b ằng vector pJET1.2/lunt
3.6.5. Tạo dòng E.coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt
HTK (pJET::HTK)
Cassette HTK chứa gen kháng kanamycin ở giữa với hai bên là đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz. Để tạo cassette, phải thực hiện các phản ứng cắt nối đểđưa
đoạn gen kháng kanamycin vào plasmid pJET::HTwzz.
Các phản ứng cắt được thực hiện để chuẩn bị DNA cho phản ứng nối. Phản ứng cắt mở vòng vector pJET::HTwzz bằng BamHI cho sản phẩm cắt có kích thước 3799 bp (Hình 3.24, giếng 2). Phản ứng cắt plasmid pJET::KmR cũng bằng BamHI để thu đoạn KmR (Hình 3.23, giếng 3).
Đoạn KmR được nối với vector pJET::HTwzzđể tạo plasmid tái tổ hợp pJET
mang cassette HTK (pJET::HTK). Cassette HTK gồm gen kháng kanamycin ở giữa
với hai bên là đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz. Plasmid pJET::HTK được biến
nạp vào E. coli DH5α và sàng lọc trên môi trường LB chứa ampicillin và
kanamycin. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpJET/RpJET. Với plasmid pJET mang cassette HTK, PCR khuẩn lạc cho sản phẩm kích thước 2271 bp. Kết quả điện di trên Hình 3.25, giếng 1 cho thấy sản phẩm PCR có kích thước phù hợp. Khuẩn lạc được tách plasmid và tiếp tục kiểm tra bằng phản ứng cắt với BglII. Kết quảđiện di sản phẩm cắt ởHình 3.26, giếng 3 cho thấy sản phẩm cắt có vạch đúng với kích thước của cassette HTK (2152 bp). Điều này chứng tỏ đoạn KmR đã được chèn vào giữa đoạn đầu và đoạn cuối gen wzz trong plasmid pJET1.2/blunt.
Như vậy, chúng tôi đã thu nhận được dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang cassette HTK.
Hình 3.24. Kết quảđiện di sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI trên gel agarose 1%. Giếng 1: plasmid pJET::HTwzz chưa cắt; Giếng 2: pJET::HTwzz cắt bằng BamHI;
Giếng 3: Thang DNA 1kb
Hình 3.25. Kết quảđiện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. Giếng 1: PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpJET/RpJET; Giếng 2: Đối chứng (-);
Hình 3.26. Kết quảđiện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII trên gel agarose 1%. Giếng 1: Thang DNA 1kb; Giếng 2: plasmid pJET::HTK chưa cắt;
Giếng 3: pJET::HTK cắt bằng BglII
3.6.6. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK pGP704::HTK
Như vậy chúng tôi đã tạo được vector pJET1.2/blunt mang cassette HTK để
thực hiện tái tổ hợp tương đồng. Tuy nhiên, vector pJET1.2/blunt có thể tự nhân lên trong E. ictaluri, không phù hợp cho việc chọn lọc những dòng E. ictaluriđã xảy ra tái tổ hợp. Vì vậy, cần phải thực hiện phản ứng cắt nối để chuyển cassette HTK từ
pJET1.2/blunt sang suicide vector pGP704. Vector pGP704 chỉ nhân lên được ở
những chủng có gen pir, vì vậy chúng tôi chọn dòng tế bào E. coli DH5α λpir mang
gen pirđể nhân dòng plasmid pGP704 mang cassette.
Plasmid pGP704 được cắt mở vòng bằng BglII. Plasmid pJET::HTK cũng
được cắt bằng BglII để thu nhận cassette HTK (Hình 3.26, giếng 3). Nối cassette HTK vào vector pGP704 và biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5αλpir. Các dòng biến nạp được sàng lọc trên môi trường LB chứa kháng sinh ampicillin và
kanamycin. Các khuẩn lạc được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpGP704/RpGP704. Đối với các dòng E.coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK, PCR khuẩn lạc cho sản phẩm 2260 bp gồm đoạn HTK (2152 bp) và trình tự trên pGP704 (108 bp). Kết quả điện di trên Hình 3.27, giếng 1 cho thấy PCR khuẩn lạc có vạch đúng như dựđoán. Khuẩn lạc được tách plasmid và tiếp tục kiểm tra bằng phản ứng với BglII cho sản phẩm có kích thước bằng với kích thước đoạn HTK (Hình 3.28, giếng 2)
Như vậy, Chúng tôi đã thu nhận được dòng E. coli DH5αλpirchứa plasmid pGP704 mang cassette HTK.
Hình 3.27. Kết quảđiện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%.
Giếng 1: PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpGP704/RpGP704; Giếng 2: Đối chứng (-); Giếng 3: Thang DNA 1kb plus.
Hình 3.28. Kết quảđiện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII
Giếng 1: pGP704::HTK chưa cắt; Giếng 2: pGP704::HTK cắt bằng BglII; Giếng 3: Thang DNA 1kb.
Sau khi đã nhân dòng cassette HTK trong plasmid pGP704, chúng tôi chuyển
plasmid pGP704 mang cassette vào E. ictaluri bằng hai phương pháp: điện biến nạp và tiếp hợp.
3.6.7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. ictaluri::pKD46 để tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz
Plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK được tách chiết từ E. coli DH5α λpir để biến nạp vào E. ictaluri ::pKD46 và sàng lọc trên môi trường BHI chứa kanamycin, colistin. E. ictaluri chứa plasmid pKD46 trong điều kiện có L - arabinose sẽ tăng cường sản xuất enzyme tái tổ hợp λ Red. Khi pGP704 mang cassette HTK được biến nạp vào trong E. ictaluri, λ Red xúc tác sự tái tổ hợp tương đồng giữa hai trình tự tương đồng trên gen wzz và trên cassette HTK. Kết quả là gen wzz bị loại bỏ và
kanamycin nên chỉ những tế bào đã xảy ra tái tổ hợp mới mọc được trên môi trường kanamycin.
Chúng tôi đã thu nhận được 4 khuẩn lạc đặc trưng của E. ictaluri mọc trên môi trường BHI kanamycin, colistin (được đặt tên lần lượt là M1, M2, M3, M4) Các khuẩn lạc được cấy chuyền để làm thuần và tiến hành kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi chuyên biệt.
Kết quả PCR với cặp mồi FserC/RSerC cho thấy cả 4 khuẩn lạc đều có vạch đặc trưng 191 bp, chứng tỏ cả 4 khuẩn lạc biến nạp trên đều là E. ictaluri (Hình 3.29).
Kết quả PCR với cặp mồi FKm/RKm cho sản phẩm là gen kháng kanmycin 1327 bp (Hình 3.30); PCR với cặp mồi WF1/WR1 cho thấy có vạch 2152 bp của cassette HTK (Hình 3.31). Điều đó chứng tỏ có sự tồn tại của cassette HTK trong 4 khuẩn lạc M1, M2, M3, M4.
Các khuẩn lạc tiếp tục được kiểm tra bằng cặp mồi FpGP704/RpGP704 để xác định cassette đã được chèn vào bộ gen của E. ictaluri hay là vẫn còn tồn tại trong pGP704. Kết quả cho thấy pGP704 không còn tồn tại trong E. ictaluri chứng tỏ cassette đã được chèn vào genome của E. ictaluri (Hình 3.32)
Cuối cùng, các khuẩn lạc được kiểm tra bằng cặp mồi OF1/OR1 để kiểm tra sự tái tổ hợp tương đồng có xảy ra đúng vị trí của gen wzz không. Cặp mồi được thiết kế nằm ngoài đoạn gen wzz nên ở chủng hoang dại sẽ khuếch đại đoạn gen wzz
cho sản phẩm PCR 1115 bp. Nhưng nếu sự tái tổ hợp tương đồng xảy ra, sẽ loại bỏ gen wzz trên E. ictaluri và chèn cassette vào và cho sản phẩm PCR là 2245 bp. Kết quả ở Hình 3.33 cho thấy không có vạch của gen wzz mà chỉ có vạch của cassette HTK. Như vậy sự tái tổ hợp tương đồng đã xảy ra loại bỏ gen wzz hoang dại và chèn vào vị trí đó cassette HTK.
Từ những kết quả trên có thể kết luận chúng tôi đã thu nhận được chủng
E. ictaluriđột biến gen wzz bằng phương pháp điện biến nạp sử dụng hệ thống enzyme tái tổ hợp λ Red của plasmid pKD46.
Hình 3.29. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 4: E. ictaluri M1- M4; Giếng 5 : E. ictaluri hoang dại;
Giếng 6: Đối chứng (-); Giếng 7: Thang DNA 100 bp.
Hình 3.30. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 4: E. ictaluri M1- M4; Giếng 5: E. ictaluri hoang dại;
Giếng 6: pGP704::HTK; Giếng 7: Thang DNA 1kb plus.
Hình 3.31. Kết quảđiện di sản phẩm PCR cặp mồi WF1/WR1 trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 4: E. ictaluri M1 – M4; Giếng 5: E. ictaluri hoang dại;
Hình 3.32. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi FpGP704/RpGP704 trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 4: E. ictaluri M1 – M4; Giếng 5: pGP704::HTK;
Giếng 6: Đối chứng (-); Giếng 7: Thang DNA 1 kb plus.
Hình 3.33. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi OF1/OR1 trên gel agarose 1%. Giếng 1: Thang DNA 1 kb plus; Giếng 2 – 5: E. ictaluri M1- M4; Giếng 6: E. ictaluri hoang dại; Giếng 7: Đối chứng (-) pGP704::HTK
3.6.8. Tạo dòng E. coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK
Song song với phương pháp điện biến nạp, chúng tôi cũng thực hiện phương pháp tiếp hợp để chuyển plasmid pGP704 mang cassette vào E. ictaluri. Để thực hiện tiếp hợp, trước hết plasmid pGP704::HTK phải được chuyển vào chủng E. coli
SM10 λpir mang plasmid RP4 hỗ trợ cho quá trình tiếp hợp.
Plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK được tách từE. coli DH5αλpir và biến nạp vào E. coli SM10 λpir. Các khuẩn lạc biến nạp được sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh ampicilin và kanamycin. Các khuẩn lạc được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpGP704/RpGP704 và phản ứng cắt với BglII như trình bày trong mục 3.6.6. Kết quả PCR khuẩn lạc (Hình 3.34, giếng 1) và phản ứng cắt (Hình 3.35, giếng 2) cho thấy chúng tôi đã thu nhận được dòng E. coli SM10 λpir mang
plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK. Các tế bào này được tiếp hợp với
E.ictaluri::pKD46 để chuyển plasmid pGP704::HTK sang E. ictaluri::pKD46.
Hình 3.34.Kết quảđiện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1%. Giếng 1: PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpGP704/RpGP704; Giếng 2: Đối chứng (-);
Hình 3.35. Kết quảđiện di sản phẩm cắt bằng enzyme BglII trên gel agarose 1%. Giếng 1: Thang DNA 1 kb plus; Giếng 2: Plasmid pGP704::HTK cắt bằng BglII;
Giếng 3: Plasmid pGP704::HTK chưa cắt.
3.6.9. Tạo chủng E. ictalruri đột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp
Tiếp hợp được thực hiện để chuyển plasmid tái tổ hợp pGP704 mang cassette HTK từ E. coli SM10 λpir sang E. ictaluri::pKD46. Khi plasmid tái tổ hợp được chuyển vào E. ictaluri::pKD46, sự tái tổ hợp tương đồng sẽ xảy ra loại bỏ gen wzz
và chèn cassette HTK vào. Các khuẩn lạc tiếp hợp được sàng lọc trên môi trường BHI, kanamycin, colistin.
Kết quả từ 3 ml dịch tiếp hợp, chúng tôi thu nhận được 344 khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI, kanamycin, colistin. Các khuẩn lạc đặc trưng được cấy chuyền để làm thuần và kiểm tra bằng các cặp mồi chuyên biệt.
Kết quả PCR với cặp mồi FserC/RSerC đều có vạch đặc trưng 191 bp của E. ictaluri (Hình 3.36).
Kết quả PCR với cặp mồi FKm/RKm cho sản phẩm là gen kháng kanamycin 1327 bp (Hình 3.37); PCR với cặp mồi WF1/WR1 cho thấy có vạch 2152 bp của cassette HTK (Hình 3.38). Điều đó chứng tỏ có sự tồn tại của cassette HTK trong các khuẩn lạc kiểm tra.
Các khuẩn lạc tiếp tục được kiểm tra bằng cặp mồi FpGP704/RpGP704, kết quả cho thấy pGP704 không còn tồn tại trong E. ictaluri chứng tỏ cassette đã được chèn vào genome của E. ictaluri (Hình 3.39)
Cuối cùng, các khuẩn lạc được kiểm tra bằng cặp mồi OF1/OR1. Kết quảở
Hình 3.40 cho thấy không có vạch của gen wzz mà chỉ có vạch của cassette HTK. Như vậy sự tái tổ hợp tương đồng đã xảy ra loại bỏ gen wzz hoang dại và chèn vào vị trí đó cassette HTK.
Từ những kết quả trên có thể kết luận chúng tôi đã thu nhận được chủng E. ictaluriđột biến gen wzz bằng phương pháp tiếp hợp sử dụng hệ thống enzyme tái tổ hợp λ Red. So với phương pháp điện biến nạp, phương pháp tiếp hợp có hiệu suất cao hơn. Điều này có thể do trong quá trình thực hiện điện biến nạp, các tế bào E. ictaluri bị chết nhiều sau khi sốc điện dẫn đến hiệu suất biến nạp thấp.
Hình 3.36. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC trên gel agarose 1%. Giếng 1: Thang DNA 1kb plus. Giếng 2 – 3: Khuẩn lạc tiếp hợp;
Hình 3.37. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 2: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 3: pGP704::HTK;
Giếng 4: E. ictaluri hoang dại. Giếng 5: Thang DNA 1 kb plus.
Hình 3.38. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi WF1/WR1 trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 2: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 3: E. ictaluri hoang dại; Giếng 4: Đối
Hình 3.39. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi FpGP704/RpGP704 trên gel agarose 1%. Giếng 1 – 2: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 3: pGP704::HTK; Giếng 4:
Đối chứng (-); Giếng 5: Thang DNA 1 kb plus.
Hình 3.40. Kết quảđiện di sản phẩm PCR với cặp mồi OF1/OR1trên gel agarose 1%. Giếng 1: Thang DNA 1 kb plus; Giếng 2 – 3: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 4: E.
3.7. Loại bỏ plamid pKD46 ra khỏi chủng E. ictaluri đột biến gen wzz
Sau khi tạo được chủng E. ictaluri đột biến gen wzz, plasmid pKD46 không cần thiết nên phải được loại bỏ ra khỏi tế bào.
Nuôi cấy chủng E. ictaluri đột biến gen wzz ở điều kiện 37oC để loại bỏ
plasmid pKD46. Kiểm tra bằng cách nuôi cấy trong môi trường BHI chứa
ampicillin. Kết quả cho thấy chủng E. ictaluri không mọc được trong môi trường chứa ampicillin chứng tỏ plamid pKD46 đã được loại bỏ khỏi chủng E. ictaluri đột biến.
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Từ các kết quả thử nghiệm trên chủng E. ictaluri chúng tôi thấy rằng:
- Đối với chủng E. ictaluri, knockout gen bằng phương pháp biến nạp cassette dạng thẳng không có kết quả mà cần phải sử dụng suicide plasmid pGP704 để chuyển cassette vào tế bào thì mới có hiệu quả.
- Khi sử dụng suicide plasmid pGP704 để chuyển cassette vào E. ictaluri, cả hai phương pháp điện biến nạp và tiếp hợp đều tạo được chủng E. ictaluri
đột biến gen wzz. Tuy nhiên, phương pháp tiếp hợp cho hiệu suất cao hơn so với phương pháp điện biến nạp.