PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu biến nạp gen ZmNAC vào một số dòng ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Phương pháp nghiên cứu dựa trên phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (theo quy trình biến nạp của Phạm Thị Lý Thu và cs) [13].
23
Khử trùng bề mặt bắp ngô Vi khuẩn A. tumefaciens
Tách phôi non Nuôi lỏng tạo huyền phù
Lây nhiễm phôi trong dịch
IM có bổ sung AS và dịch huyền phù vi khuẩn
Mẫu đồng nuôi cấy (CCM) 20oC
Nuôi phục hồi (REM) nuôi trong tối 28 oC
Chọn lọc mô sẹo chuyển gen (ECM) nuôi trong tối 28 oC
Tái sinh chồi (SeM) nuôi sáng ở 25oC
Ra rễ (RM)
Ra cây
Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình biến nạp gen vào ngô (Zea mays L.) Phương pháp tách, nuôi cấy phôi non và tái sinh cây
Bắp non sau khi thụ phấn khoảng 18-24 ngày được thu để tách phôi. Mẫu bắp thí nghiệm được giữ ở 40oC thời gian từ 2-10 ngày trước khi tách phôi. Khử trùng bề mặt ngoài của bắp bằng ethanol 70o, bóc bỏ các lá bao ngoài và tách phôi trong điều kiện vô trùng. Phôi non được cấy trong môi trường nuôi cấy với phần tế bào vảy hướng lên trên, phần trụ phôi tiếp xúc với bề mặt môi trường (Green and
24
Phillips, 1975). Các phôi có kích thước khác nhau (từ 0,5-3mm) được sử dụng trong thí nghiệm. Mật độ cấy 15 phôi/đĩa Petri chứa 8ml môi trường. Mỗi công thức thí nghiệm được làm với 12 đĩa, tương ứng với 180 phôi tách từ 3 bắp.
Biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Lây nhiễm vi khuẩn với phôi
Bắp non được thu từ các cây ngô mẹ trồng trong nhà lưới. Ngay sau khi thu, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng. Phôi non sau đó được đưa vào môi trường IM có bổ sung AS và dịch huyền phù vi khuẩn trong 30-60 phút, lắc nhẹ.
- Đồng nuôi cấy
Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường nuôi cộng sinh CCM, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 20oC trong 3 ngày.
- Nuôi phục hồi
Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường CCM sang môi trường ReM, nuôi trong tối ở 28oC trong 7 ngày.
- Chọn lọc mô sẹo chuyển gen
Mô sẹo tạo thành từ phôi non đã biến nạp trên môi trường ReM được cấy chuyển sang môi trường ECM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật tương ứng, nuôi trong tối ở 28oC, thời gian 15-20 ngày.
- Tạo chồi
Mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc ECM được cấy chuyển sang môi trường SeM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật thích hợp để tái sinh chồi, nuôi sáng ở 25oC, thời gian 15-20 ngày.
- Tái sinh cây biến nạp gen hoàn chỉnh
Chồi tái sinh trong môi trường chọn lọc SeM được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh RM có bổ sung kháng sinh chọn lọc thực vật, nuôi sáng ở 25oC, thời gian 10-20 ngày.
- Chuyển cây ra đất:
Cây tái sinh trên môi trường chọn lọc RM có 2-3 lá, 3-4 rễ được chuyển ra đất trồng.
25
Nội dung 2: Kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong một số dòng ngô bằng phương pháp PCR.
DNA tổng số của lá ngô non giai đoạn 3-4 lá được tách chiết bằng phương pháp CTAB của Saghai Maroof và cs (1984) đã cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [35]. Toàn bộ quy trình được tóm tắt như sau:
Bước 1: Ủ sẵn 5ml đệm chiết ở 65o C trong bình ổn nhiệt (30 phút).
Thành phần đệm chiết:
- CTAB 2% (Cetyltrimethyl ammonium bromide) - Mercaptoetanol 0,2% (V/V)
- EDTA 0,5M pH 8 (Ethylenediamine tetraacetate) - Tris HCl, 1M pH 7,5.
- NaCl 5M.
Bước 2: Nghiền 0,75 (g) mô lá ngô trong Nitơ lỏng (bằng chày thuỷ tinh hoặc sứ...) cho đến khi thành dạng bột mịn.
Bước 3: Hoà tan mẫu đang nghiền trong đệm chiết, nghiền thêm một chút để tạo dạng đồng chất.
Bước 4: Ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút (lắc đều, đảo nhẹ 3-5 lần) trong quá trình ủ.
Bước 5: Thêm 25:24:1 phenol:chloroform:isoamyl alcohol theo thể tích 1:1, đảo nhẹ.
Bước 6: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 7: Chuyển pha trên sang ống sạch và thêm thể tích 1:1 dung dịch C:I, đảo nhẹ.
Bước 8: Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút.
Bước 9: Chuyển pha trên sang ống sạch. Thêm EtOH 100% thể tích 2-3:1 hoặc isopropanol thể tích 1:1.
Bước 10: Để mẫu ở -20oC từ 3 giờ trở lên và ly tâm 13.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC thu tủa.
26
Bước 11: Rửa tủa bằng EtOH 75%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
Bước 12: Để khô không khí, hoà tan trong dung dịch TE 0,1X.
Bước 13: Thờm RNase để đạt nồng độ cuối cựng là 10-20àg/ml, ủ 37oC trong 1 giờ.
Bước 14: Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số trên gel agarose 1%
Phân tích PCR (Polymerase Chain Reaction): phương pháp tiến hành để kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô chuyển gen.
Sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô chuyển gen được kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Thành phần phản ứng được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây:
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC trong các dòng ngô chuyển gen
STT Thành phần Hàm lượng (àl)
1 10X buffer 2,0
2 MgCl2 1,0
3 dNTPs (2,5 mM) 1,6
4 ZmNAC-F (10 àM) 0,5
5 ZmNAC-R (10 àM) 0,5
6 Taq DNA polymerase (5U/àl) 0,2
7 DNA tổng số ( 1àg/àl) 1,0
8 H2O khử ion 13,2
9 Tổng số 20,0
Điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen ZmNAC như sau:
Giai đoạn biến tính ban đầu: 95oC trong 3 phút
Giai đoạn khuếch đại: gồm 40 chu kỳ bao gồm 3 bước sau:
+ Biến tính: 95oC trong 30 giây
27
+ Gắn mồi: 55oC trong 30 giây + Kéo dài mồi: 72oC trong 45 giây
Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72oC trong 5 phút Ủ bảo quản: 4oC cho đến khi lấy sản phẩm
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, Bổ sung Ethidium bromide vào bản gel với nồng độ 10àg/ml. Sau 20-25 phỳt, khi gel đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di.
Lấy 20àl DNA sản phẩm PCR trộn cựng với 2àl đệm tra mẫu (Loading dye 6X), tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 120V. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (sau khoảng 35 phút).
Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, DNA được hiện lên dưới dạng các vạch sáng, ảnh điện di được chụp trên máy Bio-Rad với tia UV có bước sóng 312 -365nm.
Sự có mặt của gen chuyển được xác định bằng sự có mặt của băng điện di DNA có kích thước trùng với kích thước của gen ZmNAC, khi đó kết luận dòng đó có thể mang gen chuyển ZmNAC, và ngược lại.