Phản ứng cắt có thành phần như sau:
a. Thiết kế moi
Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin (AF234296) của pCAMBlA 1300 trên ngân hàng gen NCBl, chúng tôi thiết kế cặp mồi FKm/RKm để khuyếch đại đoạn gen kháng hàng gen NCBl, chúng tôi thiết kế cặp mồi FKm/RKm để khuyếch đại đoạn gen kháng kanamycin 1219 bp. Cặp mồi này được gắn trình tự FRT và vị trí cắt của enzyme BamHl có trình tự như sau:
FKm: 5’-AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCG GAATAGGAACTTC CCAGCCAGCCAA-3 ’ GAATAGGAACTTC CCAGCCAGCCAA-3 ’
RKm: 5’-AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGT
ATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATCCAGT-3’
b.Khuếch đại và thu nhận đoạn gen kháng kanamycin từ plasmid pCAMBIA 1300
Thực hiện phản ứng PCR trên bản mẫu là plasmid pCAMBIA 3000 với cặp mồi FKm/RKm để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. Sản phẩm PCR có kích thước 1327 bp FKm/RKm để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin. Sản phẩm PCR có kích thước 1327 bp được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET 1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin (pJET::KmR) kanamycin (pJET::KmR)
Phản ứng nối được thực hiện như phần c của mục 2.2.5.1.
d. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5a bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
e. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::KmR vào E. coli DH5a
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Gen kháng kanamycin được chèn vào giúp những dòng tế bào chứa plasmid tái tố hợp có thể kháng được kanamycin. Vì vậy, tế bào giúp những dòng tế bào chứa plasmid tái tố hợp có thể kháng được kanamycin. Vì vậy, tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml), kanamycin (50 pg/ml), ủ ở 37oC trong 16 giờ.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
chèn vào vector.
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.