Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
2.4.3. Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
- Vi khuẩn A.rhizogenes (TR105) lấy từ đĩa chủng gốc được cấy lên đĩa thạch bằng que cấy, với môi trường là YMB đặc, nuôi khuẩn trong 2 ngày ở nhiệt độ 28oC.
- Khuẩn được nuôi lỏng phục hồi qua đêm trong 20 ml môi trường YMB lỏng.
- Nuôi nhân sinh khối trong môi trường YMB lỏng (10 ml khuẩn + 40 ml môi trường YMB), trong khoảng thời gian 4h - 6h.
- Sau khi nuôi nhân sinh khối thì khuẩn được cho vào ống ly tâm, phần còn lại được dùng để đo OD. Dung dịch khuẩn được ly tâm ở nhiệt độ 4oC với tốc độ 6500 vòng/phút, trong thời gian 15 phút.
- Đo OD của dịch khuẩn.
- Pha khuẩn ở nồng độ thích hợp để làm thí nghiệm.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu cấy:
- Mô sẹo: cắt mô sẹo thành các lớp có kích thước 5 x 5 x 2mm (dài, rộng, cao). Dùng kim tiêm châm vào mô sẹo để tạo vết thương cho mẫu.
- Thân: thân được cắt thành từng đoạn dài 1cm, không chứa mắt lá. - Lá: lá được cắt ở 2 đầu cuống lá và đuôi lá để tạo vết thương.
Bước 3: Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn
Mẫu được dùng là thân, lá và mô sẹo của cây sâm dây. Lây nhiễm với dung dịch khuẩn trong thời gian 10 phút, 15 phút và 20 phút ở nhiêt độ phòng. Sau đó vớt ra, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và cấy vào các đĩa môi trường MS đặc.
Bước 4: Đồng nuôi cấy sau khi lây nhiễm:
Sau khi lây nhiễm tiến hành đồng nuôi cấy ở nhiệt độ 220C, trong bóng tối với thời gian 2 ngày.
- Mẫu được chuyển qua môi trường MS đặc bổ sung cefotaxime để diệt khuẩn.
- Mẫu được cấy chuyển định 2 hoặc 3 tuần/lần sang môi trường mới. - Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 220C trong bóng tối.