Tạo chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri đột biến bằng phương pháp knockout gen wzz (o antigen chain length determinant gene

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN TRẦN THỊ THANH THANH TẠO CHỦNG VI KHUẨN EDWARDSIELLAICTALURIĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KNOCKOUT GEN wzz (O - ANTIGEN CHAIN LENGTH DETERMINANT GENE) Chun ngành: Vi sinh Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN QUỐC BÌNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa Cuần này, tơi nhận nhiều quan tâm, động viên, giúp đỡ ba mẹ, thầy cơ, anh chị bạn Con xin cảm ơn gia đình Cn ủng hộ động viên sống đường học vấn Em xin gởi (bi cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quốc Bình Thầy định hướng tạo điều kiện để em hồn thành tốt khóa Cuận Cảm ơn Thầy truyền đạt cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm q báu Xin chân thành cảm ơn anh chị CNSH Thủy Sản, CNSH Y Dược nhiệt tình giúp đỡ em thời gian qua Cảm ơn người bạn tơi Cn bên cạnh chia sẽ, động viên cổ vũ tinh thần cho tơi thời gian thực khóa Cuận Trần Thị Thanh Thanh Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỤC LỤC Trang 1.1 Tạo chủng E icataluri đột biến gen wzz phương pháp 2.2.2.1 2.2.2.2 Kiểm tra dòng tế bào E ictaluri mang pKD6 phản ứng 2.2.5.1 Tạo dòng E coli DH5a mang plasmid chứa 3.6.4.1 Nhân dòng đoạn gen kháng kanamycin E coli DH5a DANH MUC CÁC KÍ HIÊU, TỪ VIẾT TẮT BHI Brain heart infusion CD14 Cluster of differentiation 14 Trần Thị Thanh Thanh CNSH Cơng nghệ sinh học CFU Colony forming units vill DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate FRT Flippase Recognition Target LB Luria bertani LPS Lipopolysaccharide MCS Multi cloning site NCBI National Center for Biotechnology Information OMP Outer membrane protein OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid TCR T cell receptor Luận văn Thạc sĩ Sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG TrầnThành Thị Thanh Thanhứng PCR Bảng 2.1 phần phản Luận văn Thạc sĩ Sinh học DANH MỤC •CÁC HÌNH Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Hình 3.6 Kết so sánh trình tự nucleotide gen wzz chủng E ictaluri cung cấp Trung tâm CNSH so với chủng E ictaluri 93-146 ngân hàng gen Hình 3.18 Kết so sánh trình tự nucleotide đoạn Twzz nhân dòng pJET1.2/blunt so với chủng E ictaluri 93-146 ngân hàng gen NCBI cơng Hình 3.31 Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi WF1/WR1 gel DANH MỤC SƠ ĐỒ Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU Cá tra (Pangasius hypophthalmus) lồi cá có tiềm xuất lớn mang lại lợi nhuận cao cho người ni Theo Hiệp hội Chế biến Xuất thuỷ sản Việt Nam (The Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers - VASEP), sản phẩm cá tra Việt Nam dẫn đầu thị phần giới (2009) VASEP dự báo, vị trí dẫn đầu thị trường giới Cá tra Việt Nam giữ vững nhiều năm kinh tế lớn tới Với tiềm vậy, cá trahiện sản phẩm xuất chủ lực Việt Nam Theo quy hoạch Bộ Nơng Nghiệp & Phát Triển Nơng Thơn, ngạch xuất đến năm 2010 sản lượng cá tra 1,5 triệu tấn, đạt kim 1,5tỉ USD đến năm 2020, sản lượng ước đạt triệu tấn, kim ngạch xuất tỷ USD Một giải pháp quan trọng để nâng cao sản lượng cá tra ni cơng nghiệp tập trung với quy mơ lớn Tuy nhiên, việc ni cá với mật độ cao tạo điều kiện cho bệnh nhiễm khuẩn phát triển lây lan bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nấm, kí sinh trùng Trong đó, gây thiệt hại nghiêm trọng bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây Khi cá bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết lên đến 90% Để điều trị bệnh, người ni thường sử dụng thuốc hóa học số loại kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa chất khơng qui định lặp lặp lại thời gian dài dẫn đến tình trạng kháng thuốc hiệu khơng cao Hơn nữa, lượng tồn dư kháng sinh cá khơng ảnh hưởng tới chất lượng mà cònảnh hưởng khỏe người tiêu dùng Để sản phẩm, đến sức giải vấn đề trên, biện pháp sử dụng vaccine phòng bệnh đánh giá có hiệu quả, tốn đảm bảo an tồn sinh học Do đó, việc tìm kiếm loại vaccine cho cá tra kháng lại bệnh nhiễm khuẩn vấn đề cấp bách cho cơng nghiệp ni cá Việt Nam Đối với vi khuẩn E ictaluri, O antigen chứng minh kháng ngun mạnh yếu tố gây độc quan trọng Chiều dài chuỗi O antigen điều hòa gen wzz (length chain determinant gene) Nghiên cứu lồi vi khuẩn Gram âm khác E Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học coli, Samonella, Yersinia cho thấy chủng vi khuẩn đột biến gen wzz O antigen phân bố chiều dài chuỗi cách ngẫu nhiên có độc tính thấp so với chủng hoang dại Từ thực tiễn nêu trên, chúng tơi thực đề tài “Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gen wzz phương pháp knockout gen” nhằm làm sở cho việc sản xuất vaccine nhược độc phòng bệnh cho cá tra Mục tiêu đề tài - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz phương pháp knockout gen Nội dung đề tài bao gồm - Tạo dòng đoạn gen wzz E ictaluri E coli DH5a - Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46 - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzzbằng phương pháp STEP - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzzbằng phương pháp STEP - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 Loại bỏ plasmid pKD46 khỏi chủng E ictaluri đột biến gen wzz Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra Edwardsiella ictalurí thuộc giống EdwardsieUa, họ Enterobacteríaceae, Enterobacteríales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria E ictaluri vi khuẩn Gram âm, hình que, phần lớn dạng đơn, đơi dạng chuỗi, kích thước 1x - pm, khơng sinh bào tử, chuyển động nhờ tiêm mao, kị khí tùy ý, catalase dương tính, cytocrom oxidase âm [14], [21] Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri E ictaluri phân lập lần năm 1976 từ cá nheo Mỹ nhiễm bệnh [13] Chúng phát triển chậm mơi trường ni cấy Khi ni cấy mơi trường thạch BHI 28 - 300C, sau 36 - 48 giờ, vi khuẩn phát triển hình thành khuẩn lạc nhỏ tròn lồi, trơn láng đường kính - mm E ictaluri phát triển yếu khơng phát triển 370C [26], [36] E ictaluri gây bệnh nhiễm trùng máu cá nheo Mỹ [21] bệnh gan thận mủ cá tra, cá basa Việt Nam [1] Khi phẩu thuật cá bệnh thấy xuất điểm hoại tử màu trắng đục chủ yếu thận, lách, gan đường kính từ - mm Bệnh gây chết hàng loạt tỉ lệ chết cao lên đến 90% [21] E ictaluri xâm nhiễm vào cá theo đường: (1) Từ nguồn nước, vi khuẩn xâm nhập vào quan khứu giác thơng qua mũi cá mở, chúng di chuyển vào bên dây thần kinh khứu giác sau lên não Sự truyền nhiễm lan rộng từ màng não đến sọ da tạo nên lỗ thủng đầu cá (thường gọi triệu chứng “hole-in-the-head”); (2) Vi khuẩn theo đường tiêu hóa vào máu dẫn đến nhiễm trùng Các khuẩn lạc tiếp tục kiểm tra cặp mồi FpGP704/RpGP704, kết cho thấy pGP704 khơng tồn E ictaluri chứng tỏ cassette chèn vào genome E ictaluri (Hình 3.39) Cuối cùng, khuẩn lạc kiểm tra cặp mồi OF1/OR1 Kết Hình 3.40 cho thấy khơng có vạch gen wzz mà có vạch cassette HTK Như tái tổ hợp tương đồng xảy loại bỏ gen wzz hoang dại chèn vào vị trí cassette HTK Từ kết kết luận chúng tơi thu nhận chủng E ictaluri đột biến gen wzz phương pháp tiếp hợp sử dụng hệ thống enzyme tái tổ hợp X Red So với phương pháp điện biến nạp, phương pháp tiếp hợp có hiệu suất cao Điều q trình thực điện biến nạp, tế bào E ictaluri bị chết nhiều sau sốc điện dẫn đến hiệu suất biến nạp thấp Hình 3.36 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FserC/RserC gel agarose 1% Giếng 1: Thang DNA 1kb plus Giếng - 3: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 5: E ictaluri hoang dại; Giếng 5: Đối chứng-) Hình 3.37 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FKm/RKm gel agarose 1% Giếng - 2: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 3: pGP704::HTK; Giếng 4: E ictalurí hoang dại Giếng 5: Thang DNA kb plus Hình 3.38 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi WF1/WR1 gel agarose 1% Giếng - 2: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 3: E ictaluri hoang dại; Giếng 4: Đối chứng-); Giếng5: ThangDNA kbplus Hình 3.39 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi FpGP704/RpGP704 gel agarose 1% Giếng - 2: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 3: pGP704::HTK; Giếng 4: Đối chứng-); Giếng 5: Thang DNA kb plus Hình 3.40 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi OF1/OR1trên gel agarose 3.7 1% Giếng 1: Thang DNA kb plus; Giếng - 3: Khuẩn lạc tiếp hợp; Giếng 4: E ictaluri hoang dại Loại bỏ plamid pKD46 khỏi chủng E ictaluri đột biến gen wzz Sau tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz, plasmid pKD46 khơng cần thiết nên phải loại bỏ khỏi tế bào Ni cấy chủng E ictaluri đột biến gen wzz điều kiện 37oC để loại bỏ plasmid pKD46 Kiểm tra cách ni cấy mơi trường BHI chứa ampicinin Kết cho thấy chủng E ictaluri khơng mọc mơi trường chứa ampicinin chứng tỏ plamid pKD46 loại bỏ khỏi chủng E ictaluri đột biến Chương - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thử nghiệm chủng E ictaluri chúng tơi thấy rằng: - Đối với chủng E ictaluri, knockout gen phương pháp biến nạp cassette dạng thẳng khơng có kết mà cần phải sử dụng suicide plasmid pGP704 để chuyển cassette vào tế bào có hiệu - Khi sử dụng suicide plasmid pGP704 để chuyển cassette vào E ictaluri, hai phương pháp điện biến nạp tiếp hợp tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz Tuy nhiên, phương pháp tiếp hợp cho hiệu suất cao so với phương pháp điện biến nạp 4.2 Đề nghị Từ kết thử nghiệm E ictaluri, chúng tơi đề nghị khơng sử dụng phương pháp biến nạp trực tiếp đoạn thẳng vào E ictaluri Chúng tơi tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz Tuy nhiên, để sử dụng chủng E ictaluri đột biến gen wzz làm sở cho việc sản xuất vaccine nhược độc, chúng tơi đề nghị thực số bước thí nghiệm sau: - Loại bỏ gen kháng kanamycin gen chủng E ictaluri đột biến phương pháp sử dụng enzyme flippase hệ thống plasmid pKD20 - Thử nghiệm độc tính chủng E ictaluri đột biến gen wzz đối tượng cá tra TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phạm Đình Khơi (2009), Bước đầu đánh giá số thơng số di truyền làm sở cho chọn giống cá tra theo tính trạng kháng bệnh gan thận mủ, Viện Nghiên Cứu Ni Trồng Thủy Sản TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI Arias, C R., C A Shoemaker, J J Evans and P H Klesius (2003), A comparative study of Edwardsiella ictaluri parent (EILO) and E ictaluri rifampicin - mutant (RE-33) isolates using lipopolysarcharides, outer membrane proteins, fatty acids, Biolog, API 20E and genomic analyses, Journal of Fish Diseases, pp 415 - 421 Bader, J A., C A Shoemaker, P H Klesius (2004), Immune response induced byNlauroylsarcosine extracted outer-membrane proteins ofan isolate of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Fish and Shellfish Immunology, pp 415-428 Bengoechea, J A., E Pinta, T Salminen, C Oertelt, O Holst, J RadziejewskaLebrecht, Z Piotrowska-Seget, R Venho, M Skurnik (2002), Functional Characterization of Gne (UDP-N-Acetylglucosamine- 4- Epimerase), Wzz (Chain Length Determinant), and Wzy (O-Antigen Polymerase) of Yersinia enterocolitica Serotype O:8, Journal of Bacteriology, pp 4277-4287 Burrows, L L., D Chow, J S Lam (1997), Pseudomonas aeruginosa B- Vạch OAntigen Chain Length Is Modulated by WzzRol), Journal of bacteriology pp 14821489 Daniels, C (1999), characterisation of proteins involved in shigella flexneri O antigen biosynthesis, phD thesis Datsenko, K A and B L Wanner (2000), One-step inactivation of chromosomal Thị Thanh Thanh Ln van Thac genesTrần in Escherichia coli K-12 using PCR products, The Proceedings of thesí Sinh hoc National Academy of Sciences of the United States of America, pp 6640 - 6645 Doublet, B., G Douard, H Targant, D Meunier, J.Y Madec, A Cloeckaert (2008), Antibiotic markermodifications of lambda Red and FLPhelper plasmids, pKD46 and pCP20, for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistantstrains, Journal of Microbiological Methods, pp 359 - 361 Faridmoayer, A., M A Fentabil, D C Mills, J S Klassen, and M F Feldman (2007), Functional Characterization of Bacterial Oligosaccharyltransferases Involved in O-Linked Protein Glycosylation, Journal of bacteriology, pp 8088-8098 10 Franco, A.V., D Liu (1998), The Wzz (Cld) Protein in Escherichia coli: Amino Acid Sequence Variation Determines O-Antigen Chain Length Specificity, Journal of bacteriology, Vol.180, No.10, pp 2670-2675 11 Franco, A.V., D Liu, P R Reeves (1998), The Wzz(Cld) Protein in Escherichia coli: Amino Acid Sequence Variation Determines O-Antigen Chain Length Specificity, Journal of bacteriology, pp 2670-2675 12 Guo, H., W Yi, J.Shao, Y Lu, W Zhang, J Song, and P G Wang (2005), MolecularAnalysis ofthe O-Antigen Gene Clusterof Escherichia coli O86:B7 and Characterization of the Chain Length Determinant Gene, Applied and Environmental Microbiology, pp 7995-8001 13 Hawke, J P., (1979), A bacterium associated with disease of pond cultured catfish, Ictalurus punctatus, Journal of the Fisheries Research Board of Canada, pp 15081512 14 Hawke, J P., A C McWhorter, A G Steigerwalt, and D J Brenner (1981), Edwardsiella ictaluri sp nov, the causative agent of enteric septicemia of Catfish, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, pp 396-400 Thanh A DiGiandomenico, and J B Goldberg Ln van(2008), Thac sí Sinh hoc 15 Kintz,Trần E.,Thị J Thanh M Scarff, Lipopolysaccharide O-Antigen Chain Length Regulation in Pseudomonas aeruginosa Serogroup Oil Strain PA1037, The Journal of Bacteriology, pp.2709 2716 16 Lawrence, M L., R K Cooper, and R L Thune (1997), Attenuation, persistence, and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA mutant, Infection and Immunity, pp 4642-4651 17 Moore, M M., D L Ferander, R L Thune, (2002), Cloning and characterization of Edwardsiella ictaluri proteins expressed and recognized by the channel catfish Ictalurus punctatus immune response during infection, Diseases of aquatic organisms, pp 93-107 18 Murray, G L., S R Attridge, and R Morona (2003), Regulation of Salmonella typhimurium lipopolysaccharide O antigen chain length is required for virulence; identification of FepE as a second Wzz, Molecular Microbiology, pp 1395-1406 19 Najdenski, H., E Golkocheva, A Vesselinova, J.A Bengoechea, M Skurnik (2003) Proper expression ofthe O-antigen of lipopolysaccharide is essential for the virulence of Yersinia enterocolitica O:8 in experimental oral infection of rabbits, Immunology and Medical Microbiology, pp 97- 106 20 N H Thinh, et al.,(2009), Combined immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish (Pangasianodon hypophthalmus) confers protection against mortality caused by Edwardsiella ictaluri, Fish & Shellfish Immunology, pp 773-776 Plumb, J.A., and S Vinitnantharat (1989), Biochemical, biophysical, and serological homogeneity of Edwardsiella ictaluri, Journal of Aquatic Animal Health, pp 51-56 21 Plumb, J A., S Vinitnantharat, W D Paterson and K Salonius (1995), Prevention Trần of Thịsepticemia Thanh Thanh Lnaquaculture van Thac si Sinh hoc of enteric in catfish by vaccination In Diseases in Asian II M Shariff, R P Subasinghe and J R Arthur, Fish health section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines, pp 393-403 22 Saeed, M O., and J A Plumb (1986), Immune response ofchannel catfish to lipopolysaccharide and whole cell Edwardsiella ictaluri vaccines, Diseases of aquatic organisms, Vol.2, pp 21-25 23 Shoemaker, C A and P H Klesius (1997), Protective immunity against enteric septicaemia in channel catfish, ictalurus punctatus (Rafinesque), following controlled exposure to Edwardsiella ictaluri Journal of fish diseases, pp 361-368 24 Shotts, E B., et all (1996), Chondroitinase attenuated Edwardsiella ictaluri and a vaccine for prevention of enteric septicemia (es) in fish, United State Patent 25 Shotts, E B and W D Waltman (1990), A medium forthe selective isolation of Edwardsiella ictaluri, Journal of Wildlife Diseases, pp 214-218 26 Tang, K H., H Guo,W Yi, M D Tsai, P G Wang (2007), Investigation of the Conformational States ofWzz and the Wzz O-Antigen Complex under NearPhysiological Conditions, Biochemistry pp 11744-11752 27 Thune, R L., D.H Fernandez, and J.R Battista (1999), An aroA Mutant of Edwardsiella ictaluri Is Safe and Efficacious as a Live, Attenuated Vaccine Journal of Aquatic Animal Health, pp 358-372 28 Vinitnantharat, S., J A Plumb (1993), Protection ofchannel catfish Ictalurus punctatus following natural exposure to Edwardsiella ictaluri and effects of feeding antigen on antibody titer, Diseases of aquatic organisms,Vol.15, pp 31-34 29 Walakira, J K., (2008), Discovery, isolation and characteriation of bacteriophage specific for edwardsiella ictaluri, pp 30 Wise, D J., P H Klesius, Craig A Shoemaker and William R Wolters (2000), Vaccination of mixed and full-sib families of channel catfish ictalurus punctatus Trần Thị Thanh Thanh of catfish with a live attenuated Edwardsiella Ln vanictaluri Thac si Sinh hoc against enteric septicemia isolate (RE-33), Journal of the world aquaculture society, Vol.31, No.2 31 Yamamoto, S., H Izumiya, M Morita, E Arakawa, and H Watanabe (2009), Application of lambda Red recombination system to Vibrio cholerae genetics: simple methods for inactivation and modification of chromosomal genes,Gene, pp 57 - 64 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 32 http://en.wikipedia org/wiki/Lipopolysaccharide 33 http://vienthuysan2.com/index.php?do=news&act=detail&id=27 34 http://vietfish.org/20100805031247591p48c62/tac-dong-cua-vacxin-va-dapung-mien-dich-o-ca.htm http://www.oie.int/eng/normes/fmanual/manual2006/A 00029.htm PHU LUC •• Trần Thị Thanh Thanh Ln van Thac si Sinh hoc Phụ lục 1: Kết giải trình tự gen wzz mồi M13F GTC-MTGTMIACC-ACTCACTATAC-C-GCGMĨIC-GC-CCCC-ACGTCC-CÂTC-CTCCCC-C-CCC-CCATGGCC-GCCGCC-C-C-AATrCGAiTC-TCCACAiC-C-TGAC-ICAAAATCCC-A 111 IGCCCGTGGAGAATGAGCTGGATGICCGGGGGCTGTGTCGTGCGCTGTGGCACGGTAAGCCCTGGGTCGTIGGCACGGCAGCGCTGTĨIGCCGCGCTGGCGCTGGGCGTC 221 ĨCTCTGCTGATGCCGCAGAAATGGAGCGCGGCGGCGATCACTGCGAGCCCGGGCGTTAACCGTCTGGGTAGCTACIACTCCCAGCAGCAGTTTTTACG CAATCTIGCGCA 331 GGTGACTGCGCCCAGCGGCGCGGCGGCGCAUGGCAGCATCGCTGAĨGATGCGTATGCCGAGTTCACGACACAGCTGGCCTCCTAĨGACACGCGGCGCGAGĨTTT GGCTGC 441 GIAGCCCCIAINATCAGCGTCATAA:JG.AAGGGAGTGCACAGGCGGATGCGGCGCTGCTGGATGAGGTGAIIJAATCNGATCGTCTTTACGCCGGGGGAG GCGACGAAGCAC 551 AGCGATGACAGCATTCGCCCTACCGCCGACGGCGCCGCGCAGGCTACCAGCTGCTGCGCAGTACGITGCTCTGCCGGCAĨCGĨGCAGCGCCATCTGAIG CGTTCIGCGGG 661 GGCTGGGCGGGCGCAGCACCTTCTGAGGGCAGGT.AAACGTAGGAGCGTGCCAGGCATCATCACGĨAGT^CGGCTGACAĨGCGAATGCTCACAGATAC CGCTGACACGCA 771 GCATGCCTCACGTATCGCCCATTGCCCTGGCGCCGIGGTCTAIACTCGATGAICACAC Phụ lục 2: Kết giải trình tự gen wzz mồi M13R Project: PASTEUR INSTITUTE IN HCMc_ SEQ SERV_2010 System: CEQ System Sample pGEMWZZ-M13R.G0B_10082601DW Result: Copy Of pGEHWZZ-M!3R.G08_1D032601 DW Operator: MAV-29-2C09-RERUN Instrument: CEQ System (Ver 7.0.55) ACTATACICCAGCCATTAGGIGACCATAGATACTCAAGCCrATGGCẠGCCCCAAACGACGTTGGGGGAGCCTCTCCCCCẠATTGGGÏCCGAAACCCTGGCAGGGCGGG 111 GCCCGCGAATGTCCACCÏAGIGAATGTGAATGTCICAAGA1GCCGIGCACGACCGGGAAAGTGCAA1AACCGGCGACCAAGCCAGCGCACCAẠGGCGCCCCACATGTAC 221 CATTCATAAAGAGTCGGCGACGGACTATGCGCGACTTCACCGGCTCCTACCGGCGTACGACAGATAGCGATAGGGCCTGAAACCGCCGCGĨGCCCAAAACCGGCCGGAAC 331 GCCTTACAAGGGGGTGNCGTTGGAAGGCCATGCCCGGGCCCCCCCGGAAAlTTĨTTCCCCCCCGGGGGGpCCCAATTGAAAAGGTGACCAÂAATTGGGTGNCCAAIT Base Sequence: Copy of pGEMWZZ- 441 AAANGGGGAATTÍtGGGCCCGCCCAAAACCGGGGCCGACCGCCC Trần Thị Thanh Thanh Ln van Thac si Sinh hoc Phụ lục 3: Kết giải trình tự gen wzz mồi WFsq Phụ lục 4: Kết giải trình tự gen wzz mồi WRsq Phụ lục 5: Kết giải trình tự đoạn Hwzz mồi pJET1.2F : CẼŨ System MAY-29-2009-RERUN ProjưCt : PASTEUR INSTITUTE IN HCMcJEQ SERV_2C Sample : System pJETHWZZ*pJETF.C08_10082601DW ResultOperator: : Instrument : CEQ System (Ver 7.0.55; Copy of pJETHWZZ-pJETF.C08J 0082601DW TTCCSSAISSCTCSASTTTTTCASCASATSTCSACTSSTSASTCAAATCCSAĩSCCCCSTSSASAATSASCĩSGATSTCCGSSSSCrSTSTCSTGC SCTSTSSCACSGÌA ill AJwuw JJJ.W:.ac^.a-au iaauAtoaaj'-a JuAJwJw liai la_aj_ a Jtojjjtoai Jtoi aaJtoJ.toiwlto Jtolah BWWJWAJAAAI Jtoj.“ -.“.ul jtoOf.J Jtoto 221 MKSTCISSSIASCïKIAttCỴCASaSCÂSTÏÏTaCSCAAKTTSeSttSỴTSASISCSCCâSCỉCSOeSSSCSCASSSCiSCATCSCISAISA Base Sequence: Copy of pJETHWZZSSCSIAIS: 321 CSASTTCÂCGACACASCTSSCCTCCTATGACACSCGGCSCSASTTTTSGCTSCSTASCOCCTATTATCASCSTCÂTAAASAGGƠỆẠGTG CACSSAĨCCTTATCTTTCTAG 441 AAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTSCCATGGAAAATCSATGTTCTTCtTTTTATTCTCTCẰASAmrCAGGCTSIATAITAAAAACTTATA TTAASAACTAISCTAACC 551 ACCĨTCAICASSACCCSĩTISTAASĩSGGCSĩSSKĩTTTICTTSSGCAAArcCỉaCÌCCTCCẰKSAAAAAACìAACCSASCCĨAAẰAAIIAnCCC AAATTATISS! 5:1 TCCCCTCCIKSÍACCCAAACOCTTĨTAATĨT Phụ lục 6: Kết giải trình đoạn Hwzz tự mồi pJET1.2R ATSGAGATCTTCTAGAAAGATAAGGATỴGGTGGAGỵKGCrcTTIATSAGGCTGẠAATASSSSCTAGGCASGCAAAAG’ CGCSGCGGSTGTCArAGSAGSCGAKTGTG m TCGTGATCGIÌCẴTACÊCÌÌCATCAGCSAIGCKCTÊGGCCÍCCSCGCÌÍCTGSGÍGÍACTCASCTSCGCAASAĨĨGCGT AAAAACTGÌKCTGGGAGTASTASGĨA r * AArt*A r AAA«** r, A Ai"[...]... chuỗi O antigen: chuỗi O antigen dài (16 đến 35 unit) được điều hòa bởi gen wzz ; chuỗi O antigen rất dài ( > st 100 unit) được điều hòa bởi gen wzz Murray và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm trên fepE chuột với 3 chủng Salmonella enterica đột biến gen wzz biến gen wzzst ;chủng đột chủng gen wzzf E và chủng đột biến cả biến ep hai gen wzz J wzz Kết quả cho thấy chủng đột biến cả hai gen wzz Jwzz s đột. .. bởi hai gen wzzi và wzz2 Đột biến gen wzzi làm giảm sự biểu hiện của chuỗi O antigen dài, đột biến gen wzz2 dẫn đến không biểu hiện chuỗi O antigen rất dài Chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 giảm biểu hiện cả hai loại chuỗi O antigen Các chủng đột biến đã được thử nghiệm trên chuột để kiểm tra độc tính Kết quả chủng đột biến cả hai gen wzzi và wzz2 có độc lực thấp nhất Đối với chủng hoang dại, tất... (vi khuẩn đã chết) bằng phương pháp ngâm và cho ăn 2 lần thì tỉ lệ sống là 52% [20] Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh đang tiến hành nghiên cứu tạo các chủng E ictaluri đột biến nhược độc bằng phương pháp knockout gen và phương pháp sử dụng kháng sinh rifampicin Hiện nay, trung tâm đã tạo được 4 chủng E ictaluri đột biến bao gồm: Chủng E ictaluri kháng rifampicin; Chủng E ictaluri đột. .. tổ hợp X red Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 2.2.3 Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong Sơ đồ 2.1 Sơ đồ 2.1 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP 2.2.3.I Thiết kế mồi Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đoạn gen wzz của E ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để tạo cassette... với chủng đột biến: 3 (i) Chủng đột biến bị mất hoàn toàn O antigen, (ii) chủng đột biến gen wzy bị mất protein Wzy nên biểu hiện LPS với chỉ một O unit duy nhất, (iii) chủng đột biến gen wzz bị mất protein Wzz nên biểu hiện LPS với chiều dài O antigen phân bố một cách ngẫu nhiên Kết quả cho thấy chủng đột biến gen wzz có độc lực thấp nhất [19] Những kết quảnghiên cứu trên chứng tỏ chiều dài của O antigen. .. O antigen có đóng vai trò quan trọng trong độc tính của vi khuẩn [15] Chiều dài chuỗi O antigen được điều hòa bởi gen wzz Vì vậy, nhiều nghiên cứu đã tạo ra các chủng đột biến gen wzz, khảo sát sự thay đổi chiều dài chuỗi O antigen và kiểm tra độc tính để tìm ra những chủng nhược độc có triển vọng làm vaccine Đối với chủng E coli O7, đột biến gen wzy biểu hiện O antigen với chỉ 1 tiểu phần O7 antigen. .. đối với chủng đột biến cả hai gen wzz1 và wzz2 thì ở liều lượng này, chúng hoàn toàn không gây độc Chủng đột biến gen wzz1 cho kết quả giảm độc lực đáng kể Liều gây chết 50% của chủng này cao gấp 4,5 lần so với chủng hoang biến gen wzz2 có dại giảm độc lực Chủng đột nhưng không đáng kể [15] H Najdenski và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm để đánh giá vai trò của O- antigen đối với độc tính của vi khuẩn. .. knockout gen được sử dụng để bất hoạt các gen độc tính hoặc các gen cần thiết cho quá trình sinh dưỡng của vi khuẩn trong vật chủ Các chủng này vẫn có thể kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ theo con đường gây bệnh của chủng dại nhưng không đủ hoang độc để làm chết vật chủ Vì vậy, knockout gen là một phương pháp rất hữu dụng trong vi c tạo chủng vi khuẩn đột biến nhược độc Đối với vi khuẩn E ictaluri, ... ictaluri kháng rifampicin; Chủng E ictaluri đột biến gen purA; Chủng E ictaluri đột biến gen aroA; Chủng E ictaluri đột biến gen mã hóa enzyme chondroitinase Kết quả thử nghiệm độc lực của chủng đột biến gen purA (E ictaluri PAM24) cho thấy chủng này không gây chết cá ở nồng độ 3,4 x 105 CFU/ml, trong khi đó các chủng hoang dại (có ký hiệu E ictaluri ĐT và E ictaluri VL33 ) gây chết cá rất cao: 92,22%... chuỗi O antigen ngắn hơn, nhạy với huyết thanh hơn và có độc lực thấp nhất Chủng đột biến gen wzz không biểu hiện chuỗi O antigen dài, nhạy cảm với huyết thanh và có độc lực st thấp hơn so với chủng hoang dại Đột biến gen wzz không khác nhiều so với chủng hoang fepE dại [18] Ở Pseudomonas aeruginosa PAO1, chủng hoang dại chủ yếu biểu hiện hai loại O antigen dài và rất dài được điều hòa bởi hai gen wzzi ... - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzzbằng phương pháp STEP - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzzbằng phương pháp STEP - Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz phương pháp sử dụng suicide plasmid... loại O antigen dài dài điều hòa hai gen wzzi wzz2 Đột biến gen wzzi làm giảm biểu chuỗi O antigen dài, đột biến gen wzz2 dẫn đến không biểu chuỗi O antigen dài Chủng đột biến hai gen wzz1 wzz2 ... Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz phương pháp knockout gen Nội dung đề tài bao gồm - Tạo dòng đoạn gen wzz E ictaluri E coli DH5a - Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46 - Tạo chủng E ictaluri