TẠO DÒNG và BIỂU HIỆN GENE e7 HPV18 TRONG tế bào e COLI THÔNG QUA VECTOR pET 28 (a)

THỰC TẬP DI TRUYỀN LỚN TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE E7 HPV18 TRONG TẾ BÀO E.COLI THÔNG QUA VECTOR pET-28 (a) NỘI DUNG THỰC TẬP NGÀY 1: Thu nhận gene E7 HPV 18 từ tế bào Hela Tạo plasmid pET28 tái tổ hợp mang gene E7 NGÀY 2: Tạo plasmid pET28 tái tổ hợp mang gene E7 (tiếp theo), Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α NGÀY 3: Sàng lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp NGÀY 4: Tách chiết kiểm tra plasmid tái tổ hợp thu nhận phản ứng cắt giới hạn Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli BL21 (DE3) NGÀY : Hoạt hóa chủng biểu NGÀY 6: Biểu gene E7 tế bào E.coli BL21 (DE3) YÊU CẦU ĐỐI VỚI SINH VIÊN - Đọc kĩ quy trình thực tập trước buổi học - Mỗi nhóm chuẩn bị tập để làm Lab book: ghi nhận lại công việc, thiết kế thí nghiệm thực theo ngày; ý nghĩa thiết kế thí nghiệm đó; kết đạt thí nghiệm; phân tích kết (cuối khóa thực tập thu lại lab book chấm điểm) - Mỗi nhóm mang theo laptop vào ngày (13/12/2010) - Đánh giá môn học dựa trên: Báo cáo thí nghiệm (lab book), Kết thí nghiệm Bài thi cuối khóa - Vắng từ buổi trở lên cấm thi Trong thời gian học muốn xin khoảng thời gian phải làm đơn xin phép trước - Đi trễ phút coi vắng buổi học NGÀY 1: THU NHẬN GENE E7 CỦA HPV 18 TỪ TẾ BÀO HELA I Tách DNA từ tế bào HeLa  Thu dịch nuôi cấy chứa khoảng 2.106 tế bào  Ly tâm 5000rpm, 10 phút Thu tủa  Thêm vào 500µl Chelex (Lưu ý: vortex kỹ Chelex trước sử dụng)  Vortex kỹ hỗn hợp tế bào chelex phút  Ủ mẫu 75oC 10 phút  Ủ đá tan phút  Ly tâm 13000 rpm phút  Thu dịch vào eppendorf 1,5 Cẩn thận không hút phân đoạn có hạt resin  Giữ eppendorf đá  Đo OD với bước sóng 260nm 280nm II PCR thu nhận gene E7 từ DNA tế bào HeLa cặp mồi E7fNde E7rSal - Pha loãng mẫu PCR đến nồng độ 50 ng/µl TE - Thành phần phản ứng PCR (mỗi nhóm đặt phản ứng): Master mix: 12,5µl Primer: µl ddH2O: 10,5µl Sản phẩm PCR (50 ng): µl Tổng thể tích: 25 µl  Nhóm đặt thêm phản ứng sau: Master mix: 12,5 µl Primer: 1µl ddH2O: 10,5µl plasmid pet28-E7HPV18: µl Tổng thể tích: 25µl  Nhóm đặt thêm phản ứng sau: Master mix: 12,5 µl Primer: 1µl ddH2O: 11,5µl Tổng thể tích: 25µl Chương trình nhiệt phản ứng PCR 950C 940C 720C phút 30 giây 500C phút 720C phút 30 giây 2(lặp lại 35 lần)  Trộn sản phẩm PCR lại eppendorf 1,5ml  Điện di 5µl sản phẩm PCR gel Agarose 1% với hiệu điện thế: 80V 30 phút  HỎI: ý nghĩa phản ứng nhóm làm thêm? III Tinh sản phẩn PCR  Cho 260 µl TE 1X vào sản phẩm PCR  Cho 300 µl phenol:chloroform Vortex kỹ phút  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Thu hết dịch nỗi phía vào eppendorf 1,5ml  Cho thêm 1V chloroform, vortex kỹ phút  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Thu hết dịch phía vào eppendorf 1,5ml  Thêm 1/10V Sodium acetat 10X, 2V Ethanol tuyệt đối lạnh, Đảo eppendorf 4-5 lần  Ủ -20oC  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Loại bỏ dịch Nhẹ nhàng thêm 1ml Ethanol 70% lạnh Không vortex  Ly tâm 13.000 rpm phút 4oC  Hòa tủa 20µl TE 1X  Đo OD bước song 280nm 260 nm  Điện di gel Agarose 1% với hiệu điện thế: 80V 30 phút IV Xử lý plasmid pET28 (a) sản phẩm PCR gene E7 Thành phần phản ứng cắt: Vector pET-28a(+) /PCR-E7 3,0 l (600 ng) Buffer D 4,0l BSA 10X 4,0l SalI(10u/l) 1,0l NdeI(10u/l) 1,0l dH2O 25,0l Tổng thể tích 40,0l Ủ phản ứng cắt 370C Giữ -20oC đến sang hôm sau NGÀY 2: TẠO PLASMID pET28 TÁI TỔ HỢP MANG GENE E7 I Tinh sản phẩm cắt  Cho 260 µl TE 1X vào eppendorf chứa sản phẩm cắt  Cho 300µl phenol:chloroform Vortex kỹ phút  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Thu hết dịch phía vào eppendorf 1,5ml  Cho thêm 1V chloroform, vortex kỹ phút  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Thu hết dịch phía vào eppendorf 1,5ml (khoảng 200µl)  Thêm 1/10V Sodium acetat 10X, 2V Ethanol tuyệt đối lạnh, Đảo eppendorf 4-5 lần  Ủ -20oC  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Loại bỏ dịch Nhẹ nhàng thêm 1ml Ethanol 70% lạnh Không vortex  Ly tâm 13.000 rpm phút 4oC  Hòa tủa 20µl TE 1X  Đo OD bước song 280nm 260 nm  Điện di II Phản ứng nối  Công thức thiết lập phản ứng nối  Cho biết: M (kb) of insert = 0,3 kb; M (kb) of vector = 5,4 kb  Đặt hai phản ứng nối: 1) tỉ lệ nối (insert:vector) = 3:1 2) tự nối (insert:vector) = 0:1 Thành phẩn phản ứng nối 3:1 Tự nối Sp PCR 3µl 0µl Plasmid pET28 (100-200ng/µl) 1µl 1µl Buffer T4 DNA ligase10X 1µl 1µl T4 DNA ligase 1µl 1µl ddH2O 4µl 7µl Tổng thể tích 10µl 10µl Ủ 16oC, III Tạo tế bào khả nạp (PTN chuẩn bị)  Hoạt hóa ml tế bào E coliDH5 môi trường LB, qua đêm  Nuôi ml tế bào E coliDH5 50 ml môi trường LB, lắc ổn nhiệt 370C dịch tế bào đạt OD từ 0,3 -0,6  Ly tâm 5.000 vòng/phút, phút 40C để thu sinh khối  Rửa sinh khối dung dịch 25 ml CaCl2 100mM, ủ đá 30 phút  Ly tâm 5.000 vòng/phút, phút, 40C để thu sinh khối  Huyền phù lại 5ml dung dịch CaCl2 100mM  Bổ sung Glycerol đến nồng độ cuối 12%  Aliquot thành eppendorf giữ -80oC IV Biến nạp Mỗi nhóm làm phản ứng biến nạp: A B C D E Tế bào khả 100µL nạp 100µL 100µL 100µL 100µL Sản phẩm nối 3:1 Tự nối - - - pET28 nguyên - - 1µl - -  Cho sản phẩm nối vào eppendorf có sẵn 100 l tế bào khả nạp Ủ đá 30 phút  Heat shock 420C 90 giây  Ủ nước đá tan phút  Bổ sung 1ml môi trường LB vào eppendorf, ủ 37oC,  Ly tâm 10.000 vòng/ phút phút  Đổ bỏ dịch Còn lại phần tủa dịch nổi, dùng pipette huyền phù chuyển lên đĩa trải  Trải eppendorf A,B,C,D lên đĩa LB có bổ sung Kanamycin(30g/ml), eppendorf E trải đĩa LB, ủ qua đêm nhiệt độ 370C  HỎI: ý nghĩa phản ứng biến nạp thực hiện? NGÀY 3: SÀNG LỌC DÒNG TẾ BÀO MANG PLASMID pET/E7 I Sàng lọc khuẩn lạc phương pháp PCR với cặp mồi T7 promoter E7r-Sal  Quan sát ghi nhận, giải thích kết đĩa trải A, B, C, D, E  Mỗi nhóm chọn khuẩn lạc đĩa A khuẩn lạc đĩa C để thực phản ứng PCR  Thành phần phản ứng PCR: Master mix: 12,5 µl Primer: 1µl ddH2O: 11,5µl Một sinh khối khuẩn lạc Tổng thể tích: 25µl  Nhóm đặt thêm phản ứng sau: Master mix: 12,5 µl Primer: 1µl ddH2O: 11,5µl Một sinh khối khuẩn lạc E.coli DH5α mang plasmid pet28-E7HPV18 Tổng thể tích: 25µl  Nhóm đặt thêm phản ứng sau: Master mix: 12,5 µl Primer: 1µl ddH2O: 11,5µl Tổng thể tích: 25µl Chương trình nhiệt 950C 940C 720C phút 720C 30 giây phút phút 500C 30 giây 2(lặp lại 35 lần)  Điện di gel aragose 2%  Chọn khuẩn lạc cho kết PCR dương tính với insert, hoạt hóa khuẩn lạc qua đêm 5ml mơi trường LB-Kanamycin (30µg/ml)  Hỏi: ý nghĩa phản ứng nhóm làm thêm? NGÀY 4: TÁCH CHIẾT VÀ KIỂM TRA PLASMID TÁI TỔ HỢP BẰNG PHẢN ỨNG CẮT GIỚI HẠN I Tách plasmid tái tổ hợp  Ly tâm thu sinh khối 5ml dịch vi khuẩn nuôi qua đêm 5000 rpm 10 phút  Thêm 200µl dung dịch Trộn vortex  Thêm 400µl dung dịch Đảo ống 4-5 lần Ủ đá tan khơng q phút  Thêm 300µl dung dịch Đảo ống 10 lần Ủ đá 15 phút  Li tâm 13000 rpm 15 phút  Thu dịch (khoảng 500µl) vào eppendorf  Thêm 50µl Sodium acetat (1/10V), 1ml Ethanol tuyệt đối lạnh  Đảo nhẹ ống 2-3 lần ủ -20oC 30 phút  Ly tâm 13.000 rpm 10 phút 4oC  Loại bỏ dịch Nhẹ nhàng thêm 1ml Ethanol 70% lạnh Không vortex  Ly tâm 13.000 rpm phút 4oC  Phơi khô tủa 65oC  Hòa tủa 20µl TE 1X  Bổ sung 2µl RNAse (20mg/ml), ủ 37oC 30’  Điện di gel Agarose 1% 30 phút với dòng điện chiều 80V  Đo OD II Cắt plasmid hai enzyme NdeI SalI Thành phần phản ứng cắt: Plasmid tái tổ hợp 3,0 l (600 ng) Buffer D 2,0l BSA 10X 2,0l SalI(10u/l) 0,5l NdeI(10u/l) 0,5l dH2O 12,0l Tổng thể tích 20,0l 10  Ủ 37oC  Điện di tồn 20µl phản ứng cắt 3µl plasmid chưa cắt gel Agarose 1% 30 phút với dòng điện chiều 80V III Biến nạp vào E.coli BL21 (DE3) - Chọn plasmid tái tổ hợp có mang insert từ kết cắt giới hạn mục II - Biến nạp vào E.coli BL21 (DE3): Hút µl plasmid cho vào 100 µl E.coli khả nạp - Quy trình biến nạp giống quy trình biến nạp vào tế bào E.coli DH5α - Mỗi nhóm làm phản ứng biến nạp: A - B C Tế bào khả 100µL nạp 100µL 100µL Plasmid tái tổ 1µl hợp - - Trải eppendorf A,B lên đĩa LB có bổ sung Kanamycin(30g/ml), eppendorf C trải đĩa LB, ủ qua đêm nhiệt độ 370C - Hỏi: ý nghĩa phản ứng biến nạp thực hiện? 11 NGÀY 5: HOẠT HÓA CHỦNG BIỂU HIỆN IV Hoạt hóa chủng E.coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp  Quan sát, ghi nhận giải thích kết đĩa biến nạp ngày  Chuẩn bị ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng bổ sung Kanamycin (30µg/ml)  Dùng đầu típ vàng lấy mơt khuẩn lạc E.coli BL21 (DE3) mang plasmid tái tổ hợp thu đĩa LB-Kanamycin (30µg/ml) vào ngày cho vào ống nghiệm  Nuôi cấy lắc 37oC qua đêm  Nhóm hoạt hóa thêm ống từ khuẩn lạc E.coli BL21 (DE3) mang plasmid pET28 nguyên 12 NGÀY 6: BIỂU HIỆN GENE E7 TRONG TẾ BÀO E.coli BL21(DE3) I Cảm ứng biểu gene E7 IPTG  Chuẩn bị ống nghiệm/nhóm có 5ml mơi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycin (30µg/ml)  Bổ sung 400µl dịch vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp/ống  Nuôi cấy lắc 37oC OD600 dịch vi khuẩn đạt khoảng 0,6-1,0  Bổ sung IPTG 100mM vào môi trường nuôi cấy theo bảng sau: IPTG 100mM ỐNG A ỐNG B ỐNG C 54 µL 54 µL µL  Nhóm làm thêm ống hoạt hóa plasmid pET28 nguyên sau: IPTG 100mM ỐNG D ỐNG E 54 µL µL  Nuôi cấy lắc 37oC  HỎI: nồng độ IPTG sử dụng để cảm ứng biểu bao nhiêu? Ý nghĩa thiết kế thí nghiệm cảm ứng biểu hiện? II Điện di SDS-PAGE  Chuyển dịch nuôi cấy vào falcon 15ml  Ly tâm thu sinh khối 5000rpm 10 phút  Hòa sinh khối dung dịch NaCl (50mM)/EDTA (1mM) pH8.0 theo bảng sau: NaCl/EDTA ỐNG A ỐNG B ỐNG C ỐNG D ỐNG E (nhóm làm) (nhóm làm) 500 µL 250 µL 500 µL 500 µL 500 µL  Chuyển hết dịch sinh khối hòa tan sang eppendorf 1.5ml  Đem ống B sonicate 10s, lần Các ống khác giữ đá  Ly tâm ống B 13.000 rpm, 20’ Chuyển dịch sang eppendorf 1.5ml (B1) Phần cặn hòa lại 250 µL NaCl/EDTA (B2) 13  Lấy 35µl dịch ống A, B1, B2, C, D, E 7µl dung dịch nạp mẫu 6X Trộn  Đun 100oC 10 phút Spin down  Nạp mẫu vào giếng  Điện di dòng điện 100V 30 phút Sau đó, điện di tiếp tục với dòng điện 120V vạch màu khỏi gel  Nhuộm gel phân tách với thuốc nhuộm Coomasive Blue 30 phút  Giải nhuộm với dung dịch giải nhuộm gel suốt  Phân tích kết biểu ống A, B1, B2, C, D, E 14 PHỤ LỤC I II Sơ đồ cấu tạo plasmid pET28a Mã số gene E7HPV18 NCBI: AY262282 15 III Một số hóa chất sử dụng A Hóa chất dùng ni cấy cảm ứng vi khuẩn Môi trường Luria-Bertan (LB) (pH 7,0) Trypton 10 g Cao nấm men 5g NaCl 10 g Môi trường LB thạch: LB + agar 15% (w/v) Mơi trường LB-Kan: LB + Kanamycin (30 g/ml) Hóa chất dung biểu gene mục tiêu Dung dịch IPTG (isopropylthio--D-galactoside) 100mM (giữ -200C) B Hóa chất điện di Hóa chất điện di gel agarose TAE 50X Tris-HCl 242g/l Acid acetic đậm đặc 57,1ml/l EDTA 0,5M pH8 100ml/l Hóa chất điện di gel polyacrylamide - Gel polyacrylamide nồng độ 12% có thành phần sau:  Gel phân tách (separating gel) dH2O 3,3 ml Tris-HCl 1,5M pH 8.8 2,5 ml 30% acrylamide: 0,8% bisacrylamide 4,0 ml SDS 10% 0,01 ml APS 10% 0,01 ml TEMED 15l 16  Gel gom (stacking gel) - dH2O 2,8 ml Tris-HCl 1.5M pH 6.8 0,5 ml 30% acrylamide: 0,8% bisacrylamide 0,66 ml SDS 10% 0,04 ml APS 10% 0,04 ml TEMED 10l Dung dịch nạp mẫu 6X (pH=6,8) - Glycerol 30% SDS 10% (w/v) DTT 0.6 M Tris-HCl pH 6,8 0,5 M Bromophenol blue 0,012% (w/v) Dung dịch điện di SDS-PAGE 1X (giữ nhiệt độ phòng) - Tris-HCl 25 mM Glycine 200 mM SDS 0,1% (w/v) Dung dịch nhuộm gel (giữ nhiệt độ phòng) - Coomasive brilliant blue 0,625 g Ethanol tuyệt đối 112,5 g Glacial acetic 25,0 ml dH2O 112,5ml Dung dịch giải nhuộm Glacial acetic 100 ml Ethanol tuyệt đối 200 ml dH2O 800 ml 17 C Hóa chất tách chiết plasmid - Dung dịch I : Glusoce 50 mM Tris-HCl (pH8,0) 25 mM EDTA (pH 8,0) 10 mM - Dung dịch II (pha trước dùng) NaOH 0,2N SDS 1%(w/v) - Dung dịch III: pH=5,0 Potassium acetate 3,0 M Glacial acetic 0,2 M - RNAse 20mg/ml (giữ -200C) - Ethanol tuyệt đối lạnh - Ethanol 70% - Dung dịch TE 1X pH=8,0 (Tris-HCl 10,0 mM, EDTA 1,0 mM) D Hóa chất dùng cho lai Southern Blot Denhardt’s solution 100X - 2% (w/v) BSA - 2% (w/v) Ficoll - 2% (w/v) PVP (polyvinylpyrolidone) SSC 20X pH 7,0 - NaCl 3M - Sodium citratre 0,3M E CHỦNG VI KHUẨN: 18  E.coli DH5α: F–, ø80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK– , mK+), phoA, supE44, λ–, thi-1, gyrA96, relA1  E.coli BL21 (DE3): F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene ind1 sam7 nin5]) F THANG CHUẨN Thang chuaån kb DNA: Thang chuẩn unstained protein 19 ... thêm ống từ khuẩn lạc E. coli BL21 (DE3) mang plasmid pET2 8 nguyên 12 NGÀY 6: BIỂU HIỆN GENE E7 TRONG TẾ BÀO E. coli BL21(DE3) I Cảm ứng biểu gene E7 IPTG  Chuẩn bị ống nghiệm/nhóm có 5ml mơi trường... NHẬN GENE E7 CỦA HPV 18 TỪ TẾ BÀO HELA I Tách DNA từ tế bào HeLa  Thu dịch nuôi cấy chứa khoảng 2.106 tế bào  Ly tâm 5000rpm, 10 phút Thu tủa  Thêm vào 500µl Chelex (Lưu ý: vortex kỹ Chelex... 260nm 280 nm II PCR thu nhận gene E7 từ DNA tế bào HeLa cặp mồi E7 fNde E7 rSal - Pha loãng mẫu PCR đến nồng độ 50 ng/µl TE - Thành phần phản ứng PCR (mỗi nhóm đặt phản ứng): Master mix: 12,5µl Primer: