[7], [32]
λ Red bao gồm các gen gam, bet và exo mã hóa cho một hệ thống tái tổ hợp tương đồng rất hiệu quả. Protein Gam có khả năng bất hoạt hoạt tính exonuclease V của RecBCD, cho phép sự biến nạp đoạn DNA dạng thẳng. Sản phẩm của gen bet
và exo giúp thúc đẩy sự tái tổ hợp ở hai vùng tương đồng ngắn. Hệ thống này rất hữu dụng trong việc bất hoạt các gen mục tiêu ở vi khuẩn Gram âm.
Dựa trên hệ thống λ Red, một phương pháp tạo đột biến đơn giản mà không cần tạo dòng đã được phát triển. Phương pháp này sử dụng hệ thống λ Red để bất
hoạt gen thông qua sự tái tổ hợp tương đồng gữa vùng gen trên nhiễm sắc thể và đoạn DNA dạng thẳng mang gen kháng kháng sinh với 2 bên là trình tự tương đồng với gen đích (Cassette).
Phương pháp đã được sử dụng thành công cho nhiều loại vi khuẩn Gram âm bao gồm: E. coli, Salmonella, Yersinia, Shigella, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas…
Tuy nhiên, độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp tương đồng là khác nhau ở các loài. E. coli chỉ cần trình tự tương đồng khoảng 50 nucleotide là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp nhưng đối với Vibrio cholerae, trình tự 100 nucleotide mới đủ để tái tổ hợp tương đồng xảy ra. Còn đối với Y. pseudotuberculosis, đoạn tương đồng ngắn thường không đủđể xảy ra sự tái tổ hợp mà cần phải có phải có đoạn tương đồng khoảng 500 nucleotide.
1.5. Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen và triển vọng làm vaccine
Hiện nay, những sản phẩm được sử dụng trong phòng chống bệnh gan thận mủ do E. ictaluri gây ra chủ yếu các loại vaccine vô hoạt. Vaccine vô hoạt là vaccine được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh, bị bất hoạt bằng nhiệt độ, áp suất hay bằng hóa chất (formalin, glutaraldehyde…), sau đó bổ sung chất bổ trợ thích hợp để gia tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Vaccine vô hoạt có ưu điểm là dễ sản xuất và an toàn khi sử dụng. Tuy nhiên, loại vaccine này lại có hiệu quả không cao [34].
Trong khi đó, vaccine nhược độc sử dụng vi khuẩn sống đã giảm hoặc không còn độc lực lại rất có hiệu quả cao trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cũng như duy trì nhớ miễn dịch. Do đó, việc nghiên cứu các chủng
E. ictaluri nhược độc để làm vaccine là một hướng có nhiều tiềm năng [34].
Phương pháp tạo vi khuẩn nhược độc đơn giản nhất là phương pháp cấy chuyền nhiều lần trong phòng thí nghiệm để làm giảm độc lực, sau đó gây nhiễm cho vật chủ. Tuy nhiên, độc lực vi khuẩn có thể phục hồi khi chúng được tăng sinh trong cơ thể vật chủ. Vì vậy, phương pháp này không an toàn và không thích hợp để áp dụng trong sản xuất vaccine [34].
Hiện nay, việc tạo chủng nhược độc thường được thực hiện theo hướng tạo ra các đột biến bằng tác nhân vật lý (nhiệt độ, tia UV), hóa học (hóa chất, kháng sinh), hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử (knockout gen).
Phương pháp knockout gen được sử dụng để bất hoạt các gen độc tính hoặc các gen cần thiết cho quá trình sinh dưỡng của vi khuẩn trong vật chủ. Các chủng này vẫn có thể kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ theo con đường gây bệnh của chủng hoang dại nhưng không đủ độc để làm chết vật chủ. Vì vậy, knockout gen là một phương pháp rất hữu dụng trong việc tạo chủng vi khuẩn đột biến nhược độc.
Đối với vi khuẩn E. ictaluri, nhiều nghiên cứu đã xác định O antigen một kháng nguyên mạnh và là một yếu tố gây độc quan trọng. E. ictaluri biểu hiện O antigen dài và chiều dài của O antigen được điều hòa bởi gen wzz. Ở các loài vi
khuẩn Gram âm khác như E. coli, Samonella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia
enterocolitica, các nhà nghiên cứu đã tạo được chủng đột biến gen wzz và cho thấy chúng có độc lực thấp hơn so với chủng hoang dại.
Từ những cơ sở trên, có thể thấy rằng việc sử dụng phương pháp knockout gen dựa trên hệ thống tái tổ hợp λ Red để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz
mang lại nhiều triển vọng cho việc tạo ra một loại vaccine sống nhược độc để phòng chống bệnh gan thận mủ cho cá tra ở Việt Nam.
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)
- Máy gel doc (Biorad)
- Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max
- Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)
- Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)
- Bộđiện di DNA Power Pac200 (Biorad)
- Máy đo quang phổ - Tủủ 37 oC - Tủủ lắc - Bểđiều nhiệt - Tủđông sâu -80 oC - Tủ lạnh -20 oC - Tủ mát 4oC - Cân phân tích - Eppendorf 1.5 ml; 0.2 ml - Cuvette 2 ml; 0,2 ml - Và các dụng cụ chuyên dùng khác 2.1.2. Hóa chất
2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid
- Bộ kít tách chiết plasmid của Qiagen
- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen
2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose
- Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen
2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn
Các enzyme cắt giới hạn được cung cấp bởi Biolab: SalI, EcoRI,
BamHI, XbaI, BglII. Các thành phần của phản ứng cắt được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi
Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành
phần phản ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR. Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng (V = 25 µl) Taq buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 25 mM 1 mM 1 l dNTPs 25 mM 0.2 mM 0,2 l Taq polymerase 5 U/l 0.04 U 0,2 l Mồi xuôi 10 mM 0.2 mM 0,5 l Mồi ngược 10 mM 0.2 mM 0,5 l H2O 19,1 l
2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA
Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck).
2.1.2.7. Thang DNA
Thang DNA được cung cấp bởi Fermentas bao gồm:
- Thang DNA 100 bp
- Thang DNA 1 kb
- Thang DNA 1 kb plus
Hình 2.1. Thang DNA
(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus
2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp biến nạp
- Glycerol 10%
- CaCl2 1M
2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp điện biến nạp biến nạp
- Glycerol 10%
- Nước cất vô trùng
2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami)
Trypton 10 g
Yeast extract 5 g
NaCl 10 g
Nước cất đủ 1000 ml
2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)
BHI (Merk) 37 g
Nước cất đủ 1000 ml
Môi trường thạch có thành phần như môi trường lỏng bổ sung thêm 1,5% agar. Các loại kháng sinh dùng để chọn lọc gồm: colistin, ampicillin, kanamycin được bổ sung vào môi trường với nồng độ cuối là 50 µg/ml. X - gal được sử dụng ở nồng độ cuối là 40 µg/ml.
2.1.4. Chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm:
- Chủng Edwardseilla ictaluri hoang dại S7
- Chủng Escherichia coli: E.coli DH5α; E. coli DH5αλpir; E. coli SM10 λpir
2.1.5. plasmid
2.1.5.1. Plasmid pKD4
- Kích thước 3267 bp.
- Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma.
- Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình
tự FRT.
Hình 2.2. Plasmid pKD4 2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300
- Kích thước 8958 bp.
- Mang gen kháng kanamycin.
- Được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin dùng trong thiết kế cassette.
2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy
- Kích thước 3015 bp.
- Có gắn thêm T ở vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu quả nối. - Mang gen kháng ampicillin và trình tự khởi đầu sao chép f1 ori. - Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α của β galactosidase giúp chọn
lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/ xanh của khuẩn lạc.
- Plasmid pGEM-T Easy được sử dụng để nhân dòng.
Hình 2.4. Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt
- Kích thước 2974 bp.
- Mang gen kháng ampicillin giúp cho sự chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid.
- Mang gen gây độc eco47IR giúp cho sự chọn lọc những khuẩn lạc có gen chèn.
- Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu bằng. - Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng.
Hình 2.5. Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5. Plasmid pKD46
- Kích thước 6329 bp.
- Mang gen kháng kanamycin.
- Mang hai trình tự khởi đầu sao chép repA101ts và oriR101. Sự khởi đầu sao chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, do đó plasmid không nhân lên được ở 37oC – 42oC.
- Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red được điều khiển bởi promoter ParaB. Promoter ParaB tăng cường sản xuất λ Red khi có arabinose.
- Mang gen kháng ampicillin.
- Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E. ictaluri để tận dụng hệ thống tái tổ hợp λ Red.
Hình 2.6. Plasmid pKD46. 2.1.5.6. Plasmid pGP704
- Kích thước 3705 bp.
- Mang trình tự khởi đầu sao chép oriR6K, cần phải có protein π do gen
pir mã hóa mới nhân lên được. Do đó, plasmid chỉđược duy trì trong những chủng có gen pir nhưE. coli DH5α λpir; E. coli SM10 λ pir.
- Mang gen kháng ampicillin.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri
2.2.1.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự gen wzz của E. ictaluri (NC_012779) từ ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR1 để khuyếch đại gen wzz kích thước 1038 bp. Mồi WF1 mang trình tự nhận biết của SalI, mồi WR1 mang trình tự nhận biết của EcoRI và có trình tự như sau:
WF1: 5’-GTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’ WR1: 5’-GAATTCTCAGATCCGTGCACGACG-3’
2.2.1.2. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri
Ly trích DNA bộ gen E. ictaluri theo quy trình sau:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. ictaluri vào 5 ml môi trường BHI colistin, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC, 16 giờ.
- Li tâm 3 ml dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút, 5 phút. - Bỏ dịch nổi, lấy cặn.
- Hòa tan cặn vào 1 ml nước cất vô trùng.
- Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút.
- Bỏ dịch nổi, thu cặn.
- Bổ sung 200 µl TE 1X vô trùng, hòa tan cặn. - Ủ 950C, 10 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút.
- Thu dịch nổi, bảo quản - 20oC.
DNA bộ gen E. ictaluri được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1. Sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
2.2.1.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) gen wzz (pGEMT::wzz)
Taq DNA polymerase có hoạt tính terminal transferase, thêm
deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ của sản phẩm PCR. Hệ thống vector pGEM-T Easy được thiết kế mang một thymidine (T) ởđầu 3’của cả hai bên. T nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tựđóng vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR. Nhờ vậy, phản ứng nối xảy ra dễ dàng. Thành phần phản ứng nối như sau: 2X buffer 5l Sản phẩm PCR 3l pGEM-T Easy 1l DNA T4 ligase 1l
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
2.2.1.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5αbằng phương pháp hóa biến nạp biến nạp
Các tế bào E. coli được phát triển ở pha log. Tế bào thu được bằng cách li tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả nạp). Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 5 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC.
- Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0.375 (không được để OD590 quá 0.4).
- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 5 - 10 phút.
Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3000 vòng/phút, 7 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ly tâm
2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Để trên đá trong 30 phút. Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.
- Huyền phù sinh khối trong 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Bổ sung 2 ml glycerol lạnh 50% đểđạt nồng độ glycerol cuối cùng là 10%.
- Chia lượng nhỏ 100 µl vào tube 1,5 ml và làm lạnh nhanh trong ethanol 100o ở - 80oC.
2.2.1.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α
- Trộn đều, nhẹ nhàng 10 l phản ứng nối (ở bước 2.2.1.3) vào 100 µl tế bào
E. coli khả nạp. Giữ trong bểđá 10 phút.
- Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bểổn nhiệt 42oC trong 2 phút. - Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào bểđá trong 1 – 2 phút. - Cho vào 250 µl môi trường LB. Nuôi cấy lắc ở 37oC, 1 giờ.
- Lấy 100 µl trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và X – gal (40 µg/ml).
- Ủở 37oC, qua đêm.
2.2.1.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Vector pGEM-T Easy chứa gen lacZα mã hóa cho tiểu phẩn α của enzyme β-
galactosidase. Vùng MCS nằm trong gen lacZα giúp chọn lọc vector có gen chèn
dựa vào màu sắc trắng/xanh của khuẩn lạc. Các tế bào E. coli biến nạp được sàng lọc trên môi trường LB – amp – Xgal. Khuẩn lạc chứa vector có gen chèn có màu trắng. Khuẩn lạc chứa vector không có gen chèn có màu xanh.
Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen
wzz bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi M13F/M13R. Cặp mồi
M13F/M13R nằm hai bên MCS của vector pGEM-T Easy cho phép xác định đoạn
gen wzz có được chèn vào hay không. Cặp mồi có trình tự như sau: M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’
M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’
2.2.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽđược nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.
- Phản ứng cắt giới hạn với SalI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện của gen wzz
trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pGEM-T::wzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl SalI (20 U/µl) 1 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2O 15 µl 2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz
Plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tự gen wzz bằng các cặp mồi M13F/M13R; WFsq/WRsq. Cặp mồi WFsq/WRsq có trình tự như sau: