B. Nấm men
3.5.2. Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm
3.5.2.1. Chế phẩm P-SP-01
Mục đích của việc phối trộn các chủng nhằm phát huy cao nhất thế mạnh từng chủng và sự tƣơng tác hỗ trợ giữa các chủng trong chế phẩm.
Hình 3.8. Đông khô 3 chủng VK lactic (a) và chủng Sac. cerevisiae (b)
Tiến hành phối trộn ba chủng B, L2 và N4 theo tỷ lệ khác nhau : 1:1:1, 2:1:1, 1:2:1, 1:1:2 (v/v). Khảo sát hoạt tính đối kháng của từng tỷ lệ với một số chủng VK kiểm định bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch. Tỷ lệ nào có khả năng kháng khuẩn cao nhất sẽ đƣợc chọn sử dụng. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các chủng VK kiểm định (D - d, mm)
Tỷ lệ phối trộn VK Kiểm định
Khả năng đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với Vk kiểm định (D - d, mm) 1:1:1 2:1:1 1:2:1 1:1:2 E. coli 15 15 19 14 S. typhimurium 14 14 15 13 S. choleraesuis 25 20 29 19 Serratia sp. 11 12 17 15 Streptococcus sp. 26 28 31 29 Bacillus subtilis 25 25 28 24
* Nhận xét
Trong 4 tổ hợp phối trộn trên, chúng tôi nhận thấy tổ hợp 1:2:1 có hoạt tính đối kháng với các VK kiểm định cao nhất (D - d = 17 - 31mm) so với 3 tổ hợp còn lại (D - d = 11 - 29mm). Khả năng đối kháng mạnh nhất với Streptococcus sp. (D - d = 31mm), S.
choleraesuis (D - d = 29mm) và khá mạnh với E. coli (D - d = 19mm) là 3 chủng VK gây bệnh đƣờng ruột phổ biến ở gia súc nhƣ heo. Theo chúng tôi, tỷ lệ phối trộn này (1 : 2 : 1) có tác dụng tốt trong việc duy trì hoạt tính đối kháng các VK kiểm định nên đƣợc chọn để tạo chế phẩm probiotic.
3.5.2.2. Chế phẩm P-SP-02
Thành phần gồm sinh khối 3 chủng VK lactic, enzim amylase và protease có bổ sung thêm sinh khối nấm men Sac. cerevisae.
Để xác định tỷ lệ phối trộn giữa sinh khối VK lactic và nấm men, chúng tôi khảo sát các tỷ lệ theo thứ tự 1 : 1; 1 : 1,5; 1,5 : 1 và 1: 2. Kết quả ghi trong bảng sau:
Bảng 3.12. Khả năng đối kháng VK kiểm định của các tỷ lệ phối trộn
Vi khuẩn kiểm định
Khả năng đối kháng VKKD của các tỷ lệ phối trộn ( D - d, mm)
1 :1 1:1,5 1,5:1 1:2
E. coli 23 30 26 24
S. choleraesuis 21 27 25 22
Tổ hợp giống đƣợc chọn để tạo chế phẩm P-SP-02 là 1 : 1,5 (VK lactic/nấm men) vì tỷ lệ này cho giá trị hoạt tính kháng khuẩn cao nhất, cao hơn cả khi chƣa phối trộng các chủng.
S. choleraesuis E. coli
Hình 3.9. Khả năng đối kháng với VSV kiểm định của tổ hợp giống (VK lactic/nấm men) 1 : 1,5 3.5.3. Đóng gói tạo chế phẩm probiotic
Trộn sinh khối Lac. agilis : Lac. acidophilus : Lac. salivarius theo tỷ lệ 1 :2 :1.
Enzim a amylase và protease do viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp đã dƣợc kiểm tra hoạt tính trƣớc khi sử dụng. Phối trộn 2 loại enzim trên theo tỷ lệ 1: 1. Tỷ lệ enzim này đã đƣợc tham khảo một số sản phẩm probiotic trên thị trƣờng và các công trình nghiên cứu trong đó có chế phẩm Biol của Viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh. Hoạt tính của enzym a-amylase đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp Smith & Roe, kết quả đạt 1453,963 UI (mg tinh bột/g/phút). Hoạt tính của enzym protease đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp Anson cải tiến, kết quả đạt 21.867 Anson ( mol Tyrosin/g/phút). Theo Nguyễn Lân Dũng và Lê Ngọc Tú (1982), các thông số khảo sát hoạt tính của enzym -amylase và protease nhƣ trên là khá cao và sẽ có tác dụng tốt trong chăn nuôi.
Sinh khối 3 chủng VK lactic trộn với sinh khối nấm men theo tỷ lệ 1:1,5. Các nguyên liệu đƣợc đƣa vào máy trộn siêu tốc và tự động đóng gói chế phẩm trong bao nhôm với trong lƣợng 25g/gói.
* Chế phẩm probiotic P-SP-01 gồm : - Sinh khối 3 chủng VK lacti : 10g
- Enzim a amylase và protease(tỷ lệ 1:1) : 15g * Chế phẩm probiotic P-SP- 02 gồm :
- Sinh khối 3 chủng VK lactic và nấm men : 10g - Enzim protease, amylase (tỷ lệ 1:1) là : 15g Bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ phòng hay trong tủ lạnh (40C).
Thành phần Sacchoromyces sp.02 6g Laclobacillius sp.B 1g Laclobacillus sp.L2 2g Lactobacillus sp.N4 1g Protease 7,5g Amylase 7,5g Công dụng
Phòng trừ tiêu chảy cho heo Cách dùng
Bổ sung lg/kg thức ăn Trọng lƣợng tịnh: 25
Hình 3.10. Chế phẩm probiotic P-SP-02
3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm
Để kiểm tra chất lƣợng chế phẩm chúng tối khảo sát các chỉ tiêu sau :
3.6.1. Khả năng sống sót của các chủng vsv sau quá trình đông khô
Chất lƣợng và hiệu quả sử dụng chế phẩm phụ thuộc rất nhiều vào khả năng sống sót của các chủng VSV đƣợc sử dụng trong các chế phẩm sau thời gian bảo quản.
Bảng 3.13. Khả năng sống sót của các chủng VSV sau quá trình đông khô
Ký hiệu chủng Mật độ tế bào (CFU/g)
Trƣớc đông khô
Sau 30 ngày Sau 60 ngày Sau 90 ngày
Chủng B 2,76 x 1010 2,26 x 1010 9,28 x 109 6,22 x 109
Chủng N4 3,34 x 1010 2,91 x 109 9,70 x 109 7,85 x 109
Chủng L2 3,37 x 109 2,66 x 109 9,44 x 109 6, 81 x109
Sac. sp 02 9,44 x 107 85,71 x107 67,04 x 109 6, 92 x 109 Sau 30 ngày số lƣợng tế bào của các chủng B, N4 và L2 thay đổi không đáng kể. Sau 60 ngày, đặc biệt sau 90 ngày đông khô, số lƣợng tế bào của các chủng tuy có giảm song vẫn đạt trên 109
tế bào/1g chế phẩm. Điều đó chứng tỏ khả năng sống sót của các chủng VK nghiên cứu là khá cao. Kết quả này rất phù hợp với kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thứ và cộng sự (2003); Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng và cộng sự (2003). Các tác giả đều cho rằng, mật độ tế bào của các chủng VSV trong chế phẩm probiotic khi sử dụng đạt trên 109 tế bào/1g chế phẩm là tốt và sẽ cho hiệu quả cao nhất.
3.6.2. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm
Bảng 3.14. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm
Chủng VSV ức chế vỉ khuẩn kiểm
định Gây bệnh
Khả năng ức chế (D-d, mm)
Trước đông
khô Sau đông khô
Sac. cerevisiae với E.coli Viêm ruột, tiêu chảy 25 23
Sac. cerevisiae với Sal. choleraesuis Tiêu chảy ở heo 25 22
Chủng B với E.coli Viêm ruột, tiêu chảy 14 13
Chủng B với Sal. choleraesuis Tiêu chảy ở heo 27 26
Chủng N4 với E.coli Viêm ruột, tiêu chảy 12 11
Chủng N4 với Sal. choleraesuis Tiêu chảy ở heo 25 24
Chủng L2 với E.coli Viêm ruột, tiêu chảy 13 13
Hình 3.11. Khả năng đề kháng với các kháng sinh của Saccharomyces sp.02 sau đông khô sau 60 ngày
(a) (b)
(c) (d)
Hình 3.12. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định trước (a và c) và sau đông khô 60 ngày của Sac.
cerevisiae
Kiểm tra khả năng đề kháng với VK kiểm định và đề kháng với kháng sinh của Sac. cerevisiae chúng tôi thấy kết quả tƣơng tự.
Với các đặc tính trên, chúng tôi có thể bƣớc đầu yên tâm khi sử dụng thử nghiệm các chế phẩm probiotic của mình trên heo con sau cai sữa.
3.7. Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic
Hình 3.13. Sơ đồ quy trình công nghệ tạo chế phẩm probiotic
* Giải thích quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm P-SP-01
Trƣớc hết là phân lập, tuyển chọn các chủng VK lactic, nấm men đáp ứng những yêu cầu của công nghệ tạo chế phẩm probiotic.
Tiến hành nhân giống các chủng trong MT thích hợp.
Khảo sát các điều kiện tối ƣu cho quá trình thu sinh khối từng chủng
Xác định tỷ lệ tổ hợp giống thích hợp cho từng loại chế phẩm và kiểm tra hoạt tính enzim.
Tạo các chế phẩm P-SP-01 và P-SP-02.
Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm sau quá trình bảo quản.
Hình 3.14. Chế phẩm P-SP-01 trước và sau khi đóng gói
3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa
Mục đích thí nghiệm là nghiên cứu tác dụng của chế phẩm P-SP-01 đến việc phòng, trị bệnh tiêu chảy, hệ số chuyển hóa thức ăn và khả năng tăng trọng của heo con sau cai sữa (giai đoạn từ 28 ngày đến 56 ngày tuổi). So sánh hiệu quả của chế phẩm P-SP-01 so với hiệu quả của chế phẩm BioI (đối chứng) do Viện sinh học nhiệt đới TP. HCM sản xuất và hiện đang lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng.
3.8.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa
Bổ sung và trộn đều 1g chế phẩm P-SP- 01/kg thức ăn cho heo con sau cai sữa 28 ngày tuổi.
Kết quả theo dõi tỷ lệ tiêu chảy ở heo con đƣợc tính bằng số ngày heo con tiêu chảy tái phát trên tổng số ngày nuôi trong các lô thí nghiệm. Tỷ lệ tiêu chảy trung bình của 5 lô đƣợc trình bày qua bảng 3.15 và biểu đồ 3.6.
Bảng 3.15. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%) Lô Chỉ tiêu Lô ĐC1 Lô ĐC2 Lô TN3 Lô TN4 Lô TN5
Tổng số ngày heo con bị tiêu chảy 35 27 13 19 20
Tổng số ngày nuôi của các lô thí nghiệm 224 224 224 224 224
Tỷ lệ tiêu chảy (%) 15,63 12,05 5,80 8,48 8,93
Giảm so với ĐC (%) - 22,90 62,89 45,75 42,87
Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm
* Nhận xét
Kết quả khảo sát cho thấy, ở các lô thí nghiệm có bổ sung chế phẩm P-SP-01 có tỷ lệ tiêu chảy thấp hơn so với lô ĐC2 - bổ sung BioI và lô ĐC1 - không bổ sung chế phẩm. Việc sử dụng chế phẩm cho heo con có tác dụng làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 42,87% - 62,89% so với lô ĐC1. Điều này chứng tỏ, P-SP-01 ngoài tác dụng cạnh tranh và đối kháng để loại trừ VK gây bệnh, còn cung cấp thêm một lƣợng VSV có lợi, giúp duy trì sự cân bằng hệ VSV đƣờng ruột, từ đó làm giảm tình trạng tiêu chảy ở heo con. Đặc biệt, ở các lô thí nghiệm 3, 4, 5, không có tỷ lệ tái phát bệnh, còn ở lô không dùng chế phẩm tỷ lệ tái phát bệnh tiêu chảy khá cao (66,66%) Kết quả khảo sát của chúng tôi phù hợp với ghi nhận của một số tác giả
nhƣ Trần Thị Thu Thủy (2003), khi sử dụng Organic Green để phòng bệnh tiêu chảy ở heo con cai sữa với liều 1,2 tỉ CFU/kg thức ăn liên tục trong 28 ngày, đã làm giảm 45,17% - 57,30% tỷ lệ tiêu chảy ở heo con so với lô đối chứng; Tạ Thị Vịnh và Đặng Thị Hoè (2002), sử dụng VITOM 1.1 liều 50mg/kgP, 2 ngày 1 lần trên heo con để phòng bệnh tiêu chảy, kết quả đã giảm 47,5% số heo con mắc bệnh so với lô đối chứng,...
3.8.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa
Kết quả khảo sát trọng lƣợng và sự tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi đƣợc trình bày qua bảng 3.16.
Bảng 3.16. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi
Lô Chỉ tiêu Lô ĐC1 Lô ĐC2 Lô TN3 Lô TN4 Lô TN5
Thời gian thí nghiệm (ngày) 28 28 28 28 28
Trọng lƣợng 28 ngày tuổi (kg/con) 6,2 7,1 9,0 5,8 5,9
Trọng lƣợng 56 ngày tuổi (kg/con) 15,3 17,9 21,9 15,3 15,8
Tăng trọng bình quân (kg/con) 9,1 10,8 12,9 9,5 9,9
Tăng trọng trung bình trong 1 ngày (g/ngày/con)
325 385,7 460,1 339,3 353,6
* Nhận xét :Kết quả khảo sát cho thấy, tăng trọng bình quân ở các lô có bổ sung chế phẩm (lô 3, 4, 5, ĐC2) đều cao hơn so với lô ĐC1. Tuy nhiên, tăng trọng bình quân giữa các lô 3, 4, 5 không đều nhau. Theo Chiba (1996), trọng lƣợng heo con ở 4 tuần tuổi đƣợc xếp hạng nhƣ sau : kém khi < 5 kg/con; trung bình khi đạt từ 5 - 7,2 kg/con và tốt khi > 7,2 kg/con. Chính trọng lƣợng ban đầu không đều nhau giữa các heo con đã ảnh hƣởng đến sự không đều về khả năng chuyển hóa thức ăn và tăng trọng của heo. Vì thế mà ở lô 3, tăng trọng bình quân rất cao so với các lô 4, 5 và lô ĐC2 (12,9kg/con so với 9,lkg/con ở lô ĐC1). Nhƣ vậy, chỉ tiêu tăng trọng đạt cao nhất ở các lô có bổ sung chế phẩm. Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Thu Thủy (2003) và Thái Quốc Hiếu (2002). Các tác giả đều cho rằng, ở tất cả các lô có bổ sung chế phẩm sinh học cho heo con, đều cho kết quả tăng trọng cao hơn các lô đối chứng.
3.8.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn
Các ghi nhận về ảnh hƣởng của chế phẩm probiotic đến hệ số tiêu tốn thức ăn của heo con đƣợc tổng hợp trong bảng 3.17 và biểu đồ 3.8.
Bảng 3.17. Hệ số tiêu tốn thức ăn trong thời gian thí nghiệm
Lô Chỉ tiêu Lô ĐC1 Lô ĐC2
Lô 3 Lô 4 Lô 5
Số kg thức ăn tiêu thụ (kg/lô) 121,5 100 135 94,2 102
Tăng trọng (kg/lô) 72,7 86,1 103 76,2 79
Biểu đồ 3.8. Hệ số tiêu tốn thức ăn giữa các lô thí nghiệm
* Nhận xét
Kết quả khảo sát cho thấy, hệ số tiêu tốn thức ăn ở các lô có bổ sung chế phẩm P-SP- 01 (lô 3 : 1,31; lô 4 : 1,24; lô 5 : 1,29) và BioI (lô ĐC2 : 1,16), đều thấp hơn rất nhiều so với lô ĐC1 (1,67). Hệ số này gần xấp xỉ với 1,4 là giá trị của hệ số tiêu tốn thức ăn cho hiệu quả kinh tế nhất theo kinh nghiệm của các nhà chăn nuôi.
Qua các kết quả trên cho thấy, khi bổ sung probiotic vào trong khẩu phần ăn, các VSV có lợi sẽ nhanh chóng phát triển, chúng kết hợp với các enzym hỗ trợ cho việc tiêu hóa thức ăn làm cho heo con ăn nhiều hơn, hấp thụ dƣỡng chất tốt hơn dẫn đến tăng trọng mau hơn và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Thu Thủy (2003) và Thái Quốc Hiếu (2002). Các tác giả đều cho rằng, ở tất cả các lô có bổ sung chế phẩm sinh học, đều có hệ số tiêu tốn thức ăn thấp hơn so với các lô đối chứng.
Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa (28 ngày tuổi) cho thấy khả năng phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo của chế phẩm P-SP-01 cho kết quả khá tốt. Hiệu quả này tƣơng đƣơng với hiệu quả sử dụng chế phẩm Biol của Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM hiện đang đƣợc lƣu hành phổ biến trên thị trƣờng. Tuy nhiên, các số liệu ghi nhận đƣợc mới chỉ là bƣớc đầu do số lƣợng heo con thử nghiệm còn hạn chế cùng với những khó khăn khi triển khai thực nghiệm trong thời kỳ dịch cúm H5N1 có nguy cơ đang bùng phát ở Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những thực nghiệm trên, chúng tôi đã có những kết luận sau :
1. Đã phân lập và tuyển chọn đƣợc 3 chủng VK lactic, 1 chủng nấm men có những đặc tính cần thiết của một chủng probiotic :
- Có khả năng sinh các chất kháng khuẩn cao.
- Có hoạt tính đối kháng mạnh, phổ kháng khuẩn rộng với các VSV kiểm định (chuyên gây bệnh tiêu chảy cho heo) nhƣ E. colỉ, Salmonella choleraesuis.
- Có khả năng đề kháng tốt với các chất kháng sinh (trị đƣờng ruột) nhƣ neomicin, nalidixic axit, kanamicin, gentamicin.
- Có khả năng duy trì các hoạt tính sinh học và sống sót cao sau quá trình đông khô. 2. Đã nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng trên đến loài là :
Chủng B là Lactobacillus agilis. Chủng N4 là Lactobacillus saỉivarius. Chủng L2 là Lactobacillus acidophilus. Chủng nấm men Sac. sp.02 là Sac. cerevisiae.
3. Đã xác định đƣợc các điều kiện tối ƣu cho sự tạo thành sinh khối của 3 chủng VK lactic và 1 chủng nấm men.
4. Đã khảo sát và xác định đƣợc công thức tạo 2 loại chế phẩm probiotic P-SP-01 và P-SP-02.
5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm sau quá trình bảo quản từ 1 đến 2 và 3 tháng cho thấy khả năng sống sót của các chủng khá cao, sau 3 tháng mật độ tế bào ở mức cho phép (109 CFU/g). Chất lƣợng này tƣơng đƣơng với chế phẩm BioI đang lƣu hành rộng rãi trên thị trƣờng.
6. Đã xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm P-SP-01 và P-SP-02 ở quy mô phòng thí nghiệm.