Quá trình tạo thành rễ tơ của các mẫu thân chuyển gen ban đầu ở mẫu có các khối u trong suốt có hình cầu xuất hiện khoảng 7-10 ngày sau khi lây nhiễm (Hình 3.11b), rễ tơ bắt đầu nổi lên từ các khối u, chúng bắt đầu phát triển thêm những lơng tơ màu trắng đục mọc bao quanh tồn bộ rễ sau khoảng 5-7 ngày tiếp theo (Hình 3.11c). Sau đó rễ tơ tiếp tục phát triển và phân nhánh rất mạnh. Q trình hình thành rễ tơ ở mơ sẹo cũng xảy ra tương tự.
a b c
Hình 3.16. Quá trình hình thành rễ tơ từ mẫu thân được chuyển gen: a) mẫu ban đầu mới
chuyển gen. b, c, d: rễ tơ hình thành ở các giai đoạn 10, 15, 30 ngày sau khi chuyển gen.
Hình 3.17. Sự hình thành rễ tơ của mơ sẹo sau khi chuyển gen: a) Sự hình thành khối u hình
cầu; b) Sự tạo thành rễ tơ xung quanh rễ.
Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, rễ được hình thành trên các mẫu, rễ có nhiều lông tơ xuất hiện bao quanh thân rễ nên người ta cịn gọi rễ chuyển gen là rễ tơ, nó khác hồn tồn so với rễ bình thường khơng có nhiều lơng tơ. Rễ tơ phát triển mạnh khơng tn theo tính hướng địa giống rễ bình thường, về hình thái bên ngồi thì chúng có nhiều lơng tơ bao quanh và có màu trắng đục.
c d
Như vậy theo kết quả thí nghiệm mẫu thích hợp cho q trình chuyển gen đối với chủng TR105 là mẫu thân. Vì vậy chúng tơi chọn mẫu thân để thực hiện các thí nghiệm chuyển gen tiếp theo với điều kiện là mật độ OD và thời gian lây nhiễm.
3.2.2. Thí nghiệm B2: Ảnh hưởng của mật độ khuẩn OD đến khả năng tạo rễ tơ tơ
Qua 4 tuần sau khi tiến hành lây nhiễm mẫu thân với các mật độ OD là 0,25; 0,5 và 0,75 ta thu được kết quả thể hiện ở biểu đồ sau.
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mật độ khuẩn OD đến khả năng tạo rễ tơ
Từ kết quả trên ta nhận thấy, mật độ vi khuẩn có ảnh hưởng lớn đến khả năng chuyển gen. Với mẫu nguyên liệu là thân, thời gian lây nhiễm là 10 phút và đồng nuôi cấy trong hai ngày, qua 4 tuần theo dõi ta thấy tỉ lệ tạo rễ tơ cao nhất là OD 0.25 (45%) và thấp nhất là OD 0,5 (10,66%).
3.2.3. Thí nghiệm B3: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng chuyển gen tạo rễ tơ chuyển gen tạo rễ tơ
Thời gian lây nhiễm hay là khoảng thời gian mẫu mô được ngâm trực tiếp trong dịch huyền phù vi khuẩn. Thời gian lây nhiễm ảnh hưởng lớn đến khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn cũng như sức sống của mô. Thời gian lây nhiễm càng kéo dài thì càng ảnh hưởng đến sức sống của mẫu mô, do lượng vi khuẩn xâm nhiễm vào mơ càng lớn thì khả năng diệt khuẩn càng kém và làm tăng khả năng khả năng vi khuẩn vi khuẩn phát triển lại và gây chết mẫu. Trái lại, khi thời gian lây nhiễm ngắn, lượng vi khuẩn xâm nhập ít, làm giảm khả năng chuyển gen.
Qua q trình thí nghiệm với mẫu ngun liệu là thân cây sâm dây, với mật độ OD là 0,25; thời gian lây nhiễm là 10 phút, 15 phút và 20 phút; thời gian đồng nuôi cấy hai ngày ta thu được kết quả được hiển thị ở biểu đồ sau như sau:
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến khả năng chuyển gen tạo rễ tơ
Qua biểu đồ ta thấy với thời gian lây nhiễm là 15 phút thì có tỉ lệ mẫu được chuyển gen là cao nhất 45,24 %.
Tiến hành thí nghiệm đối với đĩa đối chứng gồm những mẫu đoạn thân không lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes và một đĩa gồm những mẫu thân lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes với OD 0,25 và thời gian lây nhiễm 15 phút. Quan sát sau 2 tuần chúng tơi thấy ở đĩa đối chứng thì các mẫu thân có hiện tượng phồng xốp và chết, cịn đối với đĩa có mẫu đã lây nhiễm thì có sự cảm ứng tạo rễ tơ ( hình 3.15).
Hình 3.20. Cảm ứng tạo rễ tơ: a) Đĩa đối chứng; b) Đĩa có mẫu lây nhiễm với khuẩn
A.rhizogenes