Plasmid pKD4

- Kích thước 3267 bp.

- Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma.

- Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình

tự FRT.

Hình 2.2. Plasmid pKD4 2.1.5.2. Plasmid pCAMBIA 1300

- Kích thước 8958 bp.

- Mang gen kháng kanamycin.

- Được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin dùng trong thiết kế cassette.

2.1.5.3. Plasmid pGEM-T Easy

- Kích thước 3015 bp.

- Có gắn thêm T ở vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu quả nối. - Mang gen kháng ampicillin và trình tự khởi đầu sao chép f1 ori. - Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α của β galactosidase giúp chọn

lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/ xanh của khuẩn lạc.

- Plasmid pGEM-T Easy được sử dụng để nhân dòng.

Hình 2.4. Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4. Plasmid pJET1.2/blunt

- Kích thước 2974 bp.

- Mang gen kháng ampicillin giúp cho sự chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid.

- Mang gen gây độc eco47IR giúp cho sự chọn lọc những khuẩn lạc có gen chèn.

- Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu bằng. - Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng.

Hình 2.5. Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5. Plasmid pKD46

- Kích thước 6329 bp.

- Mang gen kháng kanamycin.

- Mang hai trình tự khởi đầu sao chép repA101ts và oriR101. Sự khởi đầu sao chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, do đó plasmid không nhân lên được ở 37oC – 42oC.

- Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red được điều khiển bởi promoter ParaB. Promoter ParaB tăng cường sản xuất λ Red khi có arabinose.

- Mang gen kháng ampicillin.

- Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E. ictaluri để tận dụng hệ thống tái tổ hợp λ Red.

Hình 2.6. Plasmid pKD46. 2.1.5.6. Plasmid pGP704

- Kích thước 3705 bp.

- Mang trình tự khởi đầu sao chép oriR6K, cần phải có protein π do gen

pir mã hóa mới nhân lên được. Do đó, plasmid chỉđược duy trì trong những chủng có gen pir nhưE. coli DH5α λpir; E. coli SM10 λ pir.

- Mang gen kháng ampicillin.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tạo dòng E. coli DH5α mang đoạn gen wzz của E. ictaluri

2.2.1.1. Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự gen wzz của E. ictaluri (NC_012779) từ ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR1 để khuyếch đại gen wzz kích thước 1038 bp. Mồi WF1 mang trình tự nhận biết của SalI, mồi WR1 mang trình tự nhận biết của EcoRI và có trình tự như sau:

WF1: 5’-GTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’ WR1: 5’-GAATTCTCAGATCCGTGCACGACG-3’

2.2.1.2. Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E. ictaluri

Ly trích DNA bộ gen E. ictaluri theo quy trình sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E. ictaluri vào 5 ml môi trường BHI colistin, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC, 16 giờ.

- Li tâm 3 ml dịch nuôi cấy ở 6000 vòng/phút, 5 phút. - Bỏ dịch nổi, lấy cặn.

- Hòa tan cặn vào 1 ml nước cất vô trùng.

- Ly tâm 6000 vòng/phút, 5 phút.

- Bỏ dịch nổi, thu cặn.

- Bổ sung 200 µl TE 1X vô trùng, hòa tan cặn. - Ủ 950C, 10 phút.

- Ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút.

- Thu dịch nổi, bảo quản - 20oC.

DNA bộ gen E. ictaluri được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1. Sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột để dòng hóa.

2.2.1.3. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) gen wzz (pGEMT::wzz)

Taq DNA polymerase có hoạt tính terminal transferase, thêm

deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ của sản phẩm PCR. Hệ thống vector pGEM-T Easy được thiết kế mang một thymidine (T) ởđầu 3’của cả hai bên. T nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tựđóng vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR. Nhờ vậy, phản ứng nối xảy ra dễ dàng. Thành phần phản ứng nối như sau: 2X buffer 5l Sản phẩm PCR 3l pGEM-T Easy 1l DNA T4 ligase 1l

Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

2.2.1.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5αbằng phương pháp hóa biến nạp biến nạp

Các tế bào E. coli được phát triển ở pha log. Tế bào thu được bằng cách li tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả nạp). Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid.

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 5 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC.

- Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 37oC cho đến khi giá trị OD590 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0.375 (không được để OD590 quá 0.4).

- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 5 - 10 phút.

Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh.

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3000 vòng/phút, 7 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Ly tâm

2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.

- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh. Để trên đá trong 30 phút. Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Bỏ dịch nổi.

- Huyền phù sinh khối trong 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M. Bổ sung 2 ml glycerol lạnh 50% đểđạt nồng độ glycerol cuối cùng là 10%.

- Chia lượng nhỏ 100 µl vào tube 1,5 ml và làm lạnh nhanh trong ethanol 100o ở - 80oC.

2.2.1.5. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E. coli DH5α

- Trộn đều, nhẹ nhàng 10 l phản ứng nối (ở bước 2.2.1.3) vào 100 µl tế bào

E. coli khả nạp. Giữ trong bểđá 10 phút.

- Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bểổn nhiệt 42oC trong 2 phút. - Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào bểđá trong 1 – 2 phút. - Cho vào 250 µl môi trường LB. Nuôi cấy lắc ở 37oC, 1 giờ.

- Lấy 100 µl trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và X – gal (40 µg/ml).

- Ủở 37oC, qua đêm.

2.2.1.6. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Vector pGEM-T Easy chứa gen lacZα mã hóa cho tiểu phẩn α của enzyme β-

galactosidase. Vùng MCS nằm trong gen lacZα giúp chọn lọc vector có gen chèn

dựa vào màu sắc trắng/xanh của khuẩn lạc. Các tế bào E. coli biến nạp được sàng lọc trên môi trường LB – amp – Xgal. Khuẩn lạc chứa vector có gen chèn có màu trắng. Khuẩn lạc chứa vector không có gen chèn có màu xanh.

Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen

wzz bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi M13F/M13R. Cặp mồi

M13F/M13R nằm hai bên MCS của vector pGEM-T Easy cho phép xác định đoạn

gen wzz có được chèn vào hay không. Cặp mồi có trình tự như sau: M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’

M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’

2.2.1.7. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn

Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽđược nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.

- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.

- Phản ứng cắt giới hạn với SalI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện của gen wzz

trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:

Plasmid pGEM-T::wzz 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl SalI (20 U/µl) 1 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2O 15 µl 2.2.1.8. Giải trình tự gen wzz

Plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tự gen wzz bằng các cặp mồi M13F/M13R; WFsq/WRsq. Cặp mồi WFsq/WRsq có trình tự như sau:

WFsq: 5’-CTGCGTAGCCCCTATTATCAGC-3’ WRsq: 5’-TGAAACGCCGCGTCCAAAACC-3’

2.2.2. Tạo chủng E. ictaluri mang plasmid pKD46

2.2.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp

Sử dụng điện trường mạnh trong một thời gian ngắn sẽ làm tạm thời mất tính ổn định của màng tế bào. Khi đó, màng tế bào có khả năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trường xung quanh. Nhờ vậy mà DNA hoặc RNA có thểđược chuyển vào tế bào.

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri được tiến hành như sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E. ictaluri vào 5 ml môi trường BHI lỏng. Nuôi cấy qua đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC.

- Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường BHI lỏng. Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC cho đến khi OD600đạt khoảng 0,8 – 1.0.

- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh. Ngâm trong nước đá 10 phút.

Các thao thác tiếp theo được thực hiện trong đá lạnh

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. - Huyền phù sinh khối tế bào trong trong 50 ml nước lạnh. Ly tâm 4000

vòng/phút, 15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi.

- Huyền phù sinh khối trong 50 ml glycerol lạnh 10%. Ly tâm 4000 vòng/phút,

15 phút, 2oC. Bỏ dịch nổi. (bước này được lặp lại 2 lần).

- Huyền phù sinh khối trong 2 ml glycerol lạnh 10% . Sau đó, chia 100 µl dịch tế bào vào mỗi tube 1,5 ml. Sử dụng để biến nạp ngay hoặc làm lạnh nhanh trong ethanol 100o và bảo quản ở - 80 oC.

2.2.2.2. Biến nạp plasmid pKD46 vào E. ictaluri.

- Trộn 100 ng plasmid pKD46 vào 100 µl tế bào E. ictaluri khả nạp. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. Ủ trên đá 20 phút.

- Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹđể các tế bào lắng xuống dưới đáy.

- Đặt cuvette vào máy điện biến nạp.Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V. Nhấn nút start và giữ 5 ms.

- Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch tế bào sang 1 tube mới.

- Nuôi cấy lắc 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút.

- Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa ampicillin (50 µg/ml), colistin (50 µg/ml). Ủở 28oC trong 48 – 72 giờ.

2.2.2.3. Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng cắt giới hạn

Các khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI – ampcillin – colistin được nuôi cấy để tách plamid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI.

Thành phần phản ứng cắt như sau: Plasmid kiểm tra 10 µl NE Buffer 2 (10 X) 3 µl EcoRI (20 U/µl) 1 µl H2O 16 µl Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.

2.2.2.4. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng phương pháp điện biến nạp phương pháp điện biến nạp

Plasmid pKD46 sản xuất enzyme tái tổ hợp λ Red. Quá trình sản xuất λ Red được tăng cường khi có L – arabinose. Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri::pKD46, L – arabinose được bổ sung để tăng cường sự sản xuất enzyme tái tổ hợp.

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp giống như trong mục 2.2.2.1. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L – arabinose đến nồng độ cuối là 10 mM. Tế bào khả nạp được sử dụng liền để không mất hoạt tính của enyme tái tổ hợpλ red.

2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP

Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong

Sơ đồ 2.1.

Sơ đồ 2.1.Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP

2.2.3.1. Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đoạn gen

wzz của E. ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để tạo cassette 1 STEP chứa gen kháng kamamycin ở giữa với hai đầu là 2 trình tự tương đồng trên E. ictaluri. Mồi F1 bao gồm đoạn P1 là priming site 1 của pKD4 và đoạn H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz. Mồi R1 bao gồm đoạn P2 là priming site 2

của pKD4 và đoạn H2 (50 bp) nằm bên phải gen wzz. Cặp mồi F1/R1 có trình tự như sau: F1: 5’CGACAGGCATACATGTCTAACGGCCCTAGTCGGCCATAA AGGGAAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’ R1: 5’GCCCGCTGGCACGGATCGGCCAATTCCCTGTTAAGCGTT AACGCTGGCGCATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP

Thực hiện phản ứng PCR trên bản mẫu là pKD4 với cặp mồi F1/R1để tạo cassette 1 STEP. Sản phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và sử dụng để biến nạp vào E. ictaluri::pKD46.

2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46

- Trộn 100 ng sản phẩm PCR vào 100 µl tế bào E. ictaluri::pKD46khả nạp vừa mới chuẩn bị. Khuấy nhẹ bằng đầu tip. Ủ trên đá 20 phút.

- Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹđể các tế bào lắng xuống dưới đáy.

- Đặt cuvette vào máy điện biến nạp. Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V. Nhấn nút start và giữ 5 ms.

- Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch tế bào sang 1 tube mới.

- Nuôi cấy lắc ở 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút.

- Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa colistin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml). Ủở 28oC trong 36 – 48 giờ.

2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP

Độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp là khác nhau ở mỗi loài vi khuẩn. Đối với E. coli, Shigella, Yersinia …chỉ cần trình tự 50 nucleotide tương đồng là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn khác như

mới có thể xảy ra tái tổ hợp tương đồng. Do đó, bên cạnh cassette 1 STEP có đoạn tương đồng 50 nucleotide, chúng tôi thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng dài hơn (400 nucleotide). Sử dụng phương pháp 2 STEP PCR để tạo cassette 2 STEP.

Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP được tiến hành như trong Sơ đồ 2.2.

2.2.4.1. Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự gen wzz trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (W2, kích thước 405 bp). WF2 và WR2 được thiết kế gắn thêm trình tự FRT 34 nucleotide giúp loại bỏ gen kháng kanamycin ở những bước tiếp theo của đề tài. Cặp mồi có trình tự như sau:

WF2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG CACAGGCGATCTATCAGC-3’

WR2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGC ACTCCCCTCTTTATGACG-3’

Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin của pKD4 trên ngân hàng gen, chúng

tôi thiết kế cặp mồi KF/KR để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. KF và KR cũng được gắn thêm trình tự FRT như trên. Sản phẩm PCR (Km) có kích thước 863 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:

KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG AACAAGATGGATTGC-3’

KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA GAACTCGTCAAGAAGG-3’

2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP

Để tạo cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước phản ứng PCR (2 step PCR). Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và Km. - Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn W1. - Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn W2. - Phản ứng PCR sử dụng pKD4 làm bản mẫu với cặp mồi KF, KR để khuếch