như sau:
KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG AACAAGAT GGATTGC-3’ AACAAGAT GGATTGC-3’
KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA GAACTCGTCAAGAAGG-3’ GAACTCGTCAAGAAGG-3’
2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP
Để tạo cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước phản ứng PCR (2 step PCR). Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và Km. tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và Km.
- Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn W1. WF1/WR2 để khuếch đại đoạn W1.
- Phản ứng PCR sử dụng DNA E. ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn W2. WF2/WR1 để khuếch đại đoạn W2.
- Phản ứng PCR sử dụng pKD4 làm bản mẫu với cặp mồi KF, KR để khuếch đại đoạn Km. Km.
Sau khi thu được các sản phẩm PCR lần 1, tiến hành đo nồng độ và trộnchung 3 đoạn (0,3 pmol mỗi đoạn) để làm bản mẫu cho phản ứng PCR lần 2. Phản ứng PCR chung 3 đoạn (0,3 pmol mỗi đoạn) để làm bản mẫu cho phản ứng PCR lần 2. Phản ứng PCR lần 2 sử dụng cặp mồi WF1/WR1 cho sản phẩm 2 STEP kích thước 1668 bp.
2.2.4.3. Biến nạp cassette 2 STEP vào E. ictaluri mang pKD46
Các bước biến nạp cassette 2 STEP được thực hiện như đối với cassette 1 STEP trong mục
2.2.5. Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 được tiến hành như trong Sơ đồ 2.3. hành như trong Sơ đồ 2.3.
Sơ đồ 2.3. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid
2.2.5.1. Tạo dòng E. coli DH5a chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu của gen
wzz
_____ r _ r >
_ rpl • ÁJ Ä •
a. Thiêt kê moi
Dựa vào trình tự của gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FHwzz/RHwzz để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (H wzz, kích thước 388 bp). FH wzz có trình FHwzz/RHwzz để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (H wzz, kích thước 388 bp). FH wzz có trình tự cắt của Saầ, RH wzz có trình tự cắt của BamHI và có trình tự như sau:
FH wzz. 5'-AAGTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3'RHwzz. 5'-AAGGATCCGTGCACTCCCCTCTTTATGACG-3' RHwzz. 5'-AAGGATCCGTGCACTCCCCTCTTTATGACG-3'
b. Khuêch đại và thu nhận đoạn Hwzz của E. ictaluri
DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong mục 2.2.1.2. và được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Hwzz bằng cặp mồi FHwzz/RHwzz. Sản phẩm PCR có mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Hwzz bằng cặp mồi FHwzz/RHwzz. Sản phẩm PCR có kích thước 404 bp được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz (pJET::Hwzz) (pJET::Hwzz)
Vector pJET1.2/blunt là vector mạch thẳng đầu bằng. Vì vậy đoạn Hwzz được chèn vào phải đầu bằng. Do đó, trước khi nối, phải thực hiện phản ứng cắt đuôi A của sản phẩm PCR do phải đầu bằng. Do đó, trước khi nối, phải thực hiện phản ứng cắt đuôi A của sản phẩm PCR do
Taq DNA polymerase thêm vào. Thành phần phản ứng như sau:
Trộn đều, nhẹ nhàng trong khoảng 30 giây và ủ ở 70oC trong 5 phút để bất hoạt enzyme. Sau đó, để trên đá 1 phút và bổ sung các thành phần sau để tiếp tục phản ứng nối: Sau đó, để trên đá 1 phút và bổ sung các thành phần sau để tiếp tục phản ứng nối:
pJET1.2/blunt 1 ql
T4 ligase 1 ql
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
d. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5a bằng phương pháp hóa biến nạp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
2X buffer 10 pl Sản phẩm PCR 1 pl H2O 6 pl DNA blunting enzyme 1
e. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz vào E. coli DH5a
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ. trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
Vector pJET1.2/blunt tự đóng vòng sẽ biểu hiện enzyme giới hạn gây chết sau khi biến nạp và không nhân lên được. Kết quả là chỉ có các dòng tái tổ hợp xuất hiện trên đĩa nuôi cấy nạp và không nhân lên được. Kết quả là chỉ có các dòng tái tổ hợp xuất hiện trên đĩa nuôi cấy (khuẩn lạc trắng). PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra sự hiện diện của đoạn chèn Hwzz. Cặp mồi được thiết kế hai bên trình tự MCS của pJET1.2/blunt và có trình tự như sau:
FpJET : 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3'RpJET : 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' RpJET : 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.