính 0,5 –

1,0 µm, tế bào thường tạo chuỗi dài hoặc xếp đôi, ít khi đứng đơn lẻ

Leuconostoc: Có hình hơi dài hoặc hình ôvan, đường kính khoảng (0,5

– 0,8) µm và chiều dài khoảng 1,6 µm, nhưng đôi khi chúng lại có dạng hơitròn, xếp thành một chuỗi

Pediococus: Có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, kết đôi hay kết

chuỗi hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn [7]

Vi sinh vật sinh tổng hợp axít phenyllactic

Nhiều vi khuẩn thuộc nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh

PLA như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus

rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis [29].

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được xếp vào họ Lactobacteriaceae, thuộc chi Lactobacillus Chi Lactobacillus là vi khuẩn lactic hiếu khí hoặc vi

hiếu khí Chúng là loại vi khuẩn lành, là cư dân phổ biến ở trên và trong cơthể con người, động vật Chúng hiện diện ở miệng, dạ dày và đặc biệt là ở hệ

đường ruột Ngoài ra người ta còn thấy Lactobacillus ở các sản phẩm như

sữa, bơ, xác động thực vật phân hủy [19]

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có bề mặt khuẩn lạc rộng 0,9 

1,2μm, dài 3 m, dài 3  8μm, dài 3 m, khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa đôi khi có màu vàngnhạt hoặc vàng thẫm, là vi khuẩn vi hiếu khí, sinh trưởng ở 15oC, nhìn chungkhông sinh trưởng ở 45oC, tối ưu ở nhiệt độ 30  450C, tế bào có dạng hìnhque, bắt màu gram dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử,phản ứng catalase âm tính Có khả năng đồng hoá cacbonhydrat amygdalin,arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol,

melezitoza, saccaroza, nhưng không sử dụng sorbitoi Chủng Lactobacillus có

khả năng sinh bacterioxin II, PLA, 4-hydroxy phenyllactic axít và có khảnăng sinh protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10 - 30 KDa [19].

Lactobacillus plantarum được phân lập từ sản phẩm sữa, rau lên men, cỏ

lên men, rau dưa, thức ăn ủ chua, sản phẩm cà chua bị lên men, bột chua,miệng, đường ruột [19]

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của Lactobacillus plantarum và khả năng sinh axít phenyllactic của chúng

Để tổng hợp và thu nhận PLA từ Lactobacillus plantarum, người ta sử

dụng phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn với thành phần môi trường vàđiều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận PLA đạt hiệu suất cao nhất Thànhphần môi trường là nhân tố quyết định tới quá trình sinh trưởng và phát triển

của Lactobacillus plantarum cũng như hiệu suất sinh PLA Thành phần dinh

dưỡng bao gồm các yếu tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng…vàthành phần môi trường như ảnh hưởng của pH, thời gian lên men, chế độthông khí

1.4.2.1 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng

Các chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật là bất kỳ chất nào vi sinh vậthấp thụ từ môi trường xung quanh, được chúng sử dụng làm nguyên liệu đểcung cấp cho các quá trình sinh tổng hợp, tạo ra các thành phần của tế bàohoặc để cung cấp cho các quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng

Lactobacillus plantarum đòi hỏi môi trường dinh dưỡng tổng hợp chứa

hydratcarbon, axít amin, peptide, vitamin, chất khoáng,… cho quá trình pháttriển sinh khối và tổng hợp PLA [2]

a Nhu cầu về nguồn dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại nguồn carbon khác nhau để đápứng nhu cầu dinh dưỡng carbon của chúng như: hexose (glucose, fructose,manose, galactose), các đường đôi (saccharose, lactose, maltose) và cả các

polysaccharide (tinh bột, dextrin) Nguồn carbon quan trọng nhất đối với vikhuẩn vẫn là monosaccharide và disaccharide Nguồn thức ăn này được sửdụng để cung cấp năng lượng, nguyên liệu để xây dựng cấu trúc tế bào và đểsinh tổng hợp các axít hữu cơ [7]

Vì vậy, những hợp chất carbon có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng của

vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn Lactobacillus plantarum nói riêng.

b Nhu cầu dinh dưỡng về nguồn nitrogen

Phần lớn vi khuẩn lactic đều là các vi khuẩn dị dưỡng nitơ, vì vậy để đảmbảo cho quá trình phát triển và sinh tổng hợp axít hữu cơ được dễ dàng chúngcần có nguồn nitơ sẵn có trong môi trường Hơn nữa, chỉ có một số ít loài vikhuẩn lactic có khả năng sử dụng nguồn nitơ vô cơ nên việc cung cấp nguồnnitơ hữu cơ vào môi trường lên men là rất cần thiết

Nguồn cung cấp dinh dưỡng nitơ là các axít amine, trong quá trình nuôicấy con người sẽ bổ sung các nguồn chứa nitrogen như: Cao nấm mem, caothịt, pepton, cao ngô, casein,…Nhưng trong môi trường chứa quá nhiều cácaxít amin và protein thì nó sẽ ức chế sự trao đổi chất của vi khuẩn do các hợpchất này tạo thành hệ keo bám trên bề mặt tế bào, làm giảm trao đổi chất của

tế bào với môi trường dinh dưỡng [7]

c Vitamin

Hầu hết các vi khuẩn thuộc nhóm lactic không tự tổng hợp được cácvitamin, trong khi vai trò của các nhóm này đối với chúng lại rất có ý nghĩa,Cũng như đối với các vi sinh vật khác, vitamin đóng vai trò là coenzyme củacác enzyme, các vitamin vừa kích thích sự phát triển, vừa điều hòa quá trìnhcân bằng năng lượng của cơ thể Chính vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi

khuẩn lactobacillus plantarum nói riêng vi khuẩn lactic nói chung người ta

phải bổ sung nguồn cơ chất chứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, càrốt, cao nấm men [7]

Nhu cầu về vitamin còn phụ thuộc nhiều vào môi trường và điều kiện nuôicấy Các yếu tố có tác động mạnh đến nhu cầu vitamin như: Nhiệt độ, pH, hàm lượng CO2 và thế oxy hóa – khử của môi trường [7].

d Các chất khoáng

Khi sử dụng các môi trường tự nhiên để nuôi cấy vi sinh vật người tathường không cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng Trong nguyên liệudùng làm các môi trường này (khoai tây, nước thịt, sữa, huyết thanh, giá đậu,pepton) thường có đủ các nguyên tố khoáng cần thiết đối với vi sinh vật.Ngược lại, khi làm các môi trường tổng hợp (sử dụng nguyên liệu là hoá chất)bắt buộc phải bổ sung đầy đủ các nguyên tố khoáng cần thiết Các nguyên tốkhoáng đòi hỏi phải cung cấp với liều lượng đủ lớn gọi là các nguyên tố đalượng Còn những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi với liều lượng rấtnhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng [2]

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ của mình, vi khuẩn

lactobacillus plantarum cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, lưu

huỳnh, kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri,…đặc biệt là mangan [2]

- Photpho (P): Chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần các nguyên tố

khoáng (50%) của tế bào vi sinh vật Photpho có mặt trong cấu tạo nhiềuthành phần quan trọng của tế bào như: axit nucleic, photphoprotein,photpholipit, coenzym (ADP, ATP,…) và một số vitamin: Biotin, tiamin.Người ta thường bổ sung photphat vô cơ vào môi trường, ngoài tác dụng làmđệm pH để ổn định pH của môi trường Nồng độ P cao sẽ kích thích hìnhthành ATP và cung cấp năng lượng cho tế bào, giúp tế bào sinh trưởng vàphát triển tốt hơn [2]

- Lưu huỳnh (S): Lưu huỳnh cũng là nguyên tố khoáng quan trọng trong

tế bào vi sinh vật Lưu huỳnh có mặt trong một số axit amin: xixtin,methionin và một số vitamin: biotin,…S là nguyên liệu xây dựng lên cấu trúc

của protein và là nguyên liệu có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyểnđiện tử của quá trình oxi hoá Các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh ở dạngoxi hoá thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật Trong khi đó cácmuối sunphat vô cơ với nguyên tử lưu huỳnh cũng ở trạng thái oxi hoá thì lạiđược vi sinh vật đồng hoá rất tốt [2].

Đối với vi khuẩn Lactobacillus plantarum sử dụng muối MgSO4 vàMnSO4 là nguồn cung cấp S cũng như nguồn cung cấp Mn, Mg

- Magie (Mg): Mg tham gia vào nhiều phản ứng enzym có liên quan đến

các quá trình photphoryl hoá Mg có thể làm hoạt hoá hexokinaza, ATP – aza,pirophotphat, photphopheraza, transaxetilaza, photphoglucomutaza,cacboxilaza, các enzim trao đổi protein, các enzim oxi hoá khử của chu trìnhKrebs Mg2+ còn có vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phầnriboxom với nhau [2]

- Canxi (Ca): Ca là nguyên tố ít tham gia vào việc xây dựng nên các hợp

chất hữu cơ, nhưng nó có vai trò đáng kể trong việc xây dựng các cấu trúctinh vi của tế bào Ca đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phầnquan trọng của tế bào sống như: AND và protein trong nhân đối với việc hìnhthành cấu trúc không gian ổn định của nhiều bào quan như riboxom, ti thể,nhân [2]

- Kẽm (Zn): Zn tham gia vào nhiều quá trình Kẽm có tác dụng đáng kể

trong việc hoạt hoá các enzim như: anolaza, photphataza kiềm [2]

- Sắt (Fe): Fe là nguyên tố cần thiết để vi sinh vật tổng hợp một số men

loại pocphirin chứa Fe: xitocrom, catalaza, peroxidaza [2]

- Mangan (Mn): Mn có chứa trong một số enzimi hô hấp, có vai trò quan

trọng trong việc hoạt hoá một số enzim như photphomonoesteraza,cacboxylaza, ATP – aza, hydroxylamine reductaza,… Ngoài ra Mn còn ngăncản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình

thường của vi khuẩn Chính vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn này,người ta thường bổ sung thêm muối MnSO4[2].

Tuy nhiên, sự tồn tại một cách dư thừa các nguyên tố khoáng là không cầnthiết và có thể dẫn đến những ảnh hưởng xấu Chẳng hạn như việc dư thừaphotphore có thể làm giảm hiệu suất tích luỹ một số chất kháng sinh, thừa sắt

sẽ cản trở quá trình tích lũy vitamin B2 hoặc vitamin B12 [2]

Vi khuẩn Lactobacollus plantarum cần một nhu cầu rất lớn về các hợp

chất hữu cơ cho sự phát triển của chúng Có thể nói axít axetic và axít xitric

có tác động thuận lợi đến tốc độ phát triển của vi khuẩn Lactobacillus

plantarum Đó cũng là lý do mà trong môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo

quản các loại vi khuẩn lactic nói chung và vi khuẩn Lactobacillus plantarum

nói riêng thường có mặt của các muối acetate và citrate

Một loại axit hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng củahầu hết các vi khuẩn lactic là axít oleic, axít linoleic, hoặc axít linolenic Do

đó, trong môi trường phân lập và nuôi cấy, người ta thường sử dụng

Tween-80, một dẫn xuất của axít oleic để tăng cường các axít béo không no cho sựphát triển của nhóm vi khuẩn này [30]

1.4.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sinh trưởng và khả năng sinh

tổng hợp axít phenyllactic của vi khuẩn lactobacillus plantarum.

- Ảnh hưởng của pH.

Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động rất mạnh của pH môitrường lên men Độ pH của môi trường tác động đến quá trình trao đổi chấtcủa tế bào, đặc biệt là tác động đến hệ ezim của chúng, mỗi ezim đều có mộtdải pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzim là cao nhất [2]

Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn Lactobacillus plantarum có thể bị

ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Chính vì vậy, điều chỉnh pH tối ưu đểthu được lượng PLA cao nhất là rất cần thiết Có rất nhiều nhà khoa học đã

nghiên cứu cho rằng Lactobacillus plantarum sinh PLA cao nhất khi pH = 6,0

đến 6,5 [30]

- Ảnh hưởng của chế độ thông khí.

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum là vi khuẩn có thể sống ở điều kiện môi

trường yếm khí đến hiếu khí, đó là chúng không có hệ enzimi oxy hóa – khửxitocrom và catalase trong tế bào Tuy nhiên, vi khuẩn lactic vẫn có thể oxyhóa một số chất theo cách sử dụng oxy phân tử vì chúng có hệ enzim oxy hóaFAD (Flavin Adenin Dinucleotid), hệ enzim peroxydase nội bào, có thể thựchiện các chức năng thay cho hệ enzim dehydrogenase để vận chuyển H+, khi

đó oxy được sử dụng là chất nhận điện tử Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lacticxảy ra thường kèm theo hình thành H2O2 Tuy nhiên, ảnh hưởng của hàmlượng oxy còn phụ thuộc vào điều kiện khác của môi trường như nhiệt độ [7]

Do đó, khi nuôi cấy khối lượng lớn vi sinh vật phải nuôi cấy trên máy lắchoặc phải thổi không khí vô khuẩn vào bình (hay nồi) nuôi cấy

Việc xác định nhu cầu oxy của Lactobacillus plantarum trong từng giai

đoạn là một trong những cơ sở để đưa ra giải pháp công nghệ cho quá trìnhlên men ở quy mô công nghiệp

- Ảnh hưởng của nhiệt độ.

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của vi sinh vật, do tốc độphản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ Tốc độ phản ứng hóa sinh, hoạt lực ezim,tốc độ của quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào nhiệt độ

Mỗi loài vi sinh vật thích hợp phát triển ở dải nhiệt độ khác nhau Đã có

nhiều nhà khoa học nghiên cứu cho rằng vi khuẩn Lactobacillus plantarum có

thể phát triển trong dải nhiệt độ từ 30 - 450C Nhưng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển là 300C Nếu nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng kém, tốn thời gian Nếu nhiệt độ quá cao trên 450C thì vi khuẩn sẽ bị chết [11].

- Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu.

Do màng tế bào của vi khuẩn có tính bán thấm, hoạt động trao đổi chất của

tế bào phụ thuộc vào hệ enzyme pecmerase nằm trên màng tế bào và áp suấtthẩm thấu của từng cơ chất có trong môi trường Áp suất thẩm thấu của môitrường tỷ lệ với nồng độ chất khô hòa tan trong môi trường Khi hàm lượng

NaCl > 5% thì vi khuẩn Lactobacillus plantarum không phát triển [7].

- Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sự tích lũy hàm lượng PLA trong môi trường.

PLA là một axít và khi nó được sinh ra trong điều kiện lên men nó sẽ làmgiảm pH của môi trường Do đó, thời gian lên men là một yếu tố rất quantrọng để PLA thu được với hiệu suất cao nhất Nếu thời gian ngắn có thể sinh

khối Lactobacillus plantarum tạo ra ít, PLA chưa được tạo ra, còn nếu thời

gian quá dài thì lượng dinh dưỡng của môi trường giảm, không đủ thức ăncho vi khuẩn, vi khuẩn sẽ chết, đồng thời pH giảm mạnh sẽ ức chế vi khuẩnhoạt động, gây tốn kém Như những phân tích trên việc tối ưu hoá thời gianlên men là rất cần thiết Theo những nghiên cứu mới đây, PLA tạo ra đạt năngsuất cao khi thời gian lên men kéo dài từ 24 – 72h [30], [33]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu.

2.1.1 Nguyên liệu

* Nguyên liệu chính

- Các mẫu nước dưa, nước cà muối chua thu thập tại các chợ trên địabàn Hà Nội (chợ Hà Đông, chợ Trâu Quỳ, chợ Sinh Viên, Chợ Long Biên,chợ Hôm, chợ Hàng Bè) Các mẫu đưa về phòng thí nghiệm được phân lậpngay, nếu chưa phân lập được ngay mẫu được đưa vào tủ lạnh bảo quản ở

50C

- Một số chủng nấm mốc thử nghiệm Aspergillus niger, Aspergillus

flavus, Penicillium digitatum thu thập từ bộ chủng giống vi sinh vật của bộ

môn nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nôngnghiệp và CNSTH

- Một số chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột (E.coli, S.aureus) thử

nghiệm được thu thập từ bộ chủng giống của Khoa vi khuẩn, Viện Vệ sinhdịch tễ Trung ương

* Môi trường

a Môi trường phân lập (ký hiệu là MT1)

Môi trường phân lập vi khuẩn Lactobacillus plantarum được lựa chọn

là môi trường MRS (Man – Rogosa – Sharpe), gồm: 20g Glucose, 10gPepton, 10g Cao thịt, 5g Cao nấm men, 2g (NH4)3 C6H5O7, 2g K2HPO4, 5g

CH3COONa, 0,58g MgSO4.7H2O, 0,95g MnSO4.4H2O, 1ml Tween80, 20gagar

Các hóa chất được cân chính xác rồi phối trộn theo tỷ lệ trên vào nướccất sao cho đủ 1000ml môi trường, khuấy đều cho tan hết hóa chất, điều chỉnh

pH = 6,5 sau đó đổ vào bình tam giác (200ml/bình), đem hấp tiệt trùng ở

1210C trong thời gian 20 phút

b Môi trường lên men (ký hiệu là MT2)

Môi trường lên men sử dụng là môi trường MRS lỏng Thành phần:

20g Glucose, 10g Pepton, 10g Cao thịt, 5g Cao nấm men, 2g (NH4)3C6H5O7,2g K2HPO4, 5g CH3COONa, 0,58g MgSO4.7H2O, 0,95g MnSO4 4H2O, 1mlTween80

Các hóa chất được cân chính xác rồi phối trộn theo tỷ lệ trên vào nướccất sao cho đủ 1000ml môi trường, khuấy đều cho tan hết hóa chất, điều chỉnh

pH = 6,0 sau đó đổ vào bình tam giác (200ml/bình), đem hấp tiệt trùng ở

1210C trong thời gian 20 phút

c Môi trường giữ giống: Môi trường giữ giống vi khuẩn Lactobacillus

plantarum chúng tôi sử dụng là môi trường MT1

d Môi trường hoạt hóa giống: Môi trường hoạt hóa vi khuẩn

Lactobacillus plantarum chúng tôi sử dụng là môi trường MT2

e Môi trường nuôi cấy nấm mốc, nuôi cấy vi khuẩn

+ Môi trường PDA có thành phần (g/l): Glucoza 20; khoai tây 200; agar 20+ Môi trường thạch thường (g/l): Pepton 10; NaCl 5, nước chiết thịt 125ml; glucoza 1; thạch 20; nước 1 lít

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất dùng trong thí nghiệm thuộc bộ môn Công nghệ sinh học sauthu hoạch, Viện cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đạt tiêuchuẩn chất lượng gồm có: Pepton, Cao nấm men, CaCO3, K2HPO4.3H2O,(NH4)3C6H5O7, CH3COONa, Nước chiết thịt, Tween 80, MgSO4.7H2O, Agar,MnSO4.4H2O, KOH, Fucsin kiềm, NaOH, tinh thể Phenolphtalein, H3PO4,Glucose, Cao thịt, MgCl2, C4H9OH, axit phenylpyruvic, H2SO4, Etyl axetat,

Ete, Cloroform, cồn 750, 960, Butanol, Metanol, Ca(OH)2 0,1N, Etanol,NaHSO3, giấy đo pH,…

Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh: Hộp petri, ống nghiệm, pipet,

que cấy, que trang, đèn cồn, bình tam giác, ống đong, giấy thấm, giấy lọc,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp thu thập mẫu

Mục đích: Thu thập các chủng vi khuẩn thuộc nhóm lactic sinh PLA

hiệu suất cao có trong nước dưa, nước cà muối chua

Phương pháp tiến hành: Lấy ngẫu nhiên các mẫu nước dưa, cà muối

chua thuộc 6 chợ trên địa bàn Hà Nội (Chợ Hà Đông, chợ Trâu Quỳ, chợ SinhViên, chợ Long Biên, chợ Hôm, chợ Hàng Bè) Mỗi mẫu khoảng 100ml vàotúi nilon, các mẫu được dánh dấu theo địa điểm và ngày lấy mẫu Mẫu đượcđưa về phòng thí nghiệm của bộ môn nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu

hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH để tiến hành phân lập ngay, nếuchưa phân lập mẫu sẽ được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C.

2.2.1.2 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn [26]

- Mục đích: Tuyển chọn và đưa các chủng vi khuẩn về dạng thuần

450C rồi đổ vào các hộp lồng gọi là các đĩa thạch

- Phương pháp tiến hành:

+ Lấy 1ml nước dưa hoặc nước cà muối chua cho vào ống nghiệm chứa9ml nước cất đã vô trùng, lắc đều bằng máy voltex với tốc độ 1800v/phúttrong 5 phút, thu được dung dịch gốc có nồng độ pha loãng 10-1

+ Hút 1ml dung dịch gốc cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vôtrùng, lắc đều 1800v/phút trong 5 phút bằng máy voltex, thu được dung dịch

có nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục lấy 1ml ở ống nghiệm có nồng độ 10-2 chovào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng tiếp theo ta được dung dịch cónồng độ pha loãng 10-3 Cứ tiếp tục như vậy ta thu được dung dịch có nồng độ

10-4

+ Tiến hành phân lập: Dùng pipet hút lấy 10µl dịch pha loãng ở nồng

độ 10-4 nhỏ lên bề mặt môi trường MT1 đã được vô trùng trong đĩa petri.Dùng que gạt trang đều trên môi trường cho đến khô, sau đó gói báo và đặtvào trong tủ nuôi ở nhiệt độ 300C trong thời gian 48 giờ Mỗi mẫu 3 lần lặplại

+ Sau 48 giờ nuôi, chọn các đĩa mà khuẩn lạc mọc độc lập, riêng rẽ,mật độ không quá dày để phân lập tiếp tục đến khi thu được chủng thuầnkhiết Mọi thao tác được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

2.2.1.3 Phương pháp làm tiêu bản quan sát hình thái vi khuẩn Lactobacillus plantarum qua kính hiển vi

Phương pháp nhuộm Gram [3]

- Nhỏ 1 giọt ung dịch lên men có chứa tế bào cần quan sát lên phiếnkính

- Cố định tiêu bản lên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc nhuộm tím getian lên trong 1 phút, rửa nước

- Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch lugon lên trong 1 phút

- Tẩy màu bằng cồn 90o đến khi bạc màu, rửa qua nước

- Nhỏ thuốc nhuộm Fucsin kiềm pha loãng 10-1 trong 1 phút

- Rửa qua nước thấm qua giấy hoặc để khô ở trong không khí

- Quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lầnQuan sát hình thái tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử: Vi khuẩngram dương bắt màu tím, vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ Do vi khuẩn thuộcloại gram dương có protein kiểu magie ribonucleic, chất này khi gặp thuốcmàu thuộc loại parasonilic (như tím gentian) và iot thì kết lại thành một hợpchất không bị phá hủy bởi cồn để tẩy màu Do đó những vi khuẩn gramdương không bị ảnh hưởng

2.2.1.4 Xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng phân lập được

Xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn có khả năng sinhtổng hợp PLA và định loại chủng vi khuẩn dựa theo khóa phân loại củaBergey’s [8]

* Xác định khả năng di động của vi khuẩn [17]

- Mục đích: Khảo sát khả năng di động hay không di động của vi khuẩn

phân lập được

- Chuẩn bị: Nấu môi trường MT1 rồi đổ vào các ống nghiệm ( thể tích

môi trường thạch chiếm 1/4 thể tích ống nghiêm) sau đó đem đi hấp ở 1210C,

để nguội để làm môi trường thạch đứng

- Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy thẳng theo một đường trong môitrường MT1 thạch đứng, sau khi cấy xong đem đi nuôi trong tủ ấm ở 30oCtrong 48 giờ Sau 48h kiểm tra kết quả, nếu vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấychứng tỏ vi khuẩn không có khả năng di động Nếu vi khuẩn mọc lan ra xungquanh đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có khả năng di động

* Xác định hoạt tính catalaza [17]

- Mục đích: Khảo sát khả năng năng sinh catalase của chủng vi khuẩn

phân lập được nhờ khả năng phân hủy H2O2

- Chuẩn bị: Nấu môi trường MT1 rồi đổ vào các ống nghiệm (thể tích

môi trường thạch chiếm 1/4 thể tích ống nghiêm) sau đó đem đi hấp ở 1210C,

để nguội để làm môi trường thạch nghiêng Pha loãng catalase ở nồng độ 3%

- Cơ sở khoa học Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh

catalase, catalaza sẽ phân hủy H2O2 giải phóng oxy, oxy là chất nhận điện tửcuối cùng

- Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Chủng vi khuẩn phân lập được sẽ được nuôi trên ống thạch nghiêngMT1 ở 300C trong 48h Mẫu thí nghiệm được nhỏ 2ml H2O2 3% lên bề mặtcủa ống, mẫu đối chứng không bổ sung H2O2 3% Đem các mẫu đi nuôi ở

30oC trong 48 giờ Sau 48h kiểm tra kết quả Nếu mẫu thí nghiệm xuất hiệncác bọt khí thì kết luận chủng vi khuẩn nghiên cứu đã sinh catalaza, nếukhông xuất hiện bọt khí thì chủng đó không sinh catalaza

* Xác định khả năng sinh khí CO 2 của vi khuẩn [17]

- Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Nấu môi trường MT2, sau khi nấu xong đổ vào các ống nghiệm sao chothể tích môi trường chiếm 1/2 ống nghiệm Cho ống Durham vào ống nghiệmchứa môi trường MT2 (miệng của ống durham hướng xuống đáy của ốngnghiệm – tư thế úp ngược), sau đó đem đi tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút

Để nguội sau đó cấy chủng vi khuẩn cần khảo sát vào ống nghiệm và nuôi ở

30oC trong 48 giờ Sau 48 giờ kiểm tra kết quả, nếu ống nghiệm Durham nổilên trên bề mặt môi trường thì chứng tỏ vi khuẩn đã sinh khí CO2 Nếu ốngDurham chìm trong môi trường chứng tỏ vi khuẩn không sinh khí

2.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh axít phenyllactic của chủng C2 [31]

Mục đích: Lựa chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh tổng hợp PLA

của chủng C2

Theo nghiên cứu của Wanmeng Mu (2009) bổ sung phenylpyruvic vào môitrường lên men vi khuẩn làm tăng sản lượng PLA sau quá trình lên men Chính vì

vậy chúng tôi tiến hành lên men chủng Lactobacillus plantarum C2 trên môi trường

MT2 có bổ sung PPA ở các hàm lượng khác nhau

Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Nấu môi trường MT2, sau khi nấu xong đong chính xác 200ml môitrường MT2 vào bình tam giác 500ml, khử trùng ở 121oC; trong thời gian 20

phút Cấy chủng Lactobacillus plantarum C2 với tỷ lệ giống 10% vào môi

trường Nuôi trong tủ lắc 200v/phút; duy trì nhiệt độ lên men ở 30oC; pH banđầu là 6,5, sau thời gian lên men 48 giờ xác định hàm lượng PLA sinh ra bằngsắc ký cao áp (HPLC)

Bố trí thí nghiệm:

- Công thức đối chứng (CT0) : MT2

- Công thức thí nghiệm:

CT1: MT2 + 0,05% PLACT2: MT2 + 0,10% PLACT3: MT2 + 0,15% PLACT4: MT2 + 0,20% PLACT5: MT2 + 0,25% PLA CT6: MT2 + 0,30% PLAThí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.2.1.6 Nghiên cứu thời gian lên men để thu hồi axít phenyllactic cao nhất đối với chủng C2

Mục đích: Xác định khoảng thời gian thích hợp nhất cho quá trình lên mem thu hồi

PLA của chủng C2

Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Nấu môi trường MT2 rồi đổ vào các bình tam giác 500ml (mỗi bình 200mlmôi trường) thanh trùng 121oC trong 20 phút Sau khi thanh trùng xong để

nguội bổ sung PLA 0,10% vào bình tam giác đó Cấy chủng C2 với tỷ lệ

giống 10% cho vào môi trường, lắc đều 200v/phút, ở 30oC Đánh giá khả

năng sinh tổng hợp PLA của chủng L plantarum C2 từ 24 - 96 giờ, cứ 4 giờ

lấy mẫu một lần xác định hàm lượng PLA theo phương pháp sắc ký cao áp(HPLC) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.2.1.7 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện của pH ban đầu trong quá trình lên men đến khả năng sinh tổng hợp axít phenyllactic của chủng L plantarum C2 [31]

- Mục đích: Kiểm định để tìm ra pH ban đầu thích hợp nhất cho quá

trình trình lên men sinh PLA của chủng C2

- Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Nấu môi trường MT2, đong chính xác 200ml môi trường MT2 + 0,10%PPA đã điều chỉnh pH ở các giá trị khác nhau bằng NaOH hoặc axít lacticvàobình tam giác 500 ml, thanh trùng 121oC trong 20 phút.

Để nguội và cấy chủng L plantarum C2 với tỷ lệ giống 10%, cho vào

tủ lắc, lắc đều trên máy lắc 210 vòng/phút trong tủ ấm 30oC Sau 48h xác

định hàm lượng PLA trong dịch lên men của chủng L plantarum C2 ở các thí

nghiệm bằng sắc ký cao áp (HPLC)

- Công thức thí nghiệm:

CT1: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 5,0CT2: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 5,5CT3: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,0CT4: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,5CT5: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 7,0Mỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.2.1.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men đến khả năng sinh tổng hợp axít phenyllactic của chủng L plantarum C2 [31]

Mục tiêu: Kiểm định để tìm ra nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men

thu hồi PLA của chủng C2

Phương pháp tiến hành thí nghiệm:

Nấu môi trường MT2, đong chính xác 200 ml môi trường MT2 +0,10% PPA, pH: 6,5 cho vào bình tam giác 500 ml, thanh trùng 121oC trong

20 phút Cấy chủng L plantarum C2 với tỷ lệ giống 10% cho vào môi trường,

lắc đều 210v/p và lên men ở các nhiệt độ khác nhau Sau 48 giờ xác định hàm

lượng PLA của chủng L plantarum C2 bằng phương pháp sắc ký cao áp

(HPLC)

CT1: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,5, nhiệt độ lên men 26 oCCT2: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,5, nhiệt độ lên men 28 oC

CT3: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,5, nhiệt độ lên men 30 oCCT4: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,5, nhiệt độ lên men 32 oCCT5: MT2 + 0,10% PLA, pH ban đầu: 6,5, nhiệt độ lên men 34 oCMỗi công thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.2.1.9 Định loại vi khuẩn bằng kĩ thuật PCR[6],[15]

( Nội dung này do nhóm nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản

xuất chế phẩm Phenyllactic acid từ vi khuẩn lactic phục vụ bảo quản nông sản và thực phẩm ” Viện cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch

phối hợp với viên Công nghệ sinh học thực hiện)

Mục đích: Xác định trình tự nu thuộc gen 16S riboxom của chủng vi

khuẩn để định loại chính xác chủng đã chọn được

Phương pháp tách dòng và đọc trình tự gen 16S riboxom:

Tách triết AND tổng số

Nhân bản gen 16s bằng phản ứng PCR

Cặp mồi sử dụng: - Kh 16Sp1: 5′- AGAGTTTGACATGGCTCA - 3′

- Kh 16Sp2: 5′- AAGGAGGTGATCCAGCC - 3′

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR bao gồm các bước sau: 940C – 3 phút,

940C– 1 phút, 550C – 1 phút, 720C – 1 phút 20 giây, 30 chu kỳ (từ bước 2 đếnbước 4), 720C – 8 phút, kết thúc ở 40C

Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động

Trình tự ADN được xác định theo phương pháp của Sanger & đồng tácgiả [5], trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI prism 3100 Sequencer(Applied Biosystems) với bộ kit xác định trình tự BigDye Terminater v3.1Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems

2.1.1.10 Phương pháp xác định khả năng kháng vi sinh vật

Khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm được xác định theo phươngpháp đổ đĩa thạch và khuếch tán đĩa thạch được mô tả bởi Magnusson vàSchnurer (2001)

- Dịch lên men được cô đặc bằng phương pháp đông khô, sau đó đượcpha loãng ở các nồng độ khác nhau để thử ức chế các chủng nấm mốc,cácchủng vi khuẩn gây bệnh

a Với nấm mốc.

Nấu môi trường PDA đặc, khi nấu xong đong 200ml đổ vào bình tamgiác 500ml, đem khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút, để nguội 450C đổvào các hộp petri vô trùng, khi thạch đặc, tiến hành đục 2 giếng thạch trong 1hộp petri đường kính giếng thạch 11mm, các giếng thạch cách nhau 2,5cm.Cấy chấm điểm các chủng nẩm mốc trên bề mặt môi trường thạch, sau đó hút200µl dịch lên men đã cô đặc bằng phương pháp đông khô nhỏ vào giếngthạch đánh số 1, giếng còn lại đánh số 2 được nhỏ bằng nước cất vô trùng.Đem đi nuôi cấy ở 300C Sau 24, 48, 72 giờ kiểm tra sự phát triển của nấmmốc thử nghiệm Mỗi công thức bố trí lặp lại 3 lần

b Với vi khuẩn gây bệnh

Nấu môi trường thạch thường đặc, đong chính xác 30ml vào các bìnhtam giác nhỏ, đem khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút, để nguội 300C(sao cho thạch chưa đông đặc, nhưng không quá nóng để không giết chết vikhuẩn) Hút 1ml dịch lên men vi khuẩn cần ức chế, mật độ 104 tế bào/ml đổvào bình tam giác chứa sẵn môi trường thạch thường đã chuẩn bị ở trên, lắcđều sau đó đổ vào các hộp petri vô trùng Đục 2 giếng thạch trong 1 hộp petriđường kính 11mm sau đó hút 200 µl dịch lên men chủng C2 đã cô đặc bằngphương pháp đông khô nhỏ vào giếng thạch, giếng thạch 2 được nhỏ bằng

nước cất vô trùng Đem đi nuôi cấy ở 300C Sau 24, 48, 72 giờ kiểm tra sựphát triển của chủng.

- Công thức thí nghiệm:

CT1: 30ml thạch thường + 1ml dịch lên men E coli mật độ 104 tế bào/ml

CT2: 30ml thạch thường + 1ml dịch lên men S aureus mật độ 104 tế bào/mlMỗi công thức bố trí lặp lại 3 lần

2.2.2 Phương pháp hóa lý

Xác định axít sinh ra trong quá trình lên men của chủng nghiên cứu 2.2.2.1 Định tính axít bằng phương pháp đo vòng phân giải CaCO 3

trên môi trường đĩa thạch [17]

Mục đích: Khảo sát khả năng sinh axít tổng số của các chủng nghiên

cứu Khả năng sinh axít của chủng vi khuẩn phân lập được xác định gián tiếpbằng đường kính vòng phân giải CaCO3 trên môi trường MT1

Phương pháp tiến hành thí nghiệm: Nấu môi trường MT1 có bổ sung

CaCO3, đong 200ml môi trường này cho vào các bình tam giác, đem khửtrùng ở 1210C trong thời gian 20 phút, để nguội 300C và tiến hành đổ vào cáchộp petri gọi là các đĩa thạch.Đục giếng thạch có đường kính 11mm ở chínhgiữa của đĩa petri chứa 30ml MT1 có bổ sung CaCO3 Hút 200µl dịch lên men(dịch lên men được lên men trong điều kiện 300C, trong 48 giờ, pH ban dầu6,5, bổ sung 0,10% PPA, đã gia nhiệt diệt tế bào) nhỏ vào giếng thạch Sau đógói báo và để ở 300C trong điều kiện vô trùng Sau 48 giờ tiến hành quan sát,nếu thấy vòng phân giải có màu trongxuất hiện xung quanh lỗ thạch thì chủng

đó có khả năng sinh axít Đường kính vòng phân giải (D – d) lớn hay nhỏ thểhiện khả năng sinh axít mạnh hay yếu của vi khuẩn

2.2.2.2 Định lượng tương đối hàm lượng axít phenyllactic bằng phương pháp chuẩn độ NaOH 0.1N [19]

- Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh PLA của các chủng nghiên cứu

- Phương pháp tiến hành thí nghiệm: