Trong quá trình tổng hợp LPS, Lipid A và oligosaccharide lõi được tổng hợp cùng với nhau, trong khi O antigen được tổng hợp độc lập [11].
Hầu hết các O antigen được tổng hợp theo con đường phụ thuộc Wzy (Wzy dependent pathway), tuy nhiên cũng có một vài loại O antigen được tổng hợp bằng
các hình thức polymer hóa khác (Wzy independent pathway) [11].
Trong con đường tổng hợp phụ thuộc Wzy, đầu tiên O unit được tổng hợp bằng cách chuyển liên tục những phân tử đường (từ đường tương ứng của
nucleotide) đến lipid vận chuyển undecaprenol-phosphate (UndP) nhờ những
enzyme glycosyltransferase chuyên biệt. Quá trình này xảy ra trong tế bào chất. Ban đầu, O unit hoàn chỉnh vẫn tập hợp trên undecaprenylphosphate. Sau đó, enzyme O unit flippase (Wzx) chuyển O unit từ màng trong ra màng ngoài. Ởđó, O unit được
polymer hóa tạo thành O antigen nhờ O antigen polymerase (Wzy) và sau đó được
nối với lipid lõi A nhờ enzyme WaaL ligase [4], [5], [12], [27]. Sự di chuyển cuối cùng của phân tử LPS hoàn chỉnh ra bề mặt tế bào được giả thiết là điều hòa bởi một phức hợp protein ngoài màng Imp/RlpB [27].
Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz, còn được gọi là Cld
[chain length determinant] hay Rol [regulator of O antigen length]. Khi chủng vi
khuẩn bị đột biến gen wzz thì chiều dài chuỗi O antigen sẽ phân bố một cách ngẫu nhiên [27].
Đến nay, cơ chế protein Wzz ảnh hưởng tới quá trình polymer hóa vẫn chưa được hiểu rõ. Bastin và cộng sự cho rằng Wzz hoạt động như thiết bị bấm giờ phân
tử, cho phép sự polymer hóa bởi Wzy tiếp tục trong một khoảng thời gian định trước nào đó hoặc cho tới khi chiều dài đặc trưng của chuỗi O antigen được hình thành. Một giả thuyết khác được đưa ra bởi Monora và cộng sự cho rằng protein Wzz hoạt động như một chaperone phân tử để tập trung phức hợp protein gồm
Wzy, WaaL và chuỗi polysaccharide đang được hình thành. Chiều dài O antigen
chuyên biệt là kết quảđộng học do tỉ lệ khác nhau của Wzy so với WaaL. Hiện nay vẫn chưa có bằng chứng sinh hóa cụ thể nào cho cả hai mô hình này [27].
Gen wzz có tính chất bảo tồn loài cao. Protein Wzz nằm trong họ
“polysaccharide co – polymerase” (PCP). Thành viên của nhóm này liên quan đến
sự điều hòa chiều dài chuỗi của nhiều polysaccharide trong đó có O antigen,
capsular polysaccharide, và exopolysaccharide. Protein Wzz có cấu hình màng: hai
xoắn helix xuyên màng lần lượt nằm gần đầu amino và đầu carboxyl. Đến nay, thông tin cấu trúc của những protein trong họ này vẫn chưa được xác định rõ [27].
1.1.3. Một số nghiên cứu về gen wzz
Chiều dài của chuỗi O antigen ảnh hưởng đến cách vi khuẩn Gram âm tương tác với các protein bổ thể của hệ miễn dịch tự nhiên. Chuỗi O antigen càng dài sẽ ngăn chặn bổ thể tiếp cận với bề mặt tế bào để ly giải vi khuẩn. Những chủng đột biến bị mất hoàn toàn chuỗi O antigen dễ dàng bị tiêu diệt bởi bổ thể hơn so với chủng hoang dại. Do đó, chiều dài chuỗi O antigen có đóng vai trò quan trọng trong độc tính của vi khuẩn [15]. Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz. Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã tạo ra các chủng đột biến gen wzz, khảo sát sự thay đổi chiều dài chuỗi O antigen và kiểm tra độc tính để tìm ra những chủng nhược độc có triển vọng làm vaccine.
Đối với chủng E. coli O7, đột biến gen wzy biểu hiện O antigen với chỉ 1 tiểu phần O7 antigen của chủng hoang dại. Trong khi đó, đột biến gen wzz biểu hiện chuỗi O antigen với chiều dài ngắn hơn so với chủng hoang dại [9]. Ảnh hưởng của chiều dài O antigen đối với sự kháng huyết thanh vẫn chưa được làm rõ nhưng có một vài sự liên hệ giữa chiều dài chuỗi O antigen và độc tính của E. coli [10].
Một số loại vi khuẩn biểu hiện hai loại kiểu mẫu O antigen và được điều hòa bởi hai gen wzz khác nhau [15]. Salmonella enterica hoang dại biểu hiện hai kiểu chuỗi O antigen: chuỗi O antigen dài (16 đến 35 unit) được điều hòa bởi gen wzzst; chuỗi O antigen rất dài ( > 100 unit) được điều hòa bởi gen wzzfepE. Murray và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm trên chuột với 3 chủng Salmonella enterica đột biến gen wzz: chủng đột biến gen wzzst; chủng đột biến gen wzzfepE và chủng đột biến cả hai gen wzzst/wzzfepE. Kết quả cho thấy chủng đột biến cả hai gen wzzst/wzzfepE cho kết quả chuỗi O antigen ngắn hơn, nhạy với huyết thanh hơn và có độc lực thấp nhất. Chủng đột biến gen wzzst không biểu hiện chuỗi O antigen dài, nhạy cảm với huyết thanh và có độc lực thấp hơn so với chủng hoang dại. Đột biến gen wzzfepE
không khác nhiều so với chủng hoang dại [18].
Ở Pseudomonas aeruginosa PAO1, chủng hoang dại chủ yếu biểu hiện hai loại O antigen dài và rất dài được điều hòa bởi hai gen wzz1 và wzz2. Đột biến gen
không biểu hiện chuỗi O antigen rất dài. Chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 giảm biểu hiện cả hai loại chuỗi O antigen. Các chủng đột biến đã được thử nghiệm trên chuột để kiểm tra độc tính. Kết quả chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 có độc lực thấp nhất. Đối với chủng hoang dại, tất cả chuột đều chết ở liều gây độc khoảng 5.5 × 105 CFU nhưng đối với chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 thì ở liều lượng này, chúng hoàn toàn không gây độc. Chủng đột biến gen wzz1 cho kết quả giảm độc lực đáng kể. Liều gây chết 50% của chủng này cao gấp 4,5 lần so với chủng hoang dại. Chủng đột biến gen wzz2 có giảm độc lực nhưng không đáng kể [15].
H. Najdenski và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm để đánh giá vai trò của O- antigen đối với độc tính của vi khuẩn Yersinia enterocolitica O:8. Tiến hành tiêm cho thỏ với 3 chủng đột biến: (i) Chủng đột biến bị mất hoàn toàn O antigen, (ii) chủng đột biến gen wzy bị mất protein Wzy nên biểu hiện LPS với chỉ một O unit duy nhất, (iii) chủng đột biến gen wzz bị mất protein Wzz nên biểu hiện LPS với chiều dài O antigen phân bố một cách ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy chủng đột biến gen wzz có độc lực thấp nhất [19].
Những kết quả nghiên cứu trên chứng tỏ chiều dài của O antigen có ảnh hưởng lớn đến độc tính của vi khuẩn. Do đó, nghiên cứu tạo ra các chủng đột biến gen wzz mang lại nhiều hứa hẹn trong việc sản xuất vaccine sống nhược độc [19].
1.4. Phương pháp knockout gen sử dụng hệ thống tái tổ hợp tương đồng λ Red [7], [32] [7], [32]
λ Red bao gồm các gen gam, bet và exo mã hóa cho một hệ thống tái tổ hợp tương đồng rất hiệu quả. Protein Gam có khả năng bất hoạt hoạt tính exonuclease V của RecBCD, cho phép sự biến nạp đoạn DNA dạng thẳng. Sản phẩm của gen bet
và exo giúp thúc đẩy sự tái tổ hợp ở hai vùng tương đồng ngắn. Hệ thống này rất hữu dụng trong việc bất hoạt các gen mục tiêu ở vi khuẩn Gram âm.
Dựa trên hệ thống λ Red, một phương pháp tạo đột biến đơn giản mà không cần tạo dòng đã được phát triển. Phương pháp này sử dụng hệ thống λ Red để bất
hoạt gen thông qua sự tái tổ hợp tương đồng gữa vùng gen trên nhiễm sắc thể và đoạn DNA dạng thẳng mang gen kháng kháng sinh với 2 bên là trình tự tương đồng với gen đích (Cassette).
Phương pháp đã được sử dụng thành công cho nhiều loại vi khuẩn Gram âm bao gồm: E. coli, Salmonella, Yersinia, Shigella, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas…
Tuy nhiên, độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp tương đồng là khác nhau ở các loài. E. coli chỉ cần trình tự tương đồng khoảng 50 nucleotide là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp nhưng đối với Vibrio cholerae, trình tự 100 nucleotide mới đủ để tái tổ hợp tương đồng xảy ra. Còn đối với Y. pseudotuberculosis, đoạn tương đồng ngắn thường không đủđể xảy ra sự tái tổ hợp mà cần phải có phải có đoạn tương đồng khoảng 500 nucleotide.
1.5. Tạo chủng E. icataluri đột biến gen wzz bằng phương pháp knockout gen và triển vọng làm vaccine
Hiện nay, những sản phẩm được sử dụng trong phòng chống bệnh gan thận mủ do E. ictaluri gây ra chủ yếu các loại vaccine vô hoạt. Vaccine vô hoạt là vaccine được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh, bị bất hoạt bằng nhiệt độ, áp suất hay bằng hóa chất (formalin, glutaraldehyde…), sau đó bổ sung chất bổ trợ thích hợp để gia tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch. Vaccine vô hoạt có ưu điểm là dễ sản xuất và an toàn khi sử dụng. Tuy nhiên, loại vaccine này lại có hiệu quả không cao [34].
Trong khi đó, vaccine nhược độc sử dụng vi khuẩn sống đã giảm hoặc không còn độc lực lại rất có hiệu quả cao trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cũng như duy trì nhớ miễn dịch. Do đó, việc nghiên cứu các chủng
E. ictaluri nhược độc để làm vaccine là một hướng có nhiều tiềm năng [34].
Phương pháp tạo vi khuẩn nhược độc đơn giản nhất là phương pháp cấy chuyền nhiều lần trong phòng thí nghiệm để làm giảm độc lực, sau đó gây nhiễm cho vật chủ. Tuy nhiên, độc lực vi khuẩn có thể phục hồi khi chúng được tăng sinh trong cơ thể vật chủ. Vì vậy, phương pháp này không an toàn và không thích hợp để áp dụng trong sản xuất vaccine [34].
Hiện nay, việc tạo chủng nhược độc thường được thực hiện theo hướng tạo ra các đột biến bằng tác nhân vật lý (nhiệt độ, tia UV), hóa học (hóa chất, kháng sinh), hoặc bằng phương pháp sinh học phân tử (knockout gen).
Phương pháp knockout gen được sử dụng để bất hoạt các gen độc tính hoặc các gen cần thiết cho quá trình sinh dưỡng của vi khuẩn trong vật chủ. Các chủng này vẫn có thể kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ theo con đường gây bệnh của chủng hoang dại nhưng không đủ độc để làm chết vật chủ. Vì vậy, knockout gen là một phương pháp rất hữu dụng trong việc tạo chủng vi khuẩn đột biến nhược độc.
Đối với vi khuẩn E. ictaluri, nhiều nghiên cứu đã xác định O antigen một kháng nguyên mạnh và là một yếu tố gây độc quan trọng. E. ictaluri biểu hiện O antigen dài và chiều dài của O antigen được điều hòa bởi gen wzz. Ở các loài vi
khuẩn Gram âm khác như E. coli, Samonella, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia
enterocolitica, các nhà nghiên cứu đã tạo được chủng đột biến gen wzz và cho thấy chúng có độc lực thấp hơn so với chủng hoang dại.
Từ những cơ sở trên, có thể thấy rằng việc sử dụng phương pháp knockout gen dựa trên hệ thống tái tổ hợp λ Red để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz
mang lại nhiều triển vọng cho việc tạo ra một loại vaccine sống nhược độc để phòng chống bệnh gan thận mủ cho cá tra ở Việt Nam.
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Thiết bị, hóa chất, vật liệu 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)
- Máy gel doc (Biorad)
- Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max
- Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)
- Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)
- Bộđiện di DNA Power Pac200 (Biorad)
- Máy đo quang phổ - Tủủ 37 oC - Tủủ lắc - Bểđiều nhiệt - Tủđông sâu -80 oC - Tủ lạnh -20 oC - Tủ mát 4oC - Cân phân tích - Eppendorf 1.5 ml; 0.2 ml - Cuvette 2 ml; 0,2 ml - Và các dụng cụ chuyên dùng khác 2.1.2. Hóa chất
2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid
- Bộ kít tách chiết plasmid của Qiagen
- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen
2.1.2.3. Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose
- Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen
2.1.2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn
Các enzyme cắt giới hạn được cung cấp bởi Biolab: SalI, EcoRI,
BamHI, XbaI, BglII. Các thành phần của phản ứng cắt được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.2.5. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR
Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi
Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X. Thành
phần phản ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng PCR. Thành phần Nồng độ cuối Thể tích cho 1 phản ứng (V = 25 µl) Taq buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 25 mM 1 mM 1 l dNTPs 25 mM 0.2 mM 0,2 l Taq polymerase 5 U/l 0.04 U 0,2 l Mồi xuôi 10 mM 0.2 mM 0,5 l Mồi ngược 10 mM 0.2 mM 0,5 l H2O 19,1 l
2.1.2.6. Hóa chất dùng cho điện di DNA
Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck).
2.1.2.7. Thang DNA
Thang DNA được cung cấp bởi Fermentas bao gồm:
- Thang DNA 100 bp
- Thang DNA 1 kb
- Thang DNA 1 kb plus
Hình 2.1. Thang DNA
(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus
2.1.2.8. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa biến nạp biến nạp
- Glycerol 10%
- CaCl2 1M
2.1.2.9. Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp điện biến nạp biến nạp
- Glycerol 10%
- Nước cất vô trùng
2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường LB (Luria Bertami)
Trypton 10 g
Yeast extract 5 g
NaCl 10 g
Nước cất đủ 1000 ml
2.1.3.2. Môi trường BHI (Brain Heart Infusion)
BHI (Merk) 37 g
Nước cất đủ 1000 ml
Môi trường thạch có thành phần như môi trường lỏng bổ sung thêm 1,5% agar. Các loại kháng sinh dùng để chọn lọc gồm: colistin, ampicillin, kanamycin được bổ sung vào môi trường với nồng độ cuối là 50 µg/ml. X - gal được sử dụng ở nồng độ cuối là 40 µg/ml.
2.1.4. Chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm:
- Chủng Edwardseilla ictaluri hoang dại S7
- Chủng Escherichia coli: E.coli DH5α; E. coli DH5αλpir; E. coli SM10 λpir
2.1.5. plasmid
2.1.5.1. Plasmid pKD4
- Kích thước 3267 bp.
- Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma.
- Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình
tự FRT.
Hình 2.2. Plasmid pKD4 2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300
- Kích thước 8958 bp.
- Mang gen kháng kanamycin.
- Được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin dùng trong thiết kế cassette.
2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy
- Kích thước 3015 bp.
- Có gắn thêm T ở vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu quả nối. - Mang gen kháng ampicillin và trình tự khởi đầu sao chép f1 ori. - Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α của β galactosidase giúp chọn
lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/ xanh của khuẩn lạc.
- Plasmid pGEM-T Easy được sử dụng để nhân dòng.
Hình 2.4. Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt
- Kích thước 2974 bp.
- Mang gen kháng ampicillin giúp cho sự chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid.
- Mang gen gây độc eco47IR giúp cho sự chọn lọc những khuẩn lạc có gen chèn.
- Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu bằng. - Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng.
Hình 2.5. Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5. Plasmid pKD46
- Kích thước 6329 bp.
- Mang gen kháng kanamycin.
- Mang hai trình tự khởi đầu sao chép repA101ts và oriR101. Sự khởi đầu sao chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, do đó plasmid không nhân lên được ở 37oC – 42oC.
- Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red được điều khiển bởi promoter ParaB. Promoter ParaB tăng cường sản xuất λ Red khi có arabinose.
- Mang gen kháng ampicillin.
- Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E. ictaluri để tận dụng hệ thống tái tổ hợp λ Red.
Hình 2.6. Plasmid pKD46.