Plasmid pJET:: Km 10pl
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
2.2.5.4. Tạo dòng E. coli DH5a mang plasmid chứa cassette HTK (pJET::HTK)
Cassette HTK chứa gen kháng kanamycin với hai bên là đoạn đầu và đoạn cuối của gen
wzz.
a. Phản ứng cắt giới hạn
Phản ứng cắt giới hạn được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối để tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang cassette HTK. Đầu tiên là phản ứng cắt mở vòng plasmid plasmid tái tổ hợp pJET mang cassette HTK. Đầu tiên là phản ứng cắt mở vòng plasmid pJET::HT wzzbằng BamHI. Phản ứng cắt có thành phần như sau:
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Sản phẩm cắt được tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo là phản ứng cắt phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo là phản ứng cắt plasmid pJET::KmR cũng bằng enzyme BamH để thu đoạn KmR. Thành phần phản ứng cắt như trong phần g của mục 2.2.5.4. Đoạn KmR được tinh sạch qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối. NE Buffer 3 (10 X) 3 pl BamH (20 U/pl) 1 pl H2O 16 pl Plasmid JET::HT wzz 10 pl NE Buffer 3 (10 X) 3 pl BamH (20 U/pl) 2 pl H2O 15 pl
b. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET::HTK
Các sản phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để tạo plasmid tái tổ hợp pJET : :HTK. Phản ứng nối có thành phần như sau: pJET : :HTK. Phản ứng nối có thành phần như sau:
H2O 4 pl
Phản ứng nối được thực hiện ở 16oC, qua đêm.
c. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5a bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
d. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::HTK vào E. coli DH5a
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml), kanamycin (50 pg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ. trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml), kanamycin (50 pg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ.
e. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pJET::HTK. tổ hợp pJET::HTK.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.