biến nạp
Các tế bào E. coli được phát triển ở pha log. Tế bào thu được bằng cách li tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả nạp). Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 5 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC.
- Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0.375 (không được để OD590 quá 0.4).
- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 5 - 10 phút.
Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3000 vòng/phút, 7 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ly tâm
2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Để trên đá trong 30 phút. Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
- Huyền phù sinh khối trong 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Bổ sung 2 ml glycerol lạnh 50% đểđạt nồng độ glycerol cuối cùng là 10%.
- Chia lượng nhỏ 100 µl vào tube 1,5 ml và làm lạnh nhanh trong ethanol 100o ở - 80oC.