trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
h. Giải trình tự đoạn Hwzz
Plasmid tái tổ hợp pJET: :H wzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tự đoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET. được dùng để giải trình tự đoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET.
2.2.5.2. Tạo dòng E. coli DH5a chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối của gen
wzz_____ r _ r > _____ r _ r > _ rpl • ÁJ Ä • Plasmid pJET : :H wzz 10 pl NE Buffer 2 (10 X) 3 pl BamH (20 U/pl) 1 pl Saầ (20 U/pl) 1 pl H2O 15 pl
a. Thiêt kê moi
Dựa vào trình tự của gen wzz trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi FT wzz/RT wzz để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (T wzz, kích thước 405 bp). FT wzz có trình tự wzz/RT wzz để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (T wzz, kích thước 405 bp). FT wzz có trình tự cắt của BamHI, RT wzz có trình tự cắt của Xbal và có trình tự như sau:
FT wzz: 5 ’ -AAGGAT CCGT GGCACAGGCGATCT AT CAGC-3 ’RT wzz: 5 ’ -AATCT AGAT CAGATCCGT GCACGACG-3 ’ RT wzz: 5 ’ -AATCT AGAT CAGATCCGT GCACGACG-3 ’
b. Khuêch đại và thu nhận đoạn Twzz của E. ictaluri
DNA bộ gen E. ictaluri được ly trích như trong mục 2.2.1.2. và được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn T wzz bằng cặp mồi FT wzz/RT wzz. Sản phẩm PCR có mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn T wzz bằng cặp mồi FT wzz/RT wzz. Sản phẩm PCR có kích thước 421 bp được tinh sạch qua cột để dòng hóa.
c. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Twzz (pJET::Twzz) (pJET::Twzz)
Phản ứng nối được thực hiện như đối với đoạn Hwzz trong phần c của mục 2.2.5.I.
d. Chuẩn bị tê bào khả nạp E. coli DH5a bằng phương pháp hóa biên nạp Tế bào khả nạp được
chuẩn bị như trong mục 2.2.I.4.
e. Biên nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Twzz vào E. coli DH5a
Biến nạp đượcthực hiện như trong mục 2.2.I.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môitrường LB chứa ampicillin (50 pg/ml) và ủ ở 370C trong 16 giờ. trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml) và ủ ở 370C trong 16 giờ.
f. Kiểm tra dòng biên nạp bằng PCR khuẩn lạc
PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đoạn T wzz chèn vào vector. vector.
g. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.