1. Trang chủ
  2. » Giáo án - Bài giảng

Chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum Lycopersicum L.) bằng phương pháp bắn gen

7 53 0

Đang tải... (xem toàn văn)

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 7
Dung lượng 1,62 MB

Nội dung

Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum) cùng với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien vào lá thật và lá mầm. Hepta adaptor được dùng trong những nghiên cứu chuyển gien. Sau ba ngày bắn gien, mẫu được cắt thành những miếng 3 × 3 mm. Lá thật đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; và lá mầm đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin. Tăng dần nồng độ spectinomycin lên đến 300 mg/l qua những lần cấy chuyền. Phân tích PCR gien aadA và gien HIV-1 p24 cho thấy có sự có mặt của băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp trong các dòng cà chua chuyển gien. Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp trong bộ gien lạp thể cây cà chua ở dạng không đồng nhất vì cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb của lạp thể chuyển gien và 3,5 kb của lạp thể không chuyển gien.

Trang 1

CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 P24 VÀO LẠP THỂ CÂY CÀ CHUA

(Solanum lycopersicum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN

Phạm Đức Trí*, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ

Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)phamductri75@gmail.com

TÓM TẮT: Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum)

cùng với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien

vào lá thật và lá mầm Hepta adaptor được dùng trong những nghiên cứu chuyển gien Sau ba ngày bắn gien, mẫu được cắt thành những miếng 3 × 3 mm Lá thật đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; và lá mầm đặt trên môi trường MS vitamin B5 có

bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin Tăng dần nồng độ

spectinomycin lên đến 300 mg/l qua những lần cấy chuyền Phân tích PCR gien aadA và gien HIV-1 p24

cho thấy có sự có mặt của băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp trong các dòng cà chua

chuyển gien Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp trong bộ gien lạp thể cây cà chua

ở dạng không đồng nhất vì cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb của lạp thể chuyển gien và 3,5

kb của lạp thể không chuyển gien

Từ khóa: Solanum lycopersicum, chuyển gien vào lục lạp, gien aadA, giene HIV-1 p24, promoter RRN

MỞ ĐẦU

Từ những năm cuối thế kỷ 20, hướng

chuyển gen vào lục lạp cây trồng đã được các

nhà khoa học quan tâm vì những thuận lợi của

nó Obembe et al (2010), Wang et al (2009)

[11, 17] đã cho rằng, gen lục lạp di truyền theo

mẹ sẽ hạn chế sự phát tán gen; số lượng bộ gen

trong lục lạp sẽ giúp cho gen mục tiêu biểu hiện

ở mức cao hơn khi chuyển gen vào nhân;

chuyển gen vào lục lạp được thực hiện theo

nguyên tắc tái tổ hợp tương đồng giữa DNA

vector và DNA lục lạp, điều này cho phép biết

được chính xác vị trí gen được chuyển vào và

không còn lo lắng hiệu quả biểu hiện; chuyển

gen lục lạp không có hiện tượng gen im lặng

như trong chuyển gen nhân

Đến nay, những thành công từ nghiên cứu

chuyển gen vào lục lạp đã tạo ra những cây trồng

có khả năng kháng sâu [2], kháng thuốc diệt cỏ

[3, 19], những protein dược liệu [6, 8] và đặc

biệt là những vaccine từ thực vật [4, 7, 20]

Obembe et al (2010) [11] cho rằng, vaccine từ

thực vật có lợi thế là bỏ qua công đoạn lên men,

tinh sạch, trữ lạnh, tiêm vô trùng như vaccine

thông thường Vaccine kháng nguyên biểu hiện

trong lục lạp được bảo vệ khỏi sự phân hủy của

acid và enzyme trong bao tử, và được phóng

thích trong ruột khi vách tế bào lục lạp bị phân

hủy bởi những vi khuẩn trong ruột

Với việc tiếp cận kỹ thuật hiện đại trong công tác chuyển gen lục lạp, nghiên cứu sản xuất protein kháng nguyên HIV-1 p24 từ thực vật là hướng nghiên cứu đang được nhắm đến Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện

chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Lycopersicon esculentum) bằng kỹ thuật

bắn gen dựa trên những công trình của các tác giả Wiebke & Ralph (2009), Nugent et al (2005), Ruf et al (2001), Staub et al (2000), Svab & Maliga (1993), Wurbs et al (2007), Zhou et al (2008) [1, 10, 12, 14, 15, 18, 20]

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Các giống cà chua được dùng trong nghiên cứu là hai giống thương mại của Công ty giống cây trồng Trang Nông: TN84 và TN386 Chúng tôi sử dụng lá thật và lá mầm cây cà chua làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen

Môi trường, điều kiện nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy in vitro là MS

(Murashige, Skoog 1962) + Vitamin B5, 30g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,8 Môi trường tái sinh chồi từ lá cà chua là MS vitamin B5 + 2,0 mg/l Zeatin + 0,2 mg/l IAA Môi trường tái sinh chồi

từ lá mầm cà chua là MS vitamin B5 + 2,0 mg/l

BA + 1,0 mg/l IAA + 0,5 mg/l Kinetin Môi trường đồng nuôi cấy là MS vitamin B5 + 1,0

Trang 2

mg/l BA + 0,1 mg/l NAA

Môi trường chọn lọc mẫu cà chua chuyển gen

kháng spectinomycin là môi trường tái sinh tối ưu

+ spectinomycin nồng độ từ 50 mg/l Tăng dần

nồng độ kháng sinh sau mỗi lần cấy chọn lọc

Điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ từ 25-26oC,

thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ

chiếu sáng 500-1000 lux đối với mẫu sau bắn

gen; nhiệt độ từ 25-26oC, thời gian chiếu sáng

10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500-3000

lux đối với mẫu tái sinh chồi và cây con

Vector chuyển gen

Plasmid pITB-HIV-1 p24 được chúng tôi thiết

kế, được sử dụng làm vector chuyển gen vào lạp

thể cà chua Gen HIV-1 p24 được điều khiển bởi promoter rrn (ribosomal RNA operon promoter)

đặc hiệu cho chuyển gen vào lạp thể với trình tự

kết thúc của gen TrbcL và gen chọn lọc aadA kiểm soát bởi promoter rrn và trình tự kết thúc của gen psbA Cassette chứa những gen này được gài vào giữa hai gen trnfM và trnG của bộ gen lạp thể

Kích thước vector 8344 bp (hình 1)

Hình 1 Sơ đồ cấu trúc vector lục lạp plasmid pITB-HIV-1 p24

Phương pháp

Tạo cây cà chua in vitro

Hạt cà chua mua từ các công ty giống cây

trồng được khử trùng bằng cồn 70% trong một

phút, rửa với nước vô trùng Tiếp theo khử

trùng bằng nước javel 3,8% được pha thêm

nước vô trùng thành nồng độ 1,9% với thời gian

khử trùng 10, 20 và 30 phút Rửa lại 3 lần với

nước vô trùng Hạt sau khử trùng được đặt trong

môi trường 1/2 MS cho nảy mầm

Tách chiết plasmid DNA

Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn

E coli DH5α mang plasmid pITB-HIV-1 p24 là

LB (Luria-Bertani) có chứa 100 mg/l ampicillin

Chúng tôi dùng QIAGEN Plasmid Mega kit để

tách chiết DNA plasmid dùng làm vật liệu

chuyển nạp gen

Qui trình chuyển nạp gen

Theo Kikkert et al (2005), Sanford et al

(1993) [5, 13], chuyển gen vào lạp thể dùng hệ

thống bắn gen PDS-1000/He cần hạt vàng có

kích thức 0,6 µm, Rupture disks 1.100 psi, áp

suất 28 mmHg

Chuẩn bị mẫu chuyển gen: Lá mầm sau 10

ngày nảy mầm, lá thật cà chua sau khoảng 4

tuần nuôi cấy in vitro sẽ được cắt và đặt mặt gân

lá hướng lên trên trong đĩa petri đường kính 9

cm chứa môi trường tái sinh trước một ngày để chuẩn bị bắn gen

Kết dính plasmid DNA vào hạt vàng: Lấy 50

µl dung dịch vàng, vortex 2 phút Thêm 10 µg DNA (nồng độ 1 µg/1µl) Thêm 50 µl CaCl2 2,5M Thêm 20 µl spermidine 0,1 M, vortex 3 phút Thêm 200 µl cồn tuyệt đối Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 giây Loại bỏ phần dịch phía trên tủa Lập lại lần thứ hai bước này Thêm 75

µl cồn tuyệt đối và trộn đều dung dịch vàng-DNA 5 giây

Thực hiện thao tác bắn gen: Hút 10 µl

vàng/DNA cho vào mỗi Macrocarrier trong hepta, để khô tự nhiên 5 phút trong tủ cấy vô trùng Đặt mẫu ở vị trí khoảng cách từ hạt vàng mang plasmid đến mẫu mô là 6 cm Bật công tắc và đợi cho đến khi áp suất đạt 28 mmHg Thực hiện thao tác bắn gen

Quá trình chọn lọc sau bắn gen: Sau khi

bắn gen, mẫu được để trong tối 3 ngày trước khi cắt thành từng mẫu 3 × 3 mm cấy vào môi trường thích hợp có chất chọn lọc spectinomycin và đặt trong điều kiện ánh sáng

mờ Cấy mẫu sang môi trường chọn lọc mới sau

Trang 3

mỗi 3 tuần Nồng độ chất chọn lọc

spectinomycin trong môi trường được tăng dần

lên theo thời gian đến 300mg/l Sau khoảng 6-8

tháng, sẽ nhận được dòng chuyển gen giả định

kháng spectinomycin và kiểm tra bằng các kỹ

thuật sinh học phân tử

Kiểm tra mô, cây chuyển gen

Những dòng cà chua kháng spectinomycin

được tách chiết DNA tổng số bằng kit DNeasy

plant (QIAGEN, Đức) DNA này được dùng

cho phản ứng PCR và Southern blot

Phân tích PCR

Kiểm tra sự hiện diện của gen HIV-1 p24 và

aadA trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ

thuật PCR với những cặp mồi đặc hiệu Gen

aadA: mồi xuôi: 5’-AACCTCCTATAGACT

AGG C-3’ và mồi ngược: 5’-AGCGAAATG

TAGTGCTTACG-3’, chương trình nhiệt: 95oC:

30 giây; 30 chu kỳ (94oC: 1 phút, 52oC: 1 phút,

72oC: 2 phút) 72oC: 5 phút, khuyếch đại đoạn

DNA 250 bp Gen HIV-1 p24: mồi xuôi:

mồi ngược: 5’-TCTAGAGGAATTCTACTC

AGCTTTATGTC-3’, chương trình nhiệt: 95oC:

2 phút; 30 chu kỳ (95oC: 1 phút, 52oC: 1 phút,

72oC: 2 phút) 72oC 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 700 bp

Phân tích Southern blot

Phương pháp Nonradioactive Southern blot được dùng để phân tích dòng cà chua chuyển gen Dùng PCR DIG-labeling kit (Roche) để tạo

probe của đoạn gen lục lạp psaB (hình 2) Phản

ứng PCR gồm: PCR buffer có MgCl2 5µl, PCR DIG Labeling 5 µl, mồi xuôi 2 µl (10 pM), mồi ngược 2 µl (10 pM), Taq polymerase 0,75 µl, DNA template 1 µl, thêm nước cất vô trùng vừa

đủ 50 µl Chương trình nhiệt: 95oC: 2 phút, 30 chu kỳ (95oC: 1 phút; 52oC: 1 phút; 72oC: 2 phút) 72oC: 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 543

bp Cho 5 µg DNA của mỗi dòng chuyển nạp gen và đối chứng âm (cây không được chuyển

nạp gen) ủ với enzyme giới hạn BglII ở 37oC trong 4 giờ Mẫu DNA được điện di trên gel agarose 0,8% ở 25vol qua đêm cùng với thang chuẩn  Hind III Dùng phương pháp của

McCabe et al (1997) [9] chuyển DNA lên màng

lai Hybond (GE healthcare) và hiện phim

Hình 2 Sơ đồ probe và enzyme cắt giới hạn

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chọn lọc và tái sinh tế bào chuyển nạp gen

Trong chuyển nạp gen lục lạp, gen aadA mã

hóa protein aminoglycoside-3′-adenyl transferase

có tính kháng spectinomycin và streptomycin

Dòng cây chuyển gen sẽ phát triển xanh tốt còn

cây không chuyển gen sẽ có màu xanh nhợt nhạt

hoặc trắng và chậm phát triển Vì khi có mặt

trong môi trường, spectinomycin và streptomycin

gắn với ribosome 70S của lục lạp gây ra sự ức

chế tổng hợp protein bên trong lục lạp Trong

thời gian đầu, lạp thể chuyển gen trong một tế

bào còn ít, nên khả năng kháng kháng sinh của tế

bào chưa cao Do đó, chúng tôi chọn lọc ở nồng

độ tối thiểu gây ức chế khả năng tái sinh của mẫu

mô là 50 mg/l spectinomycin Dưới áp lực của chất chọn lọc, lạp thể chuyển gen sẽ dần thay thế lạp thể không chuyển gen, nên khả năng kháng spectinomycin tăng lên đến nồng độ 300 mg/l Việc cắt nhỏ mẫu sau bắn gen thành 3 × 3 mm có vai trò làm tăng khả năng tái sinh cây do cây cà chua chủ yếu tái sinh từ vết cắt của mẫu lá Khi đặt mẫu trong điều kiện ánh sáng mờ nhằm tăng

số lượng bộ gen trong một lạp thể đồng thời kéo dài thời gian phân chia lạp thể Với những điều kiện nuôi cấy ở trên cùng với môi trường tái sinh thích hợp giúp tạo điều kiện tối ưu để nhận được dòng cà chua kháng spectinomycin (hình 3)

Trang 4

Hình 3 a Mô sẹo sống trên môi trường có spectinomycin;

b Chồi tái sinh trên môi trường có spectinomycin

Xác định gen HIV-1 p24 và aadA

Một dòng cà chua kháng kháng sinh

spectinomycin được tách chiết DNA tổng số để

phân tích PCR Kết quả cho thấy, qua khuếch

đại với các cặp mồi đặc hiệu của gen aadA, có

sự hiện diện của các băng DNA tương ứng

250bp (hình 4) Tiếp tục dùng dòng cà chua

chuyển nạp gen đã có kết quả dương tính gen

aadA để phân tích PCR gen HIV-1 p24 với cặp mồi đặc hiệu của gen HIV-1 p24 Kết quả cho

thấy, có sự hiện diện của các băng DNA tương ứng là 700bp (hình 5) Những kết quả này trùng

với băng đối chứng dương là những gen aadA, HIV-1 p24 trong plasmid pITB HIV-1 p24

Hình 4 Phân tích PCR gen aadA

M Thang chuẩn 1kb (BioLabs);

1 Cây cà chua không chuyển gen;

2 Gen aadA của plasmid;

3: Dòng cà chua chuyển gen

Hình 5 Phân tích PCR gen HIV-1 p24

M Thang chuẩn 1kb (BioLabs);

1 Cây cà chua không chuyển gen;

2 Đối chứng dương (Gen HIV-1 p24 của plasmid);

3 Đối chứng âm (nước cất);

4: Dòng cà chua chuyển gen

Trang 5

Phân tích sự xuất hiện gen HIV-1 p24 trong

lục lạp

Hệ thống đánh dấu các DNA không dùng

đồng vị phóng xạ (nonradioactive), với ưu điểm

an toàn, probe ổn định hơn so với hệ thống sử

dụng đồng vị phóng xạ, được chúng tôi sử dụng

trong kỹ thuật southern blot Trong nghiên cứu

này, chúng tôi sử dụng hệ thống phát hiện và

đánh dấu không dùng phóng xạ, hoạt động trên

cơ sở sử dụng digoxigenin (DIG) Dòng cà chua

đã qua kiểm tra PCR tiếp tục được nghiên cứu

chứng minh thêm về sự biến nạp gen chuyển

trong bộ gen lục lạp bằng kỹ thuật Southern

blot, qua đó xác định chính xác cây cà chua

chuyển nạp gen bền vững và đồng nhất trong

lục lạp (homoplasmic) hoặc chưa đồng nhất (heteroplasmic) khi trong tế bào chứa cả hai dạng, lạp thể mang gen cần chuyển và lạp thể không mang gen cần chuyển Dưới áp lực của chất chọn lọc, những lạp thể không mang gen chuyển sẽ dần bị loại bỏ và tế bào chỉ còn loại lạp thể mang gen chuyển Lúc này kết quả nhận được sẽ là dòng cây chuyển nạp gen đồng nhấtm bền vững Kết quả thí nghiệm cho thấy,

HIV-1 p24 đã được cài vào bộ gen lạp thể

của cây cà chua nhưng ở dạng chưa đồng nhất vì có cả hai băng 5,8 kb và 3,5 kb Đối chứng âm chỉ có băng 3,5 kb, không thấy băng DNA 5,8 kb so với các dòng chuyển nạp gen (hình 6)

Hình 6 Phân tích Southern blot cây chuyển gen

a: Bảng gel điện di cho Southern blot; b: Kết quả phân tích Southern blot;

M: Thang chuẩn HindIII; 1: Cây cà chua không chuyển gen; 2: Dòng cà chua chuyển gen

KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu ứng dụng công nghệ

chuyển nạp gen vào lạp thể cà chua bằng phương

pháp bắn gen, cho phép thu nhận được một dòng

cà chua TN84 kháng spectinomycin 300 mg/l

Phân tích PCR các gen HIV-1 p24 và aadA nhận

được các băng DNA được khuếch đại tương ứng

700 bp và 250 bp Phân tích Southern blot, chúng

tôi xác nhận gen cần chuyển đã vào bộ gen lạp

thể đối với dòng chuyển gen nhưng ở dạng chưa

đồng nhất Dòng cà chua này cần tiếp tục chọn

lọc, tái sinh để nhận được dòng chuyển gen lạp

thể đồng nhất

Lời cảm ơn: Công trình được sự hỗ trợ của Văn

phòng các Chương trình Khoa học và Công

nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, Ban chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10 đã tài trợ cho nghiên cứu này

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Apel Wiebke, Bock Ralph, 2009 Enhancement of Carotenoid Biosynthesis in Transplastomic Tomatoes by Induced Lycopene-to-Provitamin A Conversion Plant Physiology, 151: 59-66

2 De Cosa B., Moar W., Lee S B., Miller M.,

Daniell H., 2001 Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to

formation of insecticidal crystals Nature Biotechnology, 19: 71-74

Trang 6

3 Dufourmantel N., Dubald M., Matringe M.,

Canard H., Garcon F., Job C., Kay E.,

Wisniewski J P., Ferullo J M., Pelissier B.,

Sailland A., Tissot G 2007 Generation and

characterization of soybean and marker-free

tobacco plastid transformants overexpressing

a bacterial 4-hydroxyphenylpyruvate

dioxygenase which provides strong herbicide

Plant Biotechnology Journal, 5: 118-133

4 Glenz K., Bouchon B., Stehle T., Wallich

R., Simon M M., Warzecha H., 2006

Production of a recombinant bacterial

lipoprotein in higher plant chloroplasts

Nature Biotechnology, 24: 76-77

5 Kikkert J R., Vidal J R., Reisch B I., 2005

Stable Transformation of Plant Cells by

Particle Bombardment/Biolistics In: Peña

L (Ed.) Transgenic Plants: Methods and

Protocols Humana Press Inc., Totowa, NJ

61-78

6 Leelavathi S., Reddy V S., 2003

Chloroplast expression of His-tagged

GUS-fusions: a general strategy to overproduce

and purify foreign proteins using

transplastomic plants as bioreactors

Molecular Breeding, 11: 49-58

7 Lelivelt C L., McCabe M S., Newell C A.,

Desnoo C B., van Dun K M.,

Birch-Machin I., Gray J C., Mills K H., Nugent J

M., 2005 Stable plastid transformation in

lettuce (Lactuca sativa L.) Plant Molecular

Biology, 58: 763-774

8 Magee A M., Coyne S., Murphy D.,

Horvath E M., Medgyesy P., Kavanagh T

A., 2004 T7 RNA polymerase-directed

expression of an antibody fragment

transgene in plastids causes a semi-lethal

pale-green seedling phenotype Transgenic

Research, 13: 325-337

9 McCabe M S., Power J B., De Laat Ad M

M., Davery M R., 1997 Detection of

single-copy genes in DNA from transgenic plants

by nonradioaction southern blot analysis

Molecular Biotechnology, 7: 79-84

10 Nugent G D., Ten Have M., Van Der Gulik

A., Dix P J., Uijtewaal B A., Mordhorst A

P., 2005 Plastid transformants of tomato

selected using mutations affecting ribosome structure Plant Cell Report, 24: 341-349

11 Obembe O O., Popoola J O., Leelavathi S., Reddy V S., 2010 Recent advances in plastid transformation Indian Journal of Science and Technology, 3(12): 1229-1235

12 Ruf S., Hermann M., Berger I J., Carrer H., Bock R., 2001 Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit

Nature Biotechnology, 19: 870-875

13 Sanford J C., Smith F D., Russell J A.,

1993 Optimizing the biolistic process for different biological applications Methods in Enzymology, 217: 483-509

14 Staub J M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P T J., Hunter P., Nehra N.,

2000 High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts Nature Biotechnology, 18: 333-338

15 Svab Z., Maliga P., 1993 High frequency plastid transformation in tobacco by

selection for a chimeric aadA gene PNAS,

90: 913-917

16 Verma D., Daniell H., 2007 Chloroplast vector systems for biotechnology

application Plant Physiology, 145:

1129-1143

17 Wang Huan-Huan, Yin Wei-Bo, Hu Zan-Min, 2009 Advances in chloroplast engineering Journal of Genetic & Genomics, 36: 387-398

18 Wurbs D., Ruf S., Bock R., 2007 Contained metabolic engineering in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes from the plastid genome Plant Journal, 49: 276-288

19 Ye G N., Hajdukiewicz P T., Broyles D., Rodriguez D., Xu C W., Nehra N., Staub J M., 2001 Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco Plant Journal, 25:

261-270

20 Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K.,

Trang 7

Borchers A.-M Inka, Maloney A P.,

Kavanagh T A., Gray J C., Bock R., 2008

High-level expression of human

immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes Plant Biotechnology Journal, 6: 897-913

PLASTID TRANSFORMATION OF TOMATO (Solanum lycopersicum L.) WITH HIV-1 P24 GENE BY BIOLISTIC PARTICLE DELIVERY SYSTEM

Pham Duc Tri*, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho

Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology

SUMMARY

Plastid transformation in tomato (Solanum Lycopersicum L.) is carried out using vector carrying HIV-1 p24 gene and a selection of aadA gene, spectinomycin for resistance to antibiotics, and streptomycin We

used the hepta adaptor to replace the rupture disk retaining cap and microcarrier launch assembly Three days after bombardment, the leaves and cotyledons were cut into small pieces each of 3 × 3 mm and placed on medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l Zeatin, 0.2 mg/l IAA, 50 mg/l spectinomycin for leaves, and medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l BAP, 1.0 mg/l IAA, 0.5mg/l Kinetin, 50 mg/l spectinomycin for cotyledons Selected further time on the medium containing spectinomycin was up to

300 mg/l PCR analysis of aadA and HIV-1 p24 genes of the tomato plastid transformation lines showed the

presence of DNA amplification with the corresponding 250bp and 700bp Southern blot analysis confirmed that the foreign genes were inserted into the tomato plastid genome The result indicated the presence of

HIV-1 p24 in the tomato plastid genome with the presence of DNA band of 5.8 kb However, it is heteroplasmic transformant because it has a DNA band of 3.5 kb of wide type plant

Keywords: Chloroplast transformation, Solanum lycopersicum L., HIV-1 p24 gene, aadA gene, promoter

RRN

Ngày nhận bài: 21-6-2012

Ngày đăng: 14/01/2020, 05:55

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w