Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

Mục tiêu: Sử dụng một số chủng VSV có lợi Vi khuẩn lactỉc, nấm men tạo chế phẩm có khả năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu quả.. Probiotic là chế phẩm có bổ sung các vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về probiotic 3

1.1.1 Lược sử nghiên cứu probiotic 3

1.1.2 Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic 3

1.1.3 Cơ chế tác động của probiotic 5

1.1.4 Vai trò của probiotic 8

1.1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN 11

1.2 Sơ lược về vi sinh vật probiotic 13

A Vi khuẩn lactic 13

1.2.1 Đặc điểm hình thái 14

1.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic 14

1.2.3 Quá trình lên men lactic 16

1.2.3.1 Lên men lactic đồng hình 16

1.2.3.2 Lên men Lactic dị hình 17

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic 17

1.2.4.1 Nguồn cacbon 17

1.2.4.2 Nguồn nitơ 18

1.2.4.3 Các muối vô cơ 18

1.2.4.4 Các chất sinh trưởng 18

1.2.4.5 Oxy 19

1.2.4.6 Nhiệt độ 19

1.2.4.7 pH 20

1.2.5 ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sình học phục vụ đời sống 20 B Nấm men 21

1.3 Tổng quan về heo 24

1.3.1 Vị trí phân loại của heo 24

1.3.2 Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con 24

1.3.2.1 Đặc điểm bộ máy tiêu hóa 24

1.3.2.2 Thành phần hệ vi sinh vật đường ruột 25

1.3.3 Các bệnh đường ruột ở heo con 25

1.3.3.1 Bệnh tiêu chảy ở heo con do E coli 25

1.3.3.2 Tiêu chảy do Saimonella (Phó thương hàn) 26

1.3.4 Các biện pháp phòng và điều trị 26

1.3.4.1 Phòng bệnh 26

1.3.4.2 Điều trị 27

2.1.1 Nguyên liệu 29

2.1.2 Môi trường (xem Phần phụ lục) 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic theo phương pháp Koch [13] 29

2.2.2 Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phương pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25], [36], [37] 29

2.2.3 Định lượng axit lactic bằng phương pháp chuẩn độ Therner [12], [13], [25], [36], [37] 30 2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 30

2.2.5 Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ thạch [12], [13], [25], [36], [37] 32

2.2.6 Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic 33

2.2.7 Phương pháp bảo quản giống VK lactic bằng phướng pháp đông khô 34

2.2.8 Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch [12], [13], [36], [37] 35

2.2.9 Khảo sát sự sinh trưởng và và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang [12], [13] 35

2.2.10 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng tạo sinh khối của tế bào nấm men bằng phương pháp cân sinh khối tươi 38

2.2.11 Phương pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic [12], [13], [36], [37] 38

2.2.12 Tạo chế phẩm probiotic 39

2.2.13 Phương pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42

3.1 Phân lập tuyển chọn các chủng VSV có các đặc tính phù hợp với yêu cầu tạo chế phẩm probiotic 42

3.1.1 Phân lập và sơ bộ tuyển chọn Vklactic 42

3.1.2.Tuyển chọn các chủng VK lactic - probiotic 42

3.1.2.1 Khả năng sinh axit lactic của các chủng 43

3.1.2.2 Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định 44

3.1.2.3 Khảo sát hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh 46

3.2 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 48

3.2.1 Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2 48

3.2.2 Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng B, N4, L2 48

3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men 52

3.3.1 Khả năng đề kháng các kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae 52

3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định 53

3.3.3 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men 54

3.4 Ảnh hưởng một số điều kiện môi trường đến sự tạo thành sinh khối các chủng nghiên cứu 55

A Vi khuẩn lactic 55

khuẩn lactic 57

3.4.2.1 Nhiệt độ nuôi cấy 57

3.4.2.2 pH ban đầu 59

3.4.2.3 Nguồn thức ăn nitơ 60

3.4.2.4 Nồng độ cao nấm men 62

3.4.2.5 Nguồn thức ăn cacbon 63

3.4.2.6 Nồng độ saccharose 64

3.4.3 Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ưu 65

B Nấm men 66

3.5 Tạo chế phẩm probiotic 68

3.5.1 Đông khô các chủng VSV 68

3.5.2 Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm 68

3.5.3 Đóng gói tạo chế phẩm probiotic 71

3.6 Kiểm tra chất lượng chế phẩm 72

3.6.1 Khả năng sống sót của các chủng vsv sau quá trình đông khô 72

3.6.2 Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm 73

3.7 Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic 75

3.8 Bước đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa 76

3.8.1 Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa 76

3.8.2 Tăng trọng ở heo con sau cai sữa 78

3.8.3 Hệ số tiêu tốn thức ăn 79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 84

PHỤ LỤC i

CNSH Công nghệ sinh học

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ

Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm

probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

Mã số: CS.2005.23.92

Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Thủy Tel:0908 402 475

Email: thanhthuydhsp2000@yahoo.com

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :

1 TS Nguyễn Thị Hoài Hà, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội

2 TS Võ Thị Hạnh, Phòng Vi sinh, Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM

Thời gian thực hiện: 1 năm

1 Mục tiêu: Sử dụng một số chủng VSV có lợi (Vi khuẩn lactỉc, nấm men) tạo chế phẩm có khả năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu quả

- Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa

3 Thành quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế - xã hội):

Coordinator: Dr Trần Thanh Thủy Tel: 0908 402 475

Implementing Institution : Hồ Chí Minh city University of Pedagogy

Cooperating Institution(s):

Dr Nguyễn Thị Hoài Hà - Center of Biotechnology Việt Nam national University, Hà

Nội

Dr Võ Thị Hạnh - Institute of Tropical Biology, National center for Science and

Technology of Việt Nam

- Studies biological characteristisct of the yast and acid lactic bacteria strains

- Studies the optimal conditions for their receiving biomass

- Research on technology to produce probiotic

- To appraise the quality of products

- On first test probiotic on weaned piglings, we find good resuls

Results obtained :

+ " Lactic acid bacteria characteristics in probiotic for preventing and treatirtg the digestive disorder of pigs ", proceeding of the 20th scientfic conference Ha Noi University of Technology, 10/2006

+ "Studying some biological characteristisct of the strain Saccharomyces sp.02, Journal of science Ho Chi Minh city University of Pedagogy, 7/2006

+ Finish 1 dissertation of Biology master, 2 dỉssertation Biology bachelors

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, VK lactic và nấm men vốn nổi tiếng với vai trò quan trọng trong các thực phẩm lên men đem lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người Những năm gần đây, nhóm

VSV này được biết đến nhiều hơn với chức năng "VK probiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế

dịch bệnh cho người và vật nuôi Probiotic là chế phẩm có bổ sung các vi sinh vật sống có lợi

giúp cải thiện sự cân bằng hệ VSV tự nhiên nơi đường ruột, có khả năng cạnh tranh và đối

kháng với mầm bệnh, tiết các chất trung hòa các độc tố, tăng cường chuyển hóa thức ăn, bổ

sung các dưỡng chất (protein, khoáng, vitamin), kích thích miễn dịch trên cơ thể người cũng như vật nuôi

Trong chăn nuôi heo, bệnh tiêu chảy là căn bệnh khá phổ biến, gây thiệt hại không nhỏ đến năng suất và chất lượng sản phẩm nuôi Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh này

thường dẫn đến hiện tượng loạn khuẩn khiến tiêu chảy kéo dài cùng với những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe con người cũng như môi trường sinh thái Phương pháp hữu hiệu

nhất khắc phục tình trạng này là tái lập cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột bằng cách bổ sung

một hệ vi khuẩn có lợi mới dưới dạng các chế phẩm probiotic

Phòng bệnh bằng chế phẩm tiền sinh học hay còn gọi là probiotic nhằm tăng cường

khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu bền và an toàn sinh học

Trên thị trường hiện đang lưu hành nhiều loại chế phẩm probiotic ngoại nhập như Bye (Mỹ),

Neo-Perk-Porcine (Anh), Lacfeed 66G (Nhật), cho kết quả tốt nhưng không ổn định và giá

thành còn cao

Do đó, việc nghiên cứu sử dụng các VSV có lợi để tạo chế phẩm probiotic nhằm khắc phục tình trạng trên là việc làm hết sức cần thiết trong điều kiện hiện nay Đó cũng chính là

lý do khiến chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu : "Bước đầu nghiên cứu sử dụng các vi sinh

vật tạo chế phẩm Probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo"

Mục tiêu của đề tài:

Sử dụng một số chủng VSV có lợi (VK lactic, nấm men) nhằm tạo chế phẩm có khả năng phòng và trị bệnh đường ruột cho heo con hiệu quả

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có các hoạt tính cần thiết của một chủng probiotic

2 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV

đã tuyển chọn

3 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sự tạo sinh khối các chủng

4 Xác định tỷ lệ tổ hợp giống và tạo chế phẩm probiotic

5 Kiểm tra chất lượng chế phẩm

6 Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa

7 Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic quy mô PTN

Đề tài được thực hiện tại:

- Phòng thí nghiệm Sinh lí - Sinh hóa - Vi sinh Trường ĐHSP Tp.HCM

- Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM

- Phòng thí nghiệm CNSH và SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG

Hà Nội

- Bước đầu thử nghiệm chế phẩm tại trại chăn nuôi heo xã Đại Hải, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về probiotic

1.1.1 Lược sử nghiên cứu probiotic

Khái niệm probiotic đầu tiên được mô tả như là hệ VSV trong thức ăn bổ sung cho

người và vật nuôi

Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có

chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus" [46]

Năm 1965, thuật ngữ probiotic được đưa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô

tả những VSV có khả năng kích thích sinh trưởng của một số vật nuôi

Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trưởng của

heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46]

Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác như Lee (Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều thống nhất trong định nghĩa

: "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt

cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột" [41], [42],

[46]

1.1.2 Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic

Hiện biết có khoảng gần 20 loài VK được sử dụng trong chế phẩm probiotic Các VK

lactic có lợi giữ vai trò chính được sử dụng như L acidophỉlus, Lactobacillus delbrueckii

subs, Lactobacillus casei, L plantarum, L bulgaricus, Bifidobacterium breve,Enterococcus faecium ,

Chúng có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của VSV gây bệnh

Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho

VSV có hại phát triển Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H202, sản xuất các

enzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B1, B2, B6, B12), khử độc

đề kháng lại với tất cả các kháng sinh (trừ kháng sinh nấm) Chính vì vậy, chúng có thể tồn tại ở bất cứ nơi nào trong đường ruột của vật nuôi mà hoàn toàn không bị kháng sinh tiêu diệt [1], [11], [42], [46]

Có thể tóm tắt đặc điểm chung của VSV probiotic là :

- Có khả năng gắn vào tế bào

- Loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại

- Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh

- Tạo ra các chất chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh

- Không lan truyền rộng, không gây ung thư và không gây bệnh

L acidophilus Tăng cường sức khỏe Sữa lên men

Lactinex, Hynson (Mỹ) L bulgaricus

L acidophilus Tăng cường sức khỏe Thuốc bột

BioI, Viện Sinh học

nhiệt đới TP HCM (Việt

Nam)

L acidophilus Saccharomyces

sp

Phòng chống các rối loạn tiêu hóa, giảm tiêu hao thức ăn cho

heo

Bột mịn

Organic Green, Han

Poong (Nam Triều Tiên) L acidophilus

Phòng chống rối loại tiêu hóa, tăng cường sức khỏe

1.1.3 Cơ chế tác động của probiotic

- Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh

Khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật với liều lượng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/ngày), chúng sẽ phát triển, chiếm ưu thế và cạnh tranh với các VSV có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng, về khối lượng các chất sinh ra bởi VSV [15], [41], [42], [46]

- Sản xuất các chất kháng khuẩn

Tác nhân ức chế VK gây bệnh của VK lactic không chỉ là axit lactic mà còn bởi

những chất ức chế đặc hiệu khác như axit hữu cơ, ethanol, H 2 O 2 , diacetyl, [11], [46], [48]

Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản sinh axit lactic thì nhóm VK

lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác như axit acetic, axit formic, axit propionic, Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trường và khi pH đạt đến một mức

nào đó sẽ đủ để loại trừ những VSV gây hại trong đường ruột Chẳng hạn như các VSV gây

thối hỏng thực phẩm (B subtilis, p vulgaris, B mensenterium, Clostridum), các VSV gây bệnh như E coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thương hàn) Một số loài như Lactococcus lactis, Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H202 khi chuyển từ môi trường kị khí sang hiếu khí

H2O2 có khả năng ức chế Staphylococus aureus một loại tụ cầu vàng gây nhiễm độc thức ăn [1], [11] Hoạt tính ức chế của Diacetyl tăng lên trong môi trường axit, ức chế mạnh hơn đối

với VK G- và nấm mốc, đặc biệt với M turberculosis (VK gây bệnh lao)

- Kháng khuẩn do sinh bacteriocin

Bacteriocin của VK lactic là các phân tử protein có khả năng ức chế các VK có quan

hệ chủng loại gần với chủng VK sinh bacteriocin đó Những nghiên cứu gần đây cho thấy

một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK G+ và G-

Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt như sau : bacteriocin được hút bám

trên màng tế bào VSV nhạy cảm với nó, làm giảm thế năng của màng, gây những thương tổn

không thể khắc phục được Sau đó, chúng dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thoát các axit amin tích tụ và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngoài môi trường qua các lỗ thủng trên màng Cuối cùng, tế bào chết do mất năng lượng [41], [42], [46], [48]

Zymocin là một loại kháng sinh do một số chủng nấm men tiết ra nhằm chống lại sự cạnh tranh giữa các chủng cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần Chúng có bản chất là polipeptit hay glucoprotein Do tính chọn lọc cao nên zymocin còn có tiềm năng chống lại

một số bệnh nan y Theo Nguyễn Kim Minh Tâm (2001), Saccharomyces boulardii có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficili (gây viêm ruột kết màng giả), trung hòa nội độc tố của E coli, Vibrio cholerae nên được dùng trị tiêu chảy cấp tính cho

người

- Cân bằng hệ vi khuẩn trong đường ruột

Đã có nhiều bằng chứng cho thấy khả năng phục hồi và duy trì sự cân bằng hệ VSV

đường ruột nhờ chế phẩm probiotic có VK lactic hoặc có nấm men Khi cho bệnh nhân bị

chứng rối loạn dạ dày hay đường ruột sử dụng L acidophilus, B biỷidum và B breve sẽ làm gia tăng số lượng của Lactobacillus và giảm số lượng của E coli trong ruột Bệnh nhân sử

dụng thuốc trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số VSV có lợi trong đường ruột

nên người ta thường dùng chế phẩm có Bifidobacterium sp và L acidophilus để phục hồi hệ

VK đường ruột cho những bệnh nhân này [46]

1.1.4 Vai trò của probiotic

a Với con người

- Phòng và trị bệnh tiêu chảy, bệnh nhiễm khuẩn ở dạ dày, đường ruột

Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L reuteri sẽ làm giảm 1/2

số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cường hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể, [11], [41], [46] Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và

ít nôn mửa, không tiêu ra máu ngay sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46]

- Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa

Khi cơ thể thiếu enzym B-galactosidase, đường lactose sẽ không được tiêu hóa thành glucose và galactose và bị chuyển ngay xuống ruột già Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi những VK đường ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng Điều này gây bất lợi cho việc tiêu hóa sữa Nhưng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lượng lactose sẽ giảm đi, đồng thời enzym B-galactosidase được tăng cường nhờ VK lactic sẽ có tác dụng làm giảm đi những triệu chứng của bệnh này

- Phòng và trị một số bệnh khác

Việc sử dụng các chế phẩm Probiotic hay sữa chua với liều lượng thích hợp sẽ có khả năng chữa khỏi trên 50% số người bị táo bón, làm giảm lượng cholesterol, cải thiện tình trạng bệnh nhân bị bệnh gan mãn

tính [41], [46] Những bệnh nhân nhiễm trùng đường hô hấp và đường niệu có hàm lượng Candida ở trong phân (10 5 tế bào/g phân) rất cao Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, hàm lượng Candida sẽ giảm đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [41], [42], [46]

Các VK lactic trong chế phẩm probiotic còn có khả năng làm giảm các enzym

Nitroreductase, Azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thư thành chất gây

ung thư [11], [46] Chúng có khả năng làm thoái hóa khối u hạn chế sự giảm bạch cầu trong điều trị phóng xạ, kéo dài sự sống cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung và ung thư bàng quang [46], [48]

Bên cạnh đó, nấm men trong chế phẩm probiotic còn có khả năng cung cấp các vitamin thuộc nhóm B đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, protein giúp tăng cường sức đề kháng cho người bệnh, cho những người ăn kiêng

b Với vật nuôi

- Cải thiện tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn

Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho người sản xuất Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay nhiều chủng VK lactic có chức năng cải thiện khu hệ VSV đường ruột, nâng cao chất lượng sản phẩm, tận dụng thức ăn,

Nghiên cứu trên heo con 4 tuần tuổi và heo trưởng thành với 4 lô thí nghiệm Kết quả

thu được cho thấy, khi sử dụng L acidophilus với liều lượng 750mg/kg thức ăn đối với heo 4

tuần tuổi, đã làm cho heo tăng trọng bình quân mỗi ngày là 0,159 kg và tăng khả năng chuyển hóa thức ăn Axit

lactic giúp heo con gia tăng khối lượng cơ thể nhưng nó không có tác dụng trên heo trưởng thành [15], [42], [42], [46]

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên

heo con và heo trưởng thành [46]

Chỉ tiêu Đối chứng Lactobacillus S faecium Axit lactic

Lượng chế phẩm lấy

750mg/kg thức ăn

1250mg/kg thức ăn

220mg/kg thức ăn

Bổ sung chế phẩm Saccharomyces cerevisiae cho heo con đang bú có khả năng làm

giảm tỷ lệ tiêu chảy 4,8%, làm tăng trọng lượng heo con sau cai sữa từ 2-3% so với đối chứng

và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn trong 17ngày [ll], [42], [46] - cải thiện sự đề kháng bệnh

Khảo sát trên 312 heo con mới sinh, chia 2 lô thí nghiệm Ở lô có sử dụng chế phẩm

probiotic - VBP (B pseudolongum preparation), còn lô đối chứng không sử dụng chế phẩm

Khi sử dụng chế phẩm VBP cho heo ngay sau khi sinh với liều lượng 0,5g/ ngày, liên tục trong 10 ngày và tiến hành theo dõi bệnh tiêu chảy trong 3 tuần Kết quả là hiếm thấy bệnh

tiêu chảy ở nhóm cho ăn VBP trong suốt tuần đầu heo mới sinh Trong khi đối chứng có hơn 60% mắc bệnh tiêu chảy Hơn thế, các độc tố đường ruột do các

VK gây bệnh sinh ra có thể được trung hòa bởi probiotic Từ đó làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và giảm tỷ lệ chết trên heo con do tiêu chảy

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi [46]

Bò đực cai sữa B pseudolongum l g/ngày Giảm sự xuất hiện bệnh

tiêu chảy

Heo còn bú B pseudolongum 0,5 g/ngày Giảm sự xuất hiện bệnh

tiêu chảy, sức khỏe tốt hơn

Heo cai sữa L bulgaricus 500 ml/1l

36 g/1l

Tỷ lệ % E coli thấp ở trực

tràng, giảm tỷ lệ chết ỡ heo

1.1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN

a Những nghiên cứu và ứng dụng trong nước

Ở Việt Nam hiện nay, có thể kể đến các công trình nghiên cứu về lĩnh vực này của Viện Thú y quốc gia :

+ Yaourt và canh trùng Subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của heo con

Các nghiên cứu trên khẳng định việc sử dụng chế phẩm probiotic đều cho kết quả tốt trong phòng, trị bệnh đường ruột cũng như khả năng điều hòa và kích thích sự sinh trưởng của heo

Năm 2002, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã sử dụng chế phẩm VITOM.l và VITOM.3 của Nga trong phòng trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà Kết quả thu được là trọng lượng heo tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát (VITOM.3)

Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002), nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm

EM1 trên heo con đã cho thấy chế phẩm này có tác dụng ức chế đối với E coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Sreptococccus, Clostridium, Sarcina lutea Kết quả số lượng VK E coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và heo tăng trọng nhanh

b Những nghiên cứu và ứng dụng ở ngoài nước

Theo Lema và cộng sự (2001), để kiểm tra sự bài thải của VK E coli Q157, ông đã

trộn các VK probiotic với liều 6 x 106 CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần Kết quả cho

thấy lô 4 có sự bài thải VK E coli trong phân thấp hơn các lô khác Khác biệt này hoàn toàn

có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng probiotic

Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi Thí nghiệm được tiến hành trên

4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK B toyoi với liều 106 tế bào/kg thức ăn và lô

4 sử dụng B licheniformis với liều 106 và 107 tế bào/kg thức ăn Kết quả thí nghiệm

giữa các lô khác biệt hoàn toàn và có ý nghĩa so với lô đối chứng (P< 0,05) Ngoài ra, tăng trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn ở lô thí nghiệm cũng cải thiện hơn so với đối chứng Trong đó, lô

sử dụng 107 tế bào B licheniformis cho kết quả tốt nhất Theo Tuomola và cộng sự (1999), làm thí nghiệm dùng các VK probiotic cho thấy Lactobacillus, L johnsonii và L rhamnosus

làm giảm sự bám dính của E coli từ 90 - 91% ; riêng S typhimurium bị giảm khả năng bám

dính đến 77% bởi L johsonii và 83% bởi L casei

Mặc dù, các công trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm

có thành phần vi khuẩn probiotic khác nhau nhưng đều có chung kết luận là probitic đã ảnh hưởng có lợi trên nhiều mặt với cơ thể vật nuôi

1.2 Sơ lược về vi sinh vật probiotic

A Vi khuẩn lactic

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Scheele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa

bò lên men chua

Năm 1847, Blondeau đã công nhận axit lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản ứng lên men

Năm 1857, Louis Pasteur (Pháp) chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm VK đặc biệt gọi là VK lactic

Năm 1873, Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis) Từ đó đến nay các nhà khoa học đã phân lập

được nhiều loại VK lactic khác nhau và

công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic đã được hình thành từ năm 1881

Trong tự nhiên, VK lactic có mặt ở nhiều nơi : trong phân, rác, niêm mạc ruột, Đặc biệt có nhiều trong sản phẩm lên men chua VK lactic ngày càng được ứng dụng trên qui mô

lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus,

[1], [11], [14], [47], [50]

1.2.1 Đặc điểm hình thái

VK lactic là tên gọi của một nhóm VK thu nhận năng lượng nhờ phân giải

cacbonhydrat và sinh ra axit lactic Chúng được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae Mặc

dù nhóm VK này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả dạng que ngắn, que dài và cả

VK hình cầu), song về mặt sinh lí chúng lại tương đối thống nhất với nhau trong các đặc điểm sau :

+ Đều là VK Gram dương (G+

)

+ Không tạo thành bào tử

+ Hầu hết không di động

+ Là VSV hiếu khí tùy ý hoặc kỵ khí không bắt buộc

+ Đều thuộc loại đa khuyết dưỡng

1.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic

VK lactic bao gồm các chi : Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus và Bifìdobacteriwn Những VSV được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực

phẩm thuộc về các chi

như Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus Trong đó Lactobacillus chiếm

Lactobacillus gồm 25 loài, chia thành 3 nhóm đồng hình bắt buộc, dị hình bắt buộc, dị

hình tùy ý Các nhóm VK lactic này đều tạo ra axit lactic nhưng axit do từng nhóm tạo ra

khác nhau về cấu hình đồng phân của axit lactic Lacctobacillus được sử dụng nhiều trong

công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt cũng như trong việc tạo các chế phẩm probiotic

* Leuconostoc

Tế bào hình oval xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài Chúng có nhu cầu cao về mặt dinh dưỡng Lên men dị hình tạo axit lactic và các sản phẩm phụ như axit acetic, etanol, CO2; Có khả năng tạo hương

thơm cho bơ, sữa chua do tạo thành các chất như acetylmetyl carbinol hay acetonin [ll], [14], [47], [50]

* Bifidiobacterium

Là những trực khuẩn kị khí ; lên men lactic dị hình ; sản phẩm chính là là axit lactic

và axit acetic (tỷ lệ 3:1) cùng với một lượng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic ; khác biệt với các VK lên men lactic dị hình khác là không sinh CO2 Chúng thuộc loại ưa ấm, nhiệt độ sinh trưởng tối thích từ 310

C - 410 C [11], [14], [47], [50]

1.2.3 Quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí đường với sự tích lũy axit lactic trong môi trường Có thể tóm tắt theo phương trình sau:

Các loài VK lactic khác nhau về cơ chế lên men glucose Một vài loài VK lactic lên men đường tạo axit lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình Một số nhóm khác ngoài axit lactic còn tạo rượu và CO2, nhóm này gọi là lên men dị hình [11], [14], [47], [50]

1.2.3.1 Lên men lactic đồng hình

Các VK lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden - Meyerhof - Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90-98%) Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi

Phương trình tóm tắt:

C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP

Một số VK lên men đồng hình thường gặp là Lactococus lactis, Lactobacillus acidophilus, L.casei, L cremoris, L.helveticus, L delbrueckii, Streptococcus lactis, S thermophilus, p cerevisiae [47], [50]

1.2.3.2 Lên men Lactic dị hình

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài axit lactic (40%), còn có các sản phẩm khác như axit succinic, rượu etylic (20%), axit acetic (10%), các chất khí còn lại (20%) [14], [47], [50]

Phương trình tóm tắt:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + x Kcal

Một số VK lactic lên men dị hình thường gặp là Leuconostoc mensenteroides, Leuconostoc cremoris, L brevis, L fermentum, [11], [14], [47]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic

1.2.4.1 Nguồn cacbon

Nguồn cacbon quan trọng nhất cho VK lactic là monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit malic, axit pyruvic, Tùy từng loại VK lactic khác nhau mà ta chọn nguồn thức ăn cacbon cho phù hợp

1.2.4.2 Nguồn nitơ

Một số các VK lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ

Để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ một số ít các loài có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ hữu cơ

từ nguồn nitơ vô cơ Nitơ ở dạng axit amin hoặc peptit là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho quá trình phát triển sinh khối của VK lactic [14], [47], [50]

1.2.4.3 Các muối vô cơ

VK lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như Cu2+, Fe2+ hoặc Fe3+, K+, PO4" hoặc

PO32\ s2\ Mg2+, Mn2+, đặc biệt là Mn2+

Chính Mn2+ ngăn cản quá trình tự phân của tế bào

và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của VK lactic Đối với Lactobacillus thì Mg2+,

Mn2+, Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra axit lactic Ngoài ra, Mg2+ còn là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp VK sử dụng tốt hơn các loại đường [47], [50]

1.2.4.4 Các chất sinh trưởng

Đối với VK lactic, các chất sinh trưởng bao gồm một trong các loại như các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các axit béo, các thành phần của màng tế bào và các vitamin thông thường, Các chất này có vai trò quan trọng trong việc gia tăng sinh khối

và sinh axit lactic của các chủng VK lactic Rất ít VK lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin [14], [47], [50] Ngoài vitamin và axit amin, VK lactic còn có nhu

cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ cho sự phát triển Chẳng hạn như các axit hữu cơ như axit acetic, axit citric, axit oleic,

1.2.4.5 Oxy

Đa số VK lactic là loài hô hấp tùy tiện Chúng không có hệ enzym hô hấp xitocrom cũng như hệ enzym catalase Chúng vẫn có khả năng oxy hóa rất nhiều chất nhờ sử dụng oxy phân tử Người ta đã chứng minh được rằng hệ enzym peroxydase có trong VK lactic có thể thực hiện các chức năng thay cho hệ enzym dehyrogenase, khi đó oxy được sử dụng như là

chất nhận hydro Quá trình oxy hóa ở VK lactic thường kèm theo việc tạo thành H202 Một số

VK lactic (Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus faecaỉis, Lactobacillus brevis, ) có thể

khử được H202 thành H20 cùng với sự tham gia của một số chất bị oxy hoa [11], [14], [47], [50]

C - 450C được gọi là VK

ưa nhiệt Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 200

C- 400C được gọi là loại ưa

ấm [14], [47], [50] Các VK lactic sống trong đường ruột người và động vật hầu hết thuộc loại ưa ấm

1.2.4.7 pH

Hoạt động của VK lactic, đặc biệt là hệ enzym của chúng, chịu tác động mạnh của

pH Mỗi enzym đều có vùng pH tối ƣu mà tại đó hoạt lực của enzym là mạnh nhất Đa số các

VK lactic có pH tối ƣu cho sự phát triển là 5,5 - 6,2 (Lactobacilius) ; 5,5 - 6,5 (Pediococcus) ; 6,3 - 6,5 (Leuconostoc) Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống VK lactic có thể chịu đƣợc là khác nhau Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu đƣợc pH = 3,2 -3,5 ; Pediococcus có thể chịu

đƣợc pH = 3,5 - 4,4

Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các loại

VSV khác Sau đó khi lƣợng axit tích lũy đủ lớn thì chính VK lactic cũng bị ức chế Sự axit

hoa tế bào chất gây ra sự tích lũy nội bào axit lactic Chính axit lactic lại là một chất ức chế, đặc biệt là khi nó ở dạng không phân ly Axit lactic là một axit có độ phân ly trung bình (pKa

Trong chăn nuôi, người ta sử dụng VK lactic để ủ chua thức ăn gia súc Trong quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có một số chất có giá trị như chất thơm, vitamin, kháng

sinh, Do đó, thức ăn gia súc ủ chua rất có giá trị về mặt dinh dưỡng, góp phần làm tăng

năng suất trong chăn nuôi Một số chủng VK lactic thường dùng là L plantarum, Leuconostoc mesenteroides

Hiện nay có rất nhiều các chế phẩm probiotic ra đời để phục vụ cho chăn nuôi Khi

đưa probiotic vào đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm, các VSV có lợi sẽ nhanh chóng phát triển và nhân nhanh số lượng, tạo môi trường axit ở ruột non và ruột già, tiết ra các chất

kháng sinh làm ức chế và tiêu diệt các VSV có hại, không cho chúng phát triển Từ đó, làm

giảm các bệnh về đường tiêu hoa như tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, hoại thư, táo bón, Ngoài

ra, chúng còn tiết ra các axit hữu cơ và các enzym tiêu hóa như protease, pectinase, làm

tăng hệ số chuyển hóa thức ăn ở gia súc, gia cầm [11], [14], [47], [50]

Cùng với các biện pháp hóa học, các chế phẩm sinh học cũng ra đời để phục vụ cho

trồng trọt Các chế phẩm gây tiếng vang mạnh mẽ hiện nay là chế phẩm EM hay chế phẩm vi

sinh hữu hiệu Chế phẩm này được coi là có hiệu quả rất mạnh trong việc cải tạo đất, tăng

năng suất cây trồng và giải quyết các vấn nạn về ô nhiễm môi trường Quan trọng là VK lactic không tạo ra các sản phẩm độc hại cho các VSV sống chung trong chế phẩm cũng như

cho môi trường sống và cây trồng [11], [14], [47], [50]

B Nấm men

Nấm men là đại diện của VSV nhân chuẩn Chúng có dạng hình cầu, hình trứng, hình

ovan, hình elip, Một số nấm men có khả năng hình thành khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả Kích

thước trung bình 3-5x5- 10 micromet Cấu tạo TB nấm men gồm :

Thành tế bào dày 25nm, cấu tạo bởi glucan, manan cùng với khoảng 15% protein ở

hầu hết nấm men Chức năng của thành là bảo vệ hình dạng, duy trì áp suất thẩm thấu, điều

hòa quá trình trao đổi chất tế bào

Màng tế bào cấu tạo như màng cơ bản với độ dày 75 - 80nm Chức năng của màng

điều hòa quá trình trao đổi các chất qua màng Bên trong màng là khối tế bào chất chứa các bào quan như riboxom, ti thể, không bào, mạng lưới nội chất, thể Golgi cùng với các chất dự trữ

Riboxom có 2 loại 70S chứa trong ti thể, 80S phân bố tự do trong TBC Riboxom là

nơi tổng hợp protein cho TB

Ti thể hình elip, cấu trúc màng kép, cấu tạo protein và lipit và các hạt cơ bản Ti thể là

trung tâm hô hấp và giải phóng năng lượng cho TB

Không bào là những khoang nhỏ được bao bởi màng mỏng bên trong chứa dịch bào

với thành phần gồm protit, lipit, gluxit, các chất khoáng Vai trò của không bào điều hòa áp

suất thẩm thấu của tế bào

Mạng lưới nội chất gồm 2 loại là mạng lưới nội chất có hạt và mạng lưới nội chất

không hạt Đó là hệ thống các túi dẹt, ống phân nhánh, thông với nhau và có vai trò tích cực

trong quá trình trao đổi chất của tế bào

Thể Golgi gồm nhiều túi nhỏ dẹt không thông với nhau Chức năng thể này là sắp xếp,

bao gói, phân loại, chọn lọc các đại phân tử và chuyển đến những nơi cần thiết

Nhân của nấm men có cấu tạo điển hình với màng nhân và nhân con Nhân thường có

hình cầu hay bầu dục, đường kính 2 micromet Thành phần hóa học của nhân gồm protein,

ADN, ARN, các enzim Trong thể nhiễm sắc ADN liên kết với protein histon tạo thành

những sợi nucleoprotein dày khoảng 10nm Nhân tham gia điều khiển mọi hoạt động sống

của tế bào

Thành phần hóa học của nấm men như sau: protit từ 45 - 54%, gluxit 25-35%, lipit

1,5 - 5%, các chất khoáng từ 6 - 12% gồm cả các yếu tố đại lượng và vi lượng Protit nấm

men có giá trị sinh học rất cao vì chứa tất cả các axit amin không thay thế Về trữ lượng axit

amin không thay thế thì protit nấm men gần với protit động vật Về giá trị dinh dưỡng nấm

men không thua kém bột cá, bột thịt Ngoài ra, nấm men còn chứa rất nhiều VTM nhóm B

(mg/ khối lượng khô) gồm B1 - 156,0; B2 - 100; B3 - 100; B4 - 710; B6 - 20; PP - 22, H -

0,6; axit folic - 13 Các loài nấm men như Sac cerevisiae, Sac uvarum chứa nhiều vitamin

D2 và D3 Đặc biệt VTM nấm men có hoạt tính gấp 2 - 3 lần VTM tổng hợp

Nấm men sinh sản vô tính chủ yếu bằng nảy chồi, số ít sinh sản bằng phân đôi Sinh

sản hữu tính bằng bào tử túi

Chúng có thể phát triển tốt trong môi trường ở nhiệt độ 20 - 400C; pH: 4-6; hàm lượng

oxy 10-15 mmol/l/h với nồng độ đường thích hợp 10 - 20% VTM nhóm B, các nguyên tố

khoáng như P, K, Cl, Mg, Ca, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của nấm men Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, bề mặt trái cây, lá, hoa hay các cây lương thực

và thực phẩm khác Trong điều kiện yếm khí chúng lên men đường tạo thành

rượu, còn trong điều kiện hiếu khí chúng tạo thành sinh khối tế bào Chính vì vậy, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, trong nông nghiệp, y tế và đời sống Do thành phần dinh dưỡng phong phú và có giá trị nên sinh khối

nấm men thường được bổ sung vào nguồn thức ăn cho người và gia súc hoặc sản xuất các chế

phẩm sinh học phục vụ đời sống, chăn nuôi và trồng trọt

1.3 Tổng quan về heo

1.3.1 Vị trí phân loại của heo

Loài : Sus domesticus

1.3.2 Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con

1.3.2.1 Đặc điểm bộ máy tiêu hóa

Heo con mới sinh, sự tiết các enzym tiêu hóa ở dạ dày và ruột non còn yếu, chỉ đủ sức

tiêu hóa các loại thức ăn đơn giản, dễ tiêu như sữa mẹ Khả năng tiết HCL của dạ dày rất ít,

chỉ đủ để hoạt hóa men pepsinogen thành pepsin, lượng axit tự do quá ít, không đủ làm tăng

độ toàn của dạ dày Do pepsin hoạt động yếu, sự tiêu hóa protein sữa phải nhờ enzym trypsin của tuyến tụy Trong 2 tuần tuổi đầu tiên, heo con không có enzym amylase của tuyến tụy

Amylase của tuyến nước bọt tiết nhiều nhất vào lúc 2 - 3 tuần tuổi, sau đó giảm 50% Trước

20 ngày đến một tháng tuổi,

dạ dày heo con hầu như không tiêu hóa được protein thực vật Do vậy, vi khuẩn bất lợi theo

đường miệng có khả năng sống sót ở dạ dày, phát triển ở ruột non và gây ra tiêu chảy Số lượng và hoạt tính của các enzym tiêu hóa sẽ tăng dần theo ngày tuổi và đến tuần thứ 7 mới đạt được mức độ như heo trưởng thành [15], [16], [17]

1.3.2.2 Thành phần hệ vi sinh vật đường ruột

Khi heo mới sinh, hệ VSV đường ruột chưa có hoặc có rất ít Nhờ quá trình bú mẹ và

liếm láp trên nền chuồng mà VSV từ bên ngoài đã dần đi vào đường tiêu hoa của heo con

Hầu hết VSV từ bên ngoài đi vào đường tiêu hóa sẽ bị tiêu diệt và thải ra ngoài Một số ít

thích nghi được sẽ sinh sản, phát triển và tạo thành hệ VSV đường ruột và được chia làm 2 loại:

+ Loại VSV tùy nghi thay đổi tùy theo thức ăn, môi trường đường tiêu hóa, sức đề kháng của cơ thể, như nấm men, nấm mốc, Proteus, Salmonella, Klebsiella, E coli,

Clostridium, Shigeỉla, đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm [15],

[16], [17]

+ Loại VSV bắt buộc thích nghi với môi trường dạ dày - ruột và tham gia phân giải

các chất dinh dưỡng Chẳng hạn như VK lactic, VK sản sinh amylase và protease, một số VK

tổng hợp vitamin nhóm B Các VSV gây thối rữa lại là nguồn gây bệnh đường ruột (E Coli)

cho vật nuôi [15], [22], [23]

1.3.3 Các bệnh đường ruột ở heo con

1.3.3.1 Bệnh tiêu chảy ở heo con do E coli

- Nguyên nhân : Có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy ở heo con như do bộ máy

tiêu hoa của heo con phát triển chưa hoàn chỉnh, do điều

kiện chăm sóc, nuôi dưỡng kém, không được bú sữa mẹ, do heo con bị nhiễm lạnh, do bú quá

nhiều làm cho thức ăn không tiêu, do không được cung cấp đầy đủ chất sắt, vệ sinh chuồng

trại kém làm cho mầm bệnh xâm nhập vào đường tiêu hóa gây tiêu chảy ở heo con Nguyên

nhân chủ yếu do các VK gây bệnh như E coli và Salmonella choleraesuis [15], [22], [23],

[32]

1.3.3.2 Tiêu chảy do Saimonella (Phó thương hàn)

Thời gian nung bệnh 3-4 ngày Tỷ lệ heo con theo mẹ và sau cai sữa mắc bệnh cao

hơn các lứa tuổi khác Thể viêm cấp tính xảy ra trên heo con theo mẹ với các triệu chứng như tiêu chảy phân vàng, nhiều nước, sốt vừa (40,60 C- 41,50 C), sau vài ngày vi trùng xâm nhập

vào phổi gây viêm phổi, có thể thấy xuất huyết ở vùng da mỏng sau 5-6 ngày mắc bệnh, heo

con suy nhược nặng, nằm liệt, có thể co giật nhẹ rồi chết, tỷ lệ chết có thể lên đến 100% [15], [22]

1.3.4 Các biện pháp phòng và điều trị

1.3.4.1 Phòng bệnh

Phòng bệnh cần phải chú trọng đến sự giảm tỷ lệ ô nhiễm E coli cường độc ở môi

trường xung quanh bằng chế độ vệ sinh tiêu độc tốt, duy trì điều kiện chăn nuôi thích hợp, đồng thời bảo đảm miễn dịch cao Một trong những yếu tố quan trọng nhất để phòng bệnh

tiêu chảy do E coli là duy trì cho heo con môi trường thích hợp (320 C - 340 C đối với heo chưa cai sữa và 280

C - 300 C cho heo vừa mới cai sữa) Khẩu phần ăn cần được cải tiến nhằm

giảm sự khu trú E coli trong ruột Việc bổ sung axit lactic vào

nước uống có thể làm giảm độ pH trong dạ dày và sẽ ức chế sự nhân lên nhanh chóng của

VK E coli gây bệnh

1.3.4.2 Điều trị

a Điều trị bằng kháng sinh

Trong thực tế rất nhiều loại kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh tiêu chảy do

E coli, Salmonella, cầu trùng, như ampicillin, tetracyclin, chloramphenicol, cephalothin,

gentamicin, neomicin, Nguyên nhân hiệu quả thuốc kháng sinh bị giảm là do sự nhờn

thuốc của VK đường ruột Ngoài kháng sinh có thể dùng các chế phẩm sulíamid và nitrofuran

để điều trị Tuy nhiên việc điều trị bằng kháng sinh dài ngày thường dẫn đến tiêu chảy kéo dài do sự mất cân bằng sinh thái của hệ VSV đường ruột cùng với dư lượng kháng sinh tồn

dư trong sản phẩm gây hậu quả khôn lường cho sức khỏe người dùng

b Điều trị bằng các chế phẩm probiotic

Trong đường ruột của động vật, hệ VSV luôn ổn định sẽ bảo đảm trạng thái cân bằng cho hoạt động của đường ruột Khi hệ VSV đường ruột được cân bằng thì những VSV có lợi,

phần lớn là VK lactic chiếm đến 90%, hoạt động hữu ích cho đường ruột Nếu sự cân bằng bị

phá vỡ thì những VK có hại cạnh tranh phát triển, gây rối loạn đường tiêu hóa, gây tiêu chảy

Loại VK thường gặp là E coli, Enterococcus, Clostridium, Proteus,

Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã chế nhiều chế phẩm khác nhau từ

các VK hữu ích - nhóm VK lactic và chủ yếu là từ Lactobacillus Đôi khi, người cũng bổ

sung thêm nấm men vào các chế

phẩm này nhằm cung cấp thêm nguồn vitamin, protein, tạo sự cân bằng cho hệ VSV đường

ruột

Các chế phẩm probiotic dùng trong gia súc có thể được đưa vào cơ thể dưới dạng

nước Ở nước ta, các chế phẩm B subtilis, yaourt, men tiêu hóa, biolactyl đều là dạng thuốc

nước dùng cho gia súc uống Chế phẩm probiotic cũng có thể được chế tạo thành dạng bột hoặc dạng hạt để trộn vào thức ăn

Tóm lại, việc sử dụng chế phẩm probitic trong chăn nuôi ngoài khả năng phòng, trị

tiêu chảy mà còn đem lại nhiều lợi ích khác trên nhiều mặt ở vật nuôi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Nguồn phân lập từ các loại thực phẩm lên men lactic, các chế phẩm men tiêu hóa

như Lactéol fort, Lactomin plus, Untra levure

Các chủng VK kiểm định : Santeu sp., Streptococcus sp., B subtilis, B pimitilis,

Prabli sp., Sal typhimurium, Sar lutea, Serratia sp., Shi flexneri, Klebsiella sp., Enterococcus sp, E coli, Sai choleraesuis do Trung tâm Công nghệ Sinh học ĐHQG Hà Nội

và Viện Pasteur Tp.HCM cung cấp

Enzym -amylase và protease do Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM cung cấp Đĩa giấy kháng sinh chuẩn do Công ty TNHH Nam Khoa cung cấp

2.1.2 Môi trường (xem Phần phụ lục)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic theo phương pháp Koch [13]

2.2.2 Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phương pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25], [36], [37]

Dựa vào đặc tính của chủng VK lactic trên MT cacbonat - agar là CaCO3 sẽ tan khi tác dụng với axit lactic tạo nên vòng trong suốt xung quanh mỗi khuẩn lạc Xác định khả năng sinh axit lactic sau 4 ngày bằng hiệu số (D - d, mm)

D : Đường kính vòng phân giải CaCO3

T = số ml NaOH x 10

% axit lactic = 0T x 0,009

(0T: Độ Therner, 1 độ Therner tương ứng với 0,00 9g axit lactic)

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

2.2.4.1 Các đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic

* Quan sát hình thái khuẩn lạc [12], [13], [36]

* Quan sát hình thái tế bào bằng tiêu bản nhuộm Gram [12], [13], [36]

2.2.4.2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá [12], [13, [36], [37]

Nguyên tắc : Dựa vào sự chuyển hóa màu của dịch nuôi cấy để đánh giá phản ứng dương tính hay âm tính với các đối tượng nghiên cứu

Tiến hành : dựa vào khóa phân loại của Bergey’s, với các chỉ tiêu cơ bản sau :

* Khả năng di động;

* Kiểu hô hấp;

* Hoạt tính catalase;

* Thủy phân tinh bột, cazein;

* Khả năng sinh khí từ glucose;

* Nhiệt độ;

* pH ban đầu, nồng độ muối thích hợp cho sự phát triển;

* Khả năng axit hóa môi trường;

* Khả năng lên men các loại đường

Căn cứ vào khả năng lên men một số loại đường tạo thành axit lactic của VK Sự có mặt của axit lactic sẽ làm thuốc thử phenol trong MT từ màu đỏ chuyển thành màu vàng

Pha chế các MT - MRS trong đó glucose được thay bằng các loại đường cần nghiên cứu : saccharose, maltose, galactose, lactose, sorbitol, dextrin Điều chỉnh pH MT hơi ngả về kiềm, có bổ sung chất chỉ thị màu đỏ phenol, khử trùng 1 atm Bổ sung 1% (v/v) dịch VK vào

MT ứng với những nguồn cacbonhydrat khác nhau Nuôi cấy tĩnh ở 300 C/2 ngày Nếu VK lên men loại đường nào thì chúng sẽ sinh axit làm pH của MT đó giảm và có màu vàng

* Xác định các dạng đồng phân của axỉt lactic được tạo ra bằng enzim

Xác định các dạng đồng phân của axit lactic cho biết những thông tin quan trọng để

xác định tên loài đặc biệt là các loài thuộc chi Lactobacilus Phần lớn các loài thuộc chi này

có dạng đồng phân của axit lactic là L-LDH Sử dụng bộ kít F-kit (Beolinger Manheim Co Ltd, Germany) để xác định các đồng phân của axit lactic Phương pháp này cần có máy đo

quang phổ ở bước sóng 254 nm

* Xác định axit diaminopimelic của vi khuẩn

Nguyên tắc : Ninhydrin phản ứng với nhóm - NH2 của xit diaminopimelic ở 1000 C tạo ra các sản phẩm có màu tím đỏ

Tiến hành : Cho khoảng 50mg tế bào ướt vào ống thủy tinh có nút vặn Thủy phân TB bằng ống nghiệm có 1 ml 6N HC1 ở 1000 C tại nồi ổn nhiệt khô Làm lạnh dịch thủy phân tới nhiệt độ phòng

Bổ sung 2ml nước cất vô trùng Loại bỏ phần cặn bằng giấy lọc Chấm chừng 3ml dung dịch lên giấy sắc ký bản mỏng Dùng 1 microlit của 0,01M DL-diaminopimelic axit làm dung dịch chuẩn Đặt sắc ký bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50ml hỗn hợp methanol - nước - 6N HC1 - piridin (80 : 26 : 4 : 10) trong 3 giờ hoặc lâu hơn Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (để nhận biết các axit amin trong nước bão hòa n-butanol) lên giấy sắc ký bản mỏng, đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000 C trong 5 phút vết DAP - isome tách rời, xuất hiện trên giấy màu tím đỏ L-isome (Rf 0,29), DAP - isome (Rf 0,24) và xuất hiện chậm hơn axit amino khác chạy nhanh hơn so với các meso- isome (Rf 0,37 - 0,80)

2.2.5 Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định bằng phương pháp khoan lỗ thạch [12], [13], [25], [36], [37]

Dựa vào sự khuyếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi cấy vào MT thạch, chỗ nào

có chất ức chế khuyếch tán nơi đó VSV kiểm định không mọc được và tạo thành vòng vô khuẩn

Hoạt tính ức chế được đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm)