Phản ứng cắt có thành phần như sau:
Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ.
Plasmid pJET::HT wzz mở vòng 3 pl
Đoạn KmR 10 pl
T4 DNA ligase buffer (10X) 2 plT4 DNA ligase (400 u/ pl) 1 pl T4 DNA ligase (400 u/ pl) 1 pl
Plasmid pJET::HTK 15 pl
NE Buffer 3 (10 X) 5 pl
Bglll (20 U/pl) 4 pl
2.2.5.5.Tạo dòng tế bào E. coli DH5a Ằpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTKa. Phản ứng cắt giới hạn a. Phản ứng cắt giới hạn
Phản ứng cắt giới hạn được thực hiện nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối để tạo plasmid tái tổ hợp pGP704 mang cassette HTK. Đầu tiên là phản ứng cắt mở vòng plasmid plasmid tái tổ hợp pGP704 mang cassette HTK. Đầu tiên là phản ứng cắt mở vòng plasmid pGP704 bằng enzyme Bgầl. Phản ứng cắt có thành phần như sau:
Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ. Sản phẩm cắt được tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol 100ođể chuẩn bị cho phản ứng nối. Tiếp phương pháp tủa với ethanol 100ođể chuẩn bị cho phản ứng nối. Tiếp
theo là phản ứng cắt plasmid pJET::HTK cũng bằng Bglll để thu cassette HTK. Thành phần phản ứng cắt như trong phần f của mục 2.2.5.5. Cassette HTK được tinh sạch qua gel agarose để chuẩn ứng cắt như trong phần f của mục 2.2.5.5. Cassette HTK được tinh sạch qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối
b. Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK
Các sản phẩm cắt sau khi thu nhận được nối với nhau để tạo plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK. Phản ứng nối có thành phần như sau: pGP704::HTK. Phản ứng nối có thành phần như sau:
Phản ứng nối được thực hiện ở 16oC, qua đêm.
c. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5a Ằpir bằng phương pháp hóa biến nạp
Tế bào khả nạp được chuẩn bị như đối với tế bào E. coliDH5a trong mục 2.2.I.4.
d. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E. coli DH5a Ằpir
Biến nạp được thực hiện như trong mục 2.2.I.5. Tế bào biến nạp được trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml), kanamycin (50 pg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ. trường LB chứa ampicillin (50 pg/ml), kanamycin (50 pg/ml) và ủ ở 37oC trong 16 giờ.
Plasmid pGP704 10 pl NE Buffer 3 (10 X) 3 pl Bglll (20 U/pl) 2 pl H2O 15 pl Plasmid pGP04 mở vòng 3pl Cassette HTK 10pl
T4 DNA ligase buffer (10X) 2pl
T4 DNA ligase (400 u/ pl) 1pl
e. Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc
PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpGP704/RpGP704 để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK. Cặp mồi có trình tự như sau: plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK. Cặp mồi có trình tự như sau:
FpGP704: 5'-GTTCCGCGCACATTTCC -3'
RpGP704: 5'-GAATTCCCGGGAGAGCTCGATA -3'f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn f. Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn. plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen.
- Phản ứng cắt giới hạn với Bgầl để kiểm tra plasmid tái tổ hợp. Phản ứng cắt có thành phần như phần a của mục 2.2.5.6.