Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽđược nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.
- Phản ứng cắt giới hạn với SalI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện của gen wzz
trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pGEM-T::wzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl SalI (20 U/µl) 1 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2O 15 µl 2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz
Plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tự gen wzz bằng các cặp mồi M13F/M13R; WFsq/WRsq. Cặp mồi WFsq/WRsq có trình tự như sau:
WFsq: 5’-CTGCGTAGCCCCTATTATCAGC-3’ WRsq: 5’-TGAAACGCCGCGTCCAAAACC-3’
2.2.2. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46
2.2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp
Sử dụng điện trường mạnh trong một thời gian ngắn sẽ làm tạm thời mất tính ổn định của màng tế bào. Khi đó, màng tế bào có khả năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trường xung quanh. Nhờ vậy mà DNA hoặc RNA có thểđược chuyển vào tế bào.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri được tiến hành như sau:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. ictaluri vào 5 ml môi trường BHI lỏng. Nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC.
- Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường BHI lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC cho đến khi OD600đạt khoảng 0,8 – 1.0.
- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 10 phút.
Các thao thác tiếp theo được thực hiện trong đá lạnh
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối tế bào trong trong 50 ml nước lạnh. Ly tâm 4000
vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi.
- Huyền phù sinh khối trong 50 ml glycerol lạnh 10%. Ly tâm 4000 vòng/phút,
15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. (bước này được lặp lại 2 lần).
- Huyền phù sinh khối trong 2 ml glycerol lạnh 10% . Sau đó, chia 100 µl dịch tế bào vào mỗi tube 1,5 ml. Sử dụng để biến nạp ngay hoặc làm lạnh nhanh trong ethanol 100o và bảo quản ở - 80 oC.
2.2.2.2. Biến nạp plasmid pKD46 vào E. ictaluri.
- Trộn 100 ng plasmid pKD46 vào 100 µl tế bào E. ictaluri khả nạp. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. Ủ trên đá 20 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹđể các tế bào lắng xuống dưới đáy.
- Đặt cuvette vào máy điện biến nạp.Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V. Nhấn nút start và giữ 5 ms.
- Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch tế bào sang 1 tube mới.
- Nuôi cấy lắc 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút.
- Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa ampicillin (50 µg/ml), colistin (50 µg/ml). Ủở 28oC trong 48 – 72 giờ.
2.2.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI – ampcillin – colistin được nuôi cấy để tách plamid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI.
Thành phần phản ứng cắt như sau: Plasmid kiểm tra 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2O 16 µl Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
2.2.2.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng phương pháp điện biến nạp phương pháp điện biến nạp
Plasmid pKD46 sản xuất enzyme tái tổ hợp λ Red. Quá trình sản xuất λ Red được tăng cường khi có L – arabinose. Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri::pKD46, L – arabinose được bổ sung để tăng cường sự sản xuất enzyme tái tổ hợp.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp giống như trong mục 2.2.2.1. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L – arabinose đến nồng độ cuối là 10 mM. Tế bào khả nạp được sử dụng liền để không mất hoạt tính của enyme tái tổ hợpλ red.
2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong
Sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1.Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP
2.2.3.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đoạn gen
wzz của E. ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để tạo cassette 1 STEP chứa gen kháng kamamycin ở giữa với hai đầu là 2 trình tự tương đồng trên E. ictaluri. Mồi F1 bao gồm đoạn P1 là priming site 1 của pKD4 và đoạn H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz. Mồi R1 bao gồm đoạn P2 là priming site 2
của pKD4 và đoạn H2 (50 bp) nằm bên phải gen wzz. Cặp mồi F1/R1 có trình tự như sau: F1: 5’CGACAGGCATACATGTCTAACGGCCCTAGTCGGCCATAA AGGGAAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’ R1: 5’GCCCGCTGGCACGGATCGGCCAATTCCCTGTTAAGCGTT AACGCTGGCGCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’
2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP
Thực hiện phản ứng PCR trên bản mẫu là pKD4 với cặp mồi F1/R1để tạo cassette 1 STEP. Sản phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và sử dụng để biến nạp vào E. ictaluri::pKD46.
2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46
- Trộn 100 ng sản phẩm PCR vào 100 µl tế bào E. ictaluri::pKD46khả nạp vừa mới chuẩn bị. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. Ủ trên đá 20 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹđể các tế bào lắng xuống dưới đáy.
- Đặt cuvette vào máy điện biến nạp. Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V. Nhấn nút start và giữ 5 ms.
- Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch tế bào sang 1 tube mới.
- Nuôi cấy lắc ở 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút.
- Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa colistin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml). Ủở 28oC trong 36 – 48 giờ.
2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP
Độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp là khác nhau ở mỗi loài vi khuẩn. Đối với E. coli, Shigella, Yersinia …chỉ cần trình tự 50 nucleotide tương đồng là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn khác như
mới có thể xảy ra tái tổ hợp tương đồng. Do đó, bên cạnh cassette 1 STEP có đoạn tương đồng 50 nucleotide, chúng tôi thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng dài hơn (400 nucleotide). Sử dụng phương pháp 2 STEP PCR để tạo cassette 2 STEP.
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP được tiến hành như trong Sơ đồ 2.2.
2.2.4.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự gen wzz trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (W2, kích thước 405 bp). WF2 và WR2 được thiết kế gắn thêm trình tự FRT 34 nucleotide giúp loại bỏ gen kháng kanamycin ở những bước tiếp theo của đề tài. Cặp mồi có trình tự như sau:
WF2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG CACAGGCGATCTATCAGC-3’
WR2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGC ACTCCCCTCTTTATGACG-3’
Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin của pKD4 trên ngân hàng gen, chúng
tôi thiết kế cặp mồi KF/KR để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. KF và KR cũng được gắn thêm trình tự FRT như trên. Sản phẩm PCR (Km) có kích thước 863 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:
KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG AACAAGATGGATTGC-3’
KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA GAACTCGTCAAGAAGG-3’
2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP
Để tạo cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước phản ứng PCR (2 step PCR). Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và Km. - Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn W1. - Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn W2. - Phản ứng PCR sử dụng pKD4 làm bản mẫu với cặp mồi KF, KR để khuếch đại đoạn Km.
Sau khi thu được các sản phẩm PCR lần 1, tiến hành đo nồng độ và trộn chung 3 đoạn (0,3 pmol mỗi đoạn) để làm bản mẫu cho phản ứng PCR lần 2. Phản ứng PCR lần 2 sử dụng cặp mồi WF1/WR1 cho sản phẩm 2 STEP kích thước 1668 bp.
2.2.4.3.Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46
Các bước biến nạp cassette 2 STEP được thực hiện nhưđối với cassette 1 STEP trong mục 2.2.3.3.
2.2.5.Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 được tiến hành như trong Sơ đồ 2.3.
2.2.5.1. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen wzz đầu của gen wzz
a. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự của gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FHwzz/RHwzz để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (Hwzz, kích thước 388 bp). FHwzz có trình tự cắt của SalI, RHwzz có trình tự cắt của BamHI và có trình tự như sau:
FHwzz: 5’-AAGTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’
RHwzz: 5’-AAGGATCCGTGCACTCCCCTCTTTATGACG-3’
b. Khuếch đại và thu nhận đoạn Hwzz của E. ictaluri
DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong mục 2.2.1.2. và được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Hwzz bằng cặp mồi FHwzz/RHwzz. Sản phẩm PCR có kích thước 404 bp được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz
(pJET::Hwzz)
Vector pJET1.2/blunt là vector mạch thẳng đầu bằng. Vì vậy đoạn Hwzz
được chèn vào phải đầu bằng. Do đó, trước khi nối, phải thực hiện phản ứng cắt
đuôi A của sản phẩm PCR do Taq DNA polymerase thêm vào. Thành phần phản
ứng như sau:
2X buffer 10 l
Sản phẩm PCR 1 l
H2O 6 l
DNA blunting enzyme 1 l
Trộn đều, nhẹ nhàng trong khoảng 30 giây và ủ ở 70oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme. Sau đó, để trên đá 1 phút và bổ sung các thành phần sau để tiếp tục phản ứng nối:
pJET1.2/blunt 1 l
T4 ligase 1 l
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
d. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5αbằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
e. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz vào E. coli DH5α
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và ủở 37oC trong 16 giờ.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Vector pJET1.2/blunt tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới hạn gây chết sau khi biến nạp và không nhân lên được. Kết quả là chỉ có các dòng tái tổ hợp xuất hiện trên đĩa nuôi cấy (khuẩn lạc trắng). PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra sự hiện diện của đoạn chèn Hwzz. Cặp mồi được thiết kế hai bên trình tự MCS của pJET1.2/blunt và có trình tự như sau:
FpJET : 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' RpJET : 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽđược nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.
- Phản ứng cắt giới hạn với SalI và BamHI để kiểm tra sự hiện diện của Hwzz
trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pJET::Hwzz 10 µl
NE Buffer 2 (10 X) 3 µl
BamHI (20 U/µl) 1 µl
SalI (20 U/µl) 1 µl
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
h. Giải trình tự đoạn Hwzz
Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tựđoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET.
2.2.5.2. Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen wzz cuối của gen wzz
a. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự của gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FTwzz/RTwzz để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (Twzz, kích thước 405 bp). FTwzz có trình tự cắt của BamHI, RTwzz có trình tự cắt của XbaI và có trình tự như sau:
FTwzz : 5’-AAGGATCCGTGGCACAGGCGATCTATCAGC-3’
RTwzz : 5’-AATCTAGATCAGATCCGTGCACGACG-3’
b. Khuếch đại và thu nhận đoạn Twzz của E. ictaluri
DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong mục 2.2.1.2. và được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Twzz bằng cặp mồi
FTwzz/RTwzz. Sản phẩm PCR có kích thước 421 bp được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Twzz
(pJET::Twzz)
Phản ứng nối được thực hiện nhưđối với đoạn Hwzz trong phần c của mục 2.2.5.1. d. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
e. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Twzz vào E. coli DH5α
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và ủở 370C trong 16 giờ.
PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đoạn Twzz chèn vào vector.
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽđược nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.
- Phản ứng cắt giới hạn với BamHI và XbaI để kiểm tra sự hiện diện của đoạn Twzz trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Plasmid pJET::Twzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 1 µl XbaI (20 U/µl) 1 µl H2O 15 µl Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. h. Giải trình tự đoạn Twzz
Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tựđoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET.
2.2.5.3.Tạo dòng E. coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz
a. Phản ứng cắt giới hạn
Phản ứng cắt giới hạn được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang cả hai đoạn Hwzz và Twzz. Đầu tiên là phản ứng cắt mở vòng plasmid pJET::Hwzz bằng enzyme BamHI và XbaI. Phản ứng cắt có thành phần như sau: Plasmid JET::Hwzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl BamHI (20 U/µl) 1 µl XbaI (20 U/µl) 1 µl H2O 15 µl
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt được tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo là phản ứng cắt plasmid pJET::Twzz cũng bằng enzyme BamHI và XbaI để thu đoạn Twzz. Thành phần phản ứng cắt như sau: Plasmid JET::Twzz 15 µl 1 X NE Buffer 2 (10 X) 5 µl BamHI (20 U/ µl) 2 µl XbaI (20 U/ µl) 2 µl H2O 26 µl
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Đoạn Twzz được tinh sạch qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối.
b. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz
và Twzz (pJET::HTwzz)
Các sản phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để tạo plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz. Phản ứng nối có thành phần như sau:
Plasmid pJET::Hwzz mở vòng 3µl
Đoạn Twzz 10µl
T4 DNA ligase buffer (10X) 2µl
T4 DNA ligase (400 U/µl) 1µl
H2O 4 µl
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
c. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
d. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz vào E. coli DH5α
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và ủở 370C trong 16 giờ.