- Pha loãng, trải đĩa và chọn lọc E.ictaluri đột biến trên môi trường BH I kanamycin colistin
Như vậy, chúng tôi đã thu nhận được dòng E.coli DH5a chứa plasmid pJET1.2/blunt mang cassette HTK.
(pJET::HTK)
Cassette HTK chứa gen kháng kanamycin ở giữa với hai bên là đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz. Để tạo cassette, phải thực hiện các phản ứng cắt nối để đưa đoạn gen cuối của gen wzz. Để tạo cassette, phải thực hiện các phản ứng cắt nối để đưa đoạn gen kháng kanamycin vào plasmid pJET: :HT wzz.
Các phản ứng cắt được thực hiện để chuẩn bị DNA cho phản ứng nối. Phản ứng cắt mở vòng vector pJET::HT wzz bằng BamHl cho sản phẩm cắt có kích thước 3799 bp (Hình 3.24, vòng vector pJET::HT wzz bằng BamHl cho sản phẩm cắt có kích thước 3799 bp (Hình 3.24, giếng 2). Phản ứng cắt plasmid pJET::KmR cũng bằng BamHl để thu đoạn KmR (Hình 3.23, giếng 3).
Đoạn KmR được nối với vector pJET: :HT wzz để tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang cassette HTK (pJET::HTK). Cassette HTK gồm gen kháng kanamycin ở giữa với hai mang cassette HTK (pJET::HTK). Cassette HTK gồm gen kháng kanamycin ở giữa với hai bên là đoạn đầu và đoạn cuối của gen wzz. Plasmid pJET::HTK được biến nạp vào E. coli DH5a và sàng lọc trên môi trường LB chứa ampicillin và kanamycin. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi FpJET/RpJET. Với plasmid pJET mang cassette HTK, PCR khuẩn lạc cho sản phẩm kích thước 2271 bp. Kết quả điện di trên Hình 3.25, giếng 1
cho thấy sản phẩm PCR có kích thước phù hợp. Khuẩn lạc được tách plasmid và tiếp tục kiểm tra bằng phản ứng cắt với BgHl. Kết quả điện di sản phẩm cắt ở Hình 3.26, giếng 3 kiểm tra bằng phản ứng cắt với BgHl. Kết quả điện di sản phẩm cắt ở Hình 3.26, giếng 3
cho thấy sản phẩm cắt có vạch đúng với kích thước của cassette HTK (2152 bp). Điều này chứng tỏ đoạn KmR đã được chèn vào giữa đoạn đầu và đoạn chứng tỏ đoạn KmR đã được chèn vào giữa đoạn đầu và đoạn
cuối gen wzz trong plasmidpJET1.2/blunt. pJET1.2/blunt.
Như vậy, chúng tôi đã thu nhận được dòng E. coli DH5a chứa plasmid pJET1.2/blunt mang cassette HTK. mang cassette HTK.