DNA bộ gen E. ictaluri được sửdụng làm bản mẫu cho phản ứng PCRkhuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1. Sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột để khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1. Sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
2.2.1.3.Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT: :wzz) (pGEMT: :wzz)
Taq DNA polymerase có hoạt tính terminal transferase, thêm deoxyadenosine (A) vào
đầu 3 ’ của sản phẩm PCR. Hệ thống vector pGEM-T Easy được thiết kế mang một thymidine (T) ở đầu 3’của cả hai bên. T nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình nối thymidine (T) ở đầu 3’của cả hai bên. T nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tự đóng vòng của vector và cung cấp một đầu T
tương thích với đầu A của sản phẩm PCR. Nhờ vậy, phảnứng nối xảy ra dễ dàng. Thành phần phản ứng nối như sau: ứng nối xảy ra dễ dàng. Thành phần phản ứng nối như sau:
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
2.2.1.4.Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5a bằng phương pháp hóa biến nạp
Các tế bào E. coli được phát triển ở pha log. Tế bào thu được bằng cách li tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả
nạp). Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo raphức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào. Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau: