Chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum Lycopersicum L.) bằng phương pháp bắn gen

Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum) cùng với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien vào lá thật và lá mầm. Hepta adaptor được dùng trong những nghiên cứu chuyển gien. Sau ba ngày bắn gien, mẫu được cắt thành những miếng 3 × 3 mm. Lá thật đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; và lá mầm đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin. Tăng dần nồng độ spectinomycin lên đến 300 mg/l qua những lần cấy chuyền. Phân tích PCR gien aadA và gien HIV-1 p24 cho thấy có sự có mặt của băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp trong các dòng cà chua chuyển gien. Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp trong bộ gien lạp thể cây cà chua ở dạng không đồng nhất vì cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb của lạp thể chuyển gien và 3,5 kb của lạp thể không chuyển gien.

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 P24 VÀO LẠP THỂ CÂY CÀ CHUA (Solanum lycopersicum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN Phạm Đức Trí*, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, (*)phamductri75@gmail.com TĨM TẮT: Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cà chua (Solanum lycopersicum) với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin streptomycin thực cách bắn gien vào thật mầm Hepta adaptor dùng nghiên cứu chuyển gien Sau ba ngày bắn gien, mẫu cắt thành miếng × mm Lá thật đặt mơi trường MS vitamin B5 có bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; mầm đặt mơi trường MS vitamin B5 có bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin Tăng dần nồng độ spectinomycin lên đến 300 mg/l qua lần cấy chuyền Phân tích PCR gien aadA gien HIV-1 p24 cho thấy có có mặt băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp dòng cà chua chuyển gien Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp gien lạp thể cà chua dạng khơng đồng cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb lạp thể chuyển gien 3,5 kb lạp thể khơng chuyển gien Từ khóa: Solanum lycopersicum, chuyển gien vào lục lạp, gien aadA, giene HIV-1 p24, promoter RRN MỞ ĐẦU Từ năm cuối kỷ 20, hướng chuyển gen vào lục lạp trồng nhà khoa học quan tâm thuận lợi Obembe et al (2010), Wang et al (2009) [11, 17] cho rằng, gen lục lạp di truyền theo mẹ hạn chế phát tán gen; số lượng gen lục lạp giúp cho gen mục tiêu biểu mức cao chuyển gen vào nhân; chuyển gen vào lục lạp thực theo nguyên tắc tái tổ hợp tương đồng DNA vector DNA lục lạp, điều cho phép biết xác vị trí gen chuyển vào khơng lo lắng hiệu biểu hiện; chuyển gen lục lạp khơng có tượng gen im lặng chuyển gen nhân Đến nay, thành công từ nghiên cứu chuyển gen vào lục lạp tạo trồng có khả kháng sâu [2], kháng thuốc diệt cỏ [3, 19], protein dược liệu [6, 8] đặc biệt vaccine từ thực vật [4, 7, 20] Obembe et al (2010) [11] cho rằng, vaccine từ thực vật có lợi bỏ qua công đoạn lên men, tinh sạch, trữ lạnh, tiêm vô trùng vaccine thông thường Vaccine kháng nguyên biểu lục lạp bảo vệ khỏi phân hủy acid enzyme bao tử, phóng thích ruột vách tế bào lục lạp bị phân hủy vi khuẩn ruột 242 Với việc tiếp cận kỹ thuật đại công tác chuyển gen lục lạp, nghiên cứu sản xuất protein kháng nguyên HIV-1 p24 từ thực vật hướng nghiên cứu nhắm đến Trong nghiên cứu này, thực chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cà chua (Lycopersicon esculentum) kỹ thuật bắn gen dựa cơng trình tác giả Wiebke & Ralph (2009), Nugent et al (2005), Ruf et al (2001), Staub et al (2000), Svab & Maliga (1993), Wurbs et al (2007), Zhou et al (2008) [1, 10, 12, 14, 15, 18, 20] PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các giống cà chua dùng nghiên cứu hai giống thương mại Công ty giống trồng Trang Nông: TN84 TN386 Chúng sử dụng thật mầm cà chua làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen Môi trường, điều kiện nuôi cấy Môi trường nuôi cấy in vitro MS (Murashige, Skoog 1962) + Vitamin B5, 30g/l đường, g/l agar, pH 5,8 Môi trường tái sinh chồi từ cà chua MS vitamin B5 + 2,0 mg/l Zeatin + 0,2 mg/l IAA Môi trường tái sinh chồi từ mầm cà chua MS vitamin B5 + 2,0 mg/l BA + 1,0 mg/l IAA + 0,5 mg/l Kinetin Môi trường đồng nuôi cấy MS vitamin B5 + 1,0 Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho mg/l BA + 0,1 mg/l NAA Vector chuyển gen Môi trường chọn lọc mẫu cà chua chuyển gen kháng spectinomycin môi trường tái sinh tối ưu + spectinomycin nồng độ từ 50 mg/l Tăng dần nồng độ kháng sinh sau lần cấy chọn lọc Plasmid pITB-HIV-1 p24 thiết kế, sử dụng làm vector chuyển gen vào lạp thể cà chua Gen HIV-1 p24 điều khiển promoter rrn (ribosomal RNA operon promoter) đặc hiệu cho chuyển gen vào lạp thể với trình tự kết thúc gen TrbcL gen chọn lọc aadA kiểm sốt promoter rrn trình tự kết thúc gen psbA Cassette chứa gen gài vào hai gen trnfM trnG gen lạp thể Kích thước vector 8344 bp (hình 1) Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ từ 25-26oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 500-1000 lux mẫu sau bắn gen; nhiệt độ từ 25-26oC, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500-3000 lux mẫu tái sinh chồi Hình Sơ đồ cấu trúc vector lục lạp plasmid pITB-HIV-1 p24 Phương pháp Tạo cà chua in vitro Hạt cà chua mua từ công ty giống trồng khử trùng cồn 70% phút, rửa với nước vô trùng Tiếp theo khử trùng nước javel 3,8% pha thêm nước vô trùng thành nồng độ 1,9% với thời gian khử trùng 10, 20 30 phút Rửa lại lần với nước vô trùng Hạt sau khử trùng đặt môi trường 1/2 MS cho nảy mầm Tách chiết plasmid DNA Môi trường nuôi cấy giữ giống vi khuẩn E coli DH5α mang plasmid pITB-HIV-1 p24 LB (Luria-Bertani) có chứa 100 mg/l ampicillin Chúng dùng QIAGEN Plasmid Mega kit để tách chiết DNA plasmid dùng làm vật liệu chuyển nạp gen Qui trình chuyển nạp gen Theo Kikkert et al (2005), Sanford et (1993) [5, 13], chuyển gen vào lạp thể dùng thống bắn gen PDS-1000/He cần hạt vàng kích thức 0,6 µm, Rupture disks 1.100 psi, suất 28 mmHg al hệ có áp Chuẩn bị mẫu chuyển gen: Lá mầm sau 10 ngày nảy mầm, thật cà chua sau khoảng tuần nuôi cấy in vitro cắt đặt mặt gân hướng lên đĩa petri đường kính cm chứa mơi trường tái sinh trước ngày để chuẩn bị bắn gen Kết dính plasmid DNA vào hạt vàng: Lấy 50 µl dung dịch vàng, vortex phút Thêm 10 µg DNA (nồng độ µg/1µl) Thêm 50 µl CaCl2 2,5M Thêm 20 µl spermidine 0,1 M, vortex phút Thêm 200 µl cồn tuyệt đối Ly tâm 10.000 vòng/phút 10 giây Loại bỏ phần dịch phía tủa Lập lại lần thứ hai bước Thêm 75 µl cồn tuyệt đối trộn dung dịch vàngDNA giây Thực thao tác bắn gen: Hút 10 µl vàng/DNA cho vào Macrocarrier hepta, để khô tự nhiên phút tủ cấy vô trùng Đặt mẫu vị trí khoảng cách từ hạt vàng mang plasmid đến mẫu mô cm Bật công tắc đợi áp suất đạt 28 mmHg Thực thao tác bắn gen Quá trình chọn lọc sau bắn gen: Sau bắn gen, mẫu để tối ngày trước cắt thành mẫu × mm cấy vào mơi trường thích hợp có chất chọn lọc spectinomycin đặt điều kiện ánh sáng mờ Cấy mẫu sang môi trường chọn lọc sau 243 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 tuần Nồng độ chất chọn lọc spectinomycin môi trường tăng dần lên theo thời gian đến 300mg/l Sau khoảng 6-8 tháng, nhận dòng chuyển gen giả định kháng spectinomycin kiểm tra kỹ thuật sinh học phân tử Kiểm tra mô, chuyển gen Những dòng cà chua kháng spectinomycin tách chiết DNA tổng số kit DNeasy plant (QIAGEN, Đức) DNA dùng cho phản ứng PCR Southern blot Phân tích PCR Kiểm tra diện gen HIV-1 p24 aadA dòng cà chua chuyển gen kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Gen aadA: mồi xuôi: 5’-AACCTCCTATAGACT AGG C-3’ mồi ngược: 5’-AGCGAAATG TAGTGCTTACG-3’, chương trình nhiệt: 95oC: 30 giây; 30 chu kỳ (94oC: phút, 52oC: phút, 72oC: phút) 72oC: phút, khuyếch đại đoạn DNA 250 bp Gen HIV-1 p24: mồi xuôi: 5’CATATGGCTAGCGGATCCCCTATT-3’ mồi ngược: 5’-TCTAGAGGAATTCTACTC AGCTTTATGTC-3’, chương trình nhiệt: 95oC: phút; 30 chu kỳ (95oC: phút, 52oC: phút, 72oC: phút) 72oC phút, khuyếch đại đoạn DNA 700 bp Phân tích Southern blot Phương pháp Nonradioactive Southern blot dùng để phân tích dòng cà chua chuyển gen Dùng PCR DIG-labeling kit (Roche) để tạo probe đoạn gen lục lạp psaB (hình 2) Phản ứng PCR gồm: PCR buffer có MgCl2 5µl, PCR DIG Labeling µl, mồi xi µl (10 pM), mồi ngược µl (10 pM), Taq polymerase 0,75 µl, DNA template µl, thêm nước cất vô trùng vừa đủ 50 µl Chương trình nhiệt: 95o C: phút, 30 chu kỳ (95oC: phút; 52oC: phút; 72oC: phút) 72o C: phút, khuyếch đại đoạn DNA 543 bp Cho µg DNA dòng chuyển nạp gen đối chứng âm (cây không chuyển nạp gen) ủ với enzyme giới hạn BglII 37oC Mẫu DNA điện di gel agarose 0,8% 25vol qua đêm với thang chuẩn  Hind III Dùng phương pháp McCabe et al (1997) [9] chuyển DNA lên màng lai Hybond (GE healthcare) phim Hình Sơ đồ probe enzyme cắt giới hạn KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chọn lọc tái sinh tế bào chuyển nạp gen Trong chuyển nạp gen lục lạp, gen aadA mã hóa protein aminoglycoside-3′-adenyl transferase có tính kháng spectinomycin streptomycin Dòng chuyển gen phát triển xanh tốt khơng chuyển gen có màu xanh nhợt nhạt trắng chậm phát triển Vì có mặt mơi trường, spectinomycin streptomycin gắn với ribosome 70S lục lạp gây ức chế tổng hợp protein bên lục lạp Trong thời gian đầu, lạp thể chuyển gen tế bào ít, nên khả kháng kháng sinh tế bào chưa cao Do đó, chọn lọc nồng 244 độ tối thiểu gây ức chế khả tái sinh mẫu mô 50 mg/l spectinomycin Dưới áp lực chất chọn lọc, lạp thể chuyển gen dần thay lạp thể không chuyển gen, nên khả kháng spectinomycin tăng lên đến nồng độ 300 mg/l Việc cắt nhỏ mẫu sau bắn gen thành × mm có vai trò làm tăng khả tái sinh cà chua chủ yếu tái sinh từ vết cắt mẫu Khi đặt mẫu điều kiện ánh sáng mờ nhằm tăng số lượng gen lạp thể đồng thời kéo dài thời gian phân chia lạp thể Với điều kiện nuôi cấy với mơi trường tái sinh thích hợp giúp tạo điều kiện tối ưu để nhận dòng cà chua kháng spectinomycin (hình 3) Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho Hình a Mơ sẹo sống mơi trường có spectinomycin; b Chồi tái sinh mơi trường có spectinomycin Xác định gen HIV-1 p24 aadA Một dòng cà chua kháng kháng sinh spectinomycin tách chiết DNA tổng số để phân tích PCR Kết cho thấy, qua khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu gen aadA, có diện băng DNA tương ứng 250bp (hình 4) Tiếp tục dùng dòng cà chua Hình Phân tích PCR gen aadA M Thang chuẩn 1kb (BioLabs); Cây cà chua không chuyển gen; Gen aadA plasmid; 3: Dòng cà chua chuyển gen chuyển nạp gen có kết dương tính gen aadA để phân tích PCR gen HIV-1 p24 với cặp mồi đặc hiệu gen HIV-1 p24 Kết cho thấy, có diện băng DNA tương ứng 700bp (hình 5) Những kết trùng với băng đối chứng dương gen aadA, HIV-1 p24 plasmid pITB HIV-1 p24 Hình Phân tích PCR gen HIV-1 p24 M Thang chuẩn 1kb (BioLabs); Cây cà chua không chuyển gen; Đối chứng dương (Gen HIV-1 p24 plasmid); Đối chứng âm (nước cất); 4: Dòng cà chua chuyển gen 245 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 Phân tích xuất gen HIV-1 p24 lục lạp Hệ thống đánh dấu DNA khơng dùng đồng vị phóng xạ (nonradioactive), với ưu điểm an toàn, probe ổn định so với hệ thống sử dụng đồng vị phóng xạ, sử dụng kỹ thuật southern blot Trong nghiên cứu này, sử dụng hệ thống phát đánh dấu khơng dùng phóng xạ, hoạt động sở sử dụng digoxigenin (DIG) Dòng cà chua qua kiểm tra PCR tiếp tục nghiên cứu chứng minh thêm biến nạp gen chuyển gen lục lạp kỹ thuật Southern blot, qua xác định xác cà chua chuyển nạp gen bền vững đồng lục lạp (homoplasmic) chưa đồng (heteroplasmic) tế bào chứa hai dạng, lạp thể mang gen cần chuyển lạp thể không mang gen cần chuyển Dưới áp lực chất chọn lọc, lạp thể không mang gen chuyển dần bị loại bỏ tế bào loại lạp thể mang gen chuyển Lúc kết nhận dòng chuyển nạp gen đồng nhấtm bền vững Kết thí nghiệm cho thấy, HIV-1 p24 cài vào gen lạp thể cà chua dạng chưa đồng có hai băng 5,8 kb 3,5 kb Đối chứng âm có băng 3,5 kb, khơng thấy băng DNA 5,8 kb so với dòng chuyển nạp gen (hình 6) Hình Phân tích Southern blot chuyển gen a: Bảng gel điện di cho Southern blot; b: Kết phân tích Southern blot; M: Thang chuẩn HindIII; 1: Cây cà chua không chuyển gen; 2: Dòng cà chua chuyển gen KẾT LUẬN Kết nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển nạp gen vào lạp thể cà chua phương pháp bắn gen, cho phép thu nhận dòng cà chua TN84 kháng spectinomycin 300 mg/l Phân tích PCR gen HIV-1 p24 aadA nhận băng DNA khuếch đại tương ứng 700 bp 250 bp Phân tích Southern blot, xác nhận gen cần chuyển vào gen lạp thể dòng chuyển gen dạng chưa đồng Dòng cà chua cần tiếp tục chọn lọc, tái sinh để nhận dòng chuyển gen lạp thể đồng Lời cảm ơn: Cơng trình hỗ trợ Văn phòng Chương trình Khoa học Công 246 nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, Ban chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10 tài trợ cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Apel Wiebke, Bock Ralph, 2009 Enhancement of Carotenoid Biosynthesis in Transplastomic Tomatoes by Induced Lycopene-to-Provitamin A Conversion Plant Physiology, 151: 59-66 De Cosa B., Moar W., Lee S B., Miller M., Daniell H., 2001 Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals Nature Biotechnology, 19: 71-74 Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho Dufourmantel N., Dubald M., Matringe M., Canard H., Garcon F., Job C., Kay E., Wisniewski J P., Ferullo J M., Pelissier B., Sailland A., Tissot G 2007 Generation and characterization of soybean and marker-free tobacco plastid transformants overexpressing a bacterial 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase which provides strong herbicide Plant Biotechnology Journal, 5: 118-133 Glenz K., Bouchon B., Stehle T., Wallich R., Simon M M., Warzecha H., 2006 Production of a recombinant bacterial lipoprotein in higher plant chloroplasts Nature Biotechnology, 24: 76-77 Kikkert J R., Vidal J R., Reisch B I., 2005 Stable Transformation of Plant Cells by Particle Bombardment/Biolistics In: Peña L (Ed.) Transgenic Plants: Methods and Protocols Humana Press Inc., Totowa, NJ 61-78 Leelavathi S., Reddy V S., 2003 Chloroplast expression of His-tagged GUSfusions: a general strategy to overproduce and purify foreign proteins using transplastomic plants as bioreactors Molecular Breeding, 11: 49-58 Lelivelt C L., McCabe M S., Newell C A., Desnoo C B., van Dun K M., BirchMachin I., Gray J C., Mills K H., Nugent J M., 2005 Stable plastid transformation in lettuce (Lactuca sativa L.) Plant Molecular Biology, 58: 763-774 Magee A M., Coyne S., Murphy D., Horvath E M., Medgyesy P., Kavanagh T A., 2004 T7 RNA polymerase-directed expression of an antibody fragment transgene in plastids causes a semi-lethal pale-green seedling phenotype Transgenic Research, 13: 325-337 McCabe M S., Power J B., De Laat Ad M M., Davery M R., 1997 Detection of singlecopy genes in DNA from transgenic plants by nonradioaction southern blot analysis Molecular Biotechnology, 7: 79-84 10 Nugent G D., Ten Have M., Van Der Gulik A., Dix P J., Uijtewaal B A., Mordhorst A P., 2005 Plastid transformants of tomato selected using mutations affecting ribosome structure Plant Cell Report, 24: 341-349 11 Obembe O O., Popoola J O., Leelavathi S., Reddy V S., 2010 Recent advances in plastid transformation Indian Journal of Science and Technology, 3(12): 1229-1235 12 Ruf S., Hermann M., Berger I J., Carrer H., Bock R., 2001 Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit Nature Biotechnology, 19: 870-875 13 Sanford J C., Smith F D., Russell J A., 1993 Optimizing the biolistic process for different biological applications Methods in Enzymology, 217: 483-509 14 Staub J M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P T J., Hunter P., Nehra N., 2000 High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts Nature Biotechnology, 18: 333-338 15 Svab Z., Maliga P., 1993 High frequency plastid transformation in tobacco by selection for a chimeric aadA gene PNAS, 90: 913-917 16 Verma D., Daniell H., 2007 Chloroplast vector systems for biotechnology application Plant Physiology, 145: 11291143 17 Wang Huan-Huan, Yin Wei-Bo, Hu ZanMin, 2009 Advances in chloroplast engineering Journal of Genetic & Genomics, 36: 387-398 18 Wurbs D., Ruf S., Bock R., 2007 Contained metabolic engineering in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes from the plastid genome Plant Journal, 49: 276-288 19 Ye G N., Hajdukiewicz P T., Broyles D., Rodriguez D., Xu C W., Nehra N., Staub J M., 2001 Plastid-expressed 5enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco Plant Journal, 25: 261270 20 Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., 247 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 242-248 Borchers A.-M Inka, Maloney A P., Kavanagh T A., Gray J C., Bock R., 2008 High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes Plant Biotechnology Journal, 6: 897-913 PLASTID TRANSFORMATION OF TOMATO (Solanum lycopersicum L.) WITH HIV-1 P24 GENE BY BIOLISTIC PARTICLE DELIVERY SYSTEM Pham Duc Tri*, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Plastid transformation in tomato (Solanum Lycopersicum L.) is carried out using vector carrying HIV-1 p24 gene and a selection of aadA gene, spectinomycin for resistance to antibiotics, and streptomycin We used the hepta adaptor to replace the rupture disk retaining cap and microcarrier launch assembly Three days after bombardment, the leaves and cotyledons were cut into small pieces each of × mm and placed on medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l Zeatin, 0.2 mg/l IAA, 50 mg/l spectinomycin for leaves, and medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l BAP, 1.0 mg/l IAA, 0.5mg/l Kinetin, 50 mg/l spectinomycin for cotyledons Selected further time on the medium containing spectinomycin was up to 300 mg/l PCR analysis of aadA and HIV-1 p24 genes of the tomato plastid transformation lines showed the presence of DNA amplification with the corresponding 250bp and 700bp Southern blot analysis confirmed that the foreign genes were inserted into the tomato plastid genome The result indicated the presence of HIV1 p24 in the tomato plastid genome with the presence of DNA band of 5.8 kb However, it is heteroplasmic transformant because it has a DNA band of 3.5 kb of wide type plant Keywords: Chloroplast transformation, Solanum lycopersicum L., HIV-1 p24 gene, aadA gene, promoter RRN Ngày nhận bài: 21-6-2012 248 ... khơng chuyển gen; 2: Dòng cà chua chuyển gen KẾT LUẬN Kết nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển nạp gen vào lạp thể cà chua phương pháp bắn gen, cho phép thu nhận dòng cà chua TN84 kháng spectinomycin... dùng dòng cà chua Hình Phân tích PCR gen aadA M Thang chuẩn 1kb (BioLabs); Cây cà chua không chuyển gen; Gen aadA plasmid; 3: Dòng cà chua chuyển gen chuyển nạp gen có kết dương tính gen aadA... Plasmid pITB -HIV-1 p24 thiết kế, sử dụng làm vector chuyển gen vào lạp thể cà chua Gen HIV-1 p24 điều khiển promoter rrn (ribosomal RNA operon promoter) đặc hiệu cho chuyển gen vào lạp thể với trình