Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. h. Giải trình tự đoạn Twzz Giải trình tự đoạn Twzz
Plasmid tái tổ hợp pJET : :H wzz sau khi đã kiểm tra bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt được dùng để giải trình tự đoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET. ứng cắt được dùng để giải trình tự đoạn Hwzz bằng cặp mồi FpJET/RpJET.
2.2.5.3. Tạo dòng E. coli DH5a chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu (Hwzz) và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz và đoạn cuối (Twzz) của gen wzz
a. Phản ứng cắt giới hạn
Phản ứng cắt giới hạn được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang cả hai đoạn Hwzz và T wzz. Đầu tiên là phản ứng cắt mở plasmid tái tổ hợp pJET mang cả hai đoạn Hwzz và T wzz. Đầu tiên là phản ứng cắt mở vòng plasmid pJET::H wzz bằng enzyme BamHI và Xbal. Phản ứng cắt có thành phần như sau:
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt được tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo là phản ứng cắt bằng phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo là phản ứng cắt plasmid pJET::T wzz cũng bằng enzyme BamHl và Xbal để thu đoạn T wzz. Thành phần phản ứng cắt như sau: Plasmid pJET::T wzz 10 pl NE Buffer 2 (10 X) 3 pl BamHl (20 U/pl) 1 pl Xốal (20 U/pl) 1 pl H2O 15 pl Plasmid JET::H wzz 10 pl NE Buffer 2 (10 X) 3 pl BamHI (20 U/pl) 1 pl Xốal (20 U/pl) 1 pl H2O 15 pl
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Đoạn T wzz được tinh sạch qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối. để chuẩn bị cho phản ứng nối.
b.Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz và Twzz (pJET::HTwzz) (pJET::HTwzz)
Các sản phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để tạo plasmid tái tổ hợp pJET::HT
wzz. Phản ứng nối có thành phần như sau:
Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
c. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5a bằng phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả
nạp được chuẩn bị như trong mục 2.2.1.4.
d. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz vào E. coli DH5a
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.1.5. Tế bào biến nạp được trãitrên môi trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml) và ủ ở 370C trong 16 giờ. trên môi trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml) và ủ ở 370C trong 16 giờ.
e. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pJET : :HT wzz. plasmid tái tổ hợp pJET : :HT wzz.
f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
Plasmid JET::T wzz 15 pl 1 X NE Buffer 2 (10 X) 5 pl BamHl (20 U/ pl) 2 pl Xbal (20 U/ pl) 2 pl H2O 26 pl Plasmid pJET::H wzz mở vòng 3pl Đoạn T wzz 10pl
T4 DNA ligase buffer (10X) 2pl
T4 DNA ligase (400 U/pl) 1pl
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.