2.2.4. Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP
Độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp là khác nhau ở mỗi loài vi khuẩn. Đối với E. coli, Shigella, Yersinia ...chỉ cần trình tự 50 nucleotide tương đồng là đủ để khuẩn. Đối với E. coli, Shigella, Yersinia ...chỉ cần trình tự 50 nucleotide tương đồng là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn khác như Y.pseudomonas, Vibrio
cholerae... đòi hỏi phải có trình tự đoạn tương đồng dài hơn mới có thể xảy ra tái tổ hợp
tương đồng. Do đó, bên cạnh cassette 1 STEP có đoạn tương đồng 50 nucleotide, chúng tôi thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng dài hơn (400 nucleotide). Sử dụng phương thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng dài hơn (400 nucleotide). Sử dụng phương pháp 2 STEP PCR để tạo cassette 2 STEP.
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP được tiến hành như trong Sơ
Sơ đồ 2.2. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP
2.2.4.1. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự gen wzz trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp mồi WF2/WR1 để để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (W2, kích thước 405 bp). WF2 và WR2 được thiết kế gắn thêm trình tự FRT 34 nucleotide giúp loại bỏ gen kháng kanamycin ở những bước tiếp theo
của đề tài. Cặp mồi có trình tự như sau: WF2: 5 ’ GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG
CACAGGCGATCTATCAGC-3’
WR2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGC ACTCCCCTCTTTATGACG-3’ ACTCCCCTCTTTATGACG-3’
Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin của pKD4 trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi KF/KR để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. KF và KR cũng được gắn kế cặp mồi KF/KR để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. KF và KR cũng được gắn thêm trình tự FRT như trên. Sản phẩm PCR (Km) có kích thước 863 bp. Cặp mồi có trình tự như sau:
KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG AACAAGAT GGATTGC-3’ AACAAGAT GGATTGC-3’
KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA GAACTCGTCAAGAAGG-3’ GAACTCGTCAAGAAGG-3’
2.2.4.2. Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP
Để tạo cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước phản ứng PCR (2 step PCR). Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và Km. tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và Km.