2.2.2.3.Kiểm tra dòng tế bào E. ictaluri mang pKD6 bằng phản ứng cắt giới hạnCác khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI - ampcillin - colistin được nuôi cấy để Các khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI - ampcillin - colistin được nuôi cấy để tách plamid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI.
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
2.2.2.4.Chuẩn bị tế bào khả nạp E. ictaluri mang plasmid pKD46 bằng phương pháp điện biến nạp pháp điện biến nạp
Plasmid pKD46 sản xuất enzyme tái tổ hợp X Red. Quá trình sản xuất X Red được tăng cường khi có L - arabinose. Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp được tăng cường khi có L - arabinose. Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp
E. ictaluri::pKD46, L - arabinose được bổ sung để tăng cường sự sản xuất enzyme tái tổ
hợp.
Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp giống như trong mục 2.2.2.1. Tuy nhiên, trong quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L - arabinose đến nồng độ cuối là 10 mM. quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L - arabinose đến nồng độ cuối là 10 mM. Tế bào khả nạp được sử dụng liền để không mất hoạt tính của enyme tái tổ hợp X red. 2.2.3. Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP
Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong Sơ đồ 2.1.
Plasmid kiểm tra 10 pl
NE Buffer 2 (10 X) 3 pl
EcoRI (20 U/pl) 1 pl
Sơ đồ 2.1. Tạo chủng E. ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP
2.2.3.I. Thiết kế mồi
Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đoạn gen wzz của E.
ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để tạo cassette 1 STEP
chứa gen kháng kamamycin ở giữa với hai đầu là 2 trình tự tương đồng trên E. ictaluri. Mồi F1 bao gồm đoạn P1 là priming site 1 của pKD4 và đoạn H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz. F1 bao gồm đoạn P1 là priming site 1 của pKD4 và đoạn H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz. Mồi R1 bao gồm đoạn P2 là priming site 2 của pKD4 và đoạn H2 (50 bp) nằm bên phải gen
wzz. Cặp mồi F1/R1 có trình tự như sau:
F1: 5 ’ CGACAGGCAT ACAT GTCT AACGGCCCT AGTCGGCCAT AA AGGGAAAACCGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG-3’ AGGGAAAACCGTGT AGGCTGGAGCTGCTTCG-3’
R1: 5 ’ GCCCGCTGGCACGGATCGGCCAATTCCCTGTTAAGCGTT AACGCTGGCGCAT GGGAATT AGCCAT GGTCC-3’ AACGCTGGCGCAT GGGAATT AGCCAT GGTCC-3’
2.2.3.2. Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP
Thực hiện phản ứng PCR trên bản mẫu là pKD4 với cặp mồi F1/R1để tạo cassette 1 STEP. Sản phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Sau STEP. Sản phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và sử dụng để biến nạp vào E. ictaluri::pKD46.
2.2.3.3. Biến nạp cassette 1 STEP vào E. ictaluri mang pKD46