Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum) cùng với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien vào lá thật và lá mầm. Hepta adaptor được dùng trong những nghiên cứu chuyển gien. Sau ba ngày bắn gien, mẫu được cắt thành những miếng 3 × 3 mm. Lá thật đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; và lá mầm đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin. Tăng dần nồng độ spectinomycin lên đến 300 mg/l qua những lần cấy chuyền. Phân tích PCR gien aadA và gien HIV-1 p24 cho thấy có sự có mặt của băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp trong các dòng cà chua chuyển gien. Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp trong bộ gien lạp thể cây cà chua ở dạng không đồng nhất vì cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb của lạp thể chuyển gien và 3,5 kb của lạp thể không chuyển gien.
Trang 1CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 P24 VÀO LẠP THỂ CÂY CÀ CHUA
(Solanum lycopersicum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN
Phạm Đức Trí*, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)phamductri75@gmail.com
TÓM TẮT: Nghiên cứu chuyển nạp gien HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Solanum lycopersicum)
cùng với gien chọn lọc aadA kháng spectinomycin và streptomycin được thực hiện bằng cách bắn gien
vào lá thật và lá mầm Hepta adaptor được dùng trong những nghiên cứu chuyển gien Sau ba ngày bắn gien, mẫu được cắt thành những miếng 3 × 3 mm Lá thật đặt trên môi trường MS vitamin B5 có bổ sung zeatin 2,0 mg/l, IAA 0,2 mg/l, 50 mg/l spectinomycin; và lá mầm đặt trên môi trường MS vitamin B5 có
bổ sung BA 2,0mg/l, IAA1,0mg/l, Kinetin 0,5 mg/l, 50 mg/l spectinomycin Tăng dần nồng độ
spectinomycin lên đến 300 mg/l qua những lần cấy chuyền Phân tích PCR gien aadA và gien HIV-1 p24
cho thấy có sự có mặt của băng DNA khuếch đại tương ứng 250 bp, 700 bp trong các dòng cà chua
chuyển gien Kỹ thuật Southern blot phân tích gien HIV-1 p24 tái tổ hợp trong bộ gien lạp thể cây cà chua
ở dạng không đồng nhất vì cho hai băng DNA khuếch đại tương ứng 5,8 kb của lạp thể chuyển gien và 3,5
kb của lạp thể không chuyển gien
Từ khóa: Solanum lycopersicum, chuyển gien vào lục lạp, gien aadA, giene HIV-1 p24, promoter RRN
MỞ ĐẦU
Từ những năm cuối thế kỷ 20, hướng
chuyển gen vào lục lạp cây trồng đã được các
nhà khoa học quan tâm vì những thuận lợi của
nó Obembe et al (2010), Wang et al (2009)
[11, 17] đã cho rằng, gen lục lạp di truyền theo
mẹ sẽ hạn chế sự phát tán gen; số lượng bộ gen
trong lục lạp sẽ giúp cho gen mục tiêu biểu hiện
ở mức cao hơn khi chuyển gen vào nhân;
chuyển gen vào lục lạp được thực hiện theo
nguyên tắc tái tổ hợp tương đồng giữa DNA
vector và DNA lục lạp, điều này cho phép biết
được chính xác vị trí gen được chuyển vào và
không còn lo lắng hiệu quả biểu hiện; chuyển
gen lục lạp không có hiện tượng gen im lặng
như trong chuyển gen nhân
Đến nay, những thành công từ nghiên cứu
chuyển gen vào lục lạp đã tạo ra những cây trồng
có khả năng kháng sâu [2], kháng thuốc diệt cỏ
[3, 19], những protein dược liệu [6, 8] và đặc
biệt là những vaccine từ thực vật [4, 7, 20]
Obembe et al (2010) [11] cho rằng, vaccine từ
thực vật có lợi thế là bỏ qua công đoạn lên men,
tinh sạch, trữ lạnh, tiêm vô trùng như vaccine
thông thường Vaccine kháng nguyên biểu hiện
trong lục lạp được bảo vệ khỏi sự phân hủy của
acid và enzyme trong bao tử, và được phóng
thích trong ruột khi vách tế bào lục lạp bị phân
hủy bởi những vi khuẩn trong ruột
Với việc tiếp cận kỹ thuật hiện đại trong công tác chuyển gen lục lạp, nghiên cứu sản xuất protein kháng nguyên HIV-1 p24 từ thực vật là hướng nghiên cứu đang được nhắm đến Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện
chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cây cà chua (Lycopersicon esculentum) bằng kỹ thuật
bắn gen dựa trên những công trình của các tác giả Wiebke & Ralph (2009), Nugent et al (2005), Ruf et al (2001), Staub et al (2000), Svab & Maliga (1993), Wurbs et al (2007), Zhou et al (2008) [1, 10, 12, 14, 15, 18, 20]
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Các giống cà chua được dùng trong nghiên cứu là hai giống thương mại của Công ty giống cây trồng Trang Nông: TN84 và TN386 Chúng tôi sử dụng lá thật và lá mầm cây cà chua làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen
Môi trường, điều kiện nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy in vitro là MS
(Murashige, Skoog 1962) + Vitamin B5, 30g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,8 Môi trường tái sinh chồi từ lá cà chua là MS vitamin B5 + 2,0 mg/l Zeatin + 0,2 mg/l IAA Môi trường tái sinh chồi
từ lá mầm cà chua là MS vitamin B5 + 2,0 mg/l
BA + 1,0 mg/l IAA + 0,5 mg/l Kinetin Môi trường đồng nuôi cấy là MS vitamin B5 + 1,0
Trang 2mg/l BA + 0,1 mg/l NAA
Môi trường chọn lọc mẫu cà chua chuyển gen
kháng spectinomycin là môi trường tái sinh tối ưu
+ spectinomycin nồng độ từ 50 mg/l Tăng dần
nồng độ kháng sinh sau mỗi lần cấy chọn lọc
Điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ từ 25-26oC,
thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ
chiếu sáng 500-1000 lux đối với mẫu sau bắn
gen; nhiệt độ từ 25-26oC, thời gian chiếu sáng
10 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500-3000
lux đối với mẫu tái sinh chồi và cây con
Vector chuyển gen
Plasmid pITB-HIV-1 p24 được chúng tôi thiết
kế, được sử dụng làm vector chuyển gen vào lạp
thể cà chua Gen HIV-1 p24 được điều khiển bởi promoter rrn (ribosomal RNA operon promoter)
đặc hiệu cho chuyển gen vào lạp thể với trình tự
kết thúc của gen TrbcL và gen chọn lọc aadA kiểm soát bởi promoter rrn và trình tự kết thúc của gen psbA Cassette chứa những gen này được gài vào giữa hai gen trnfM và trnG của bộ gen lạp thể
Kích thước vector 8344 bp (hình 1)
Hình 1 Sơ đồ cấu trúc vector lục lạp plasmid pITB-HIV-1 p24
Phương pháp
Tạo cây cà chua in vitro
Hạt cà chua mua từ các công ty giống cây
trồng được khử trùng bằng cồn 70% trong một
phút, rửa với nước vô trùng Tiếp theo khử
trùng bằng nước javel 3,8% được pha thêm
nước vô trùng thành nồng độ 1,9% với thời gian
khử trùng 10, 20 và 30 phút Rửa lại 3 lần với
nước vô trùng Hạt sau khử trùng được đặt trong
môi trường 1/2 MS cho nảy mầm
Tách chiết plasmid DNA
Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn
E coli DH5α mang plasmid pITB-HIV-1 p24 là
LB (Luria-Bertani) có chứa 100 mg/l ampicillin
Chúng tôi dùng QIAGEN Plasmid Mega kit để
tách chiết DNA plasmid dùng làm vật liệu
chuyển nạp gen
Qui trình chuyển nạp gen
Theo Kikkert et al (2005), Sanford et al
(1993) [5, 13], chuyển gen vào lạp thể dùng hệ
thống bắn gen PDS-1000/He cần hạt vàng có
kích thức 0,6 µm, Rupture disks 1.100 psi, áp
suất 28 mmHg
Chuẩn bị mẫu chuyển gen: Lá mầm sau 10
ngày nảy mầm, lá thật cà chua sau khoảng 4
tuần nuôi cấy in vitro sẽ được cắt và đặt mặt gân
lá hướng lên trên trong đĩa petri đường kính 9
cm chứa môi trường tái sinh trước một ngày để chuẩn bị bắn gen
Kết dính plasmid DNA vào hạt vàng: Lấy 50
µl dung dịch vàng, vortex 2 phút Thêm 10 µg DNA (nồng độ 1 µg/1µl) Thêm 50 µl CaCl2 2,5M Thêm 20 µl spermidine 0,1 M, vortex 3 phút Thêm 200 µl cồn tuyệt đối Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 giây Loại bỏ phần dịch phía trên tủa Lập lại lần thứ hai bước này Thêm 75
µl cồn tuyệt đối và trộn đều dung dịch vàng-DNA 5 giây
Thực hiện thao tác bắn gen: Hút 10 µl
vàng/DNA cho vào mỗi Macrocarrier trong hepta, để khô tự nhiên 5 phút trong tủ cấy vô trùng Đặt mẫu ở vị trí khoảng cách từ hạt vàng mang plasmid đến mẫu mô là 6 cm Bật công tắc và đợi cho đến khi áp suất đạt 28 mmHg Thực hiện thao tác bắn gen
Quá trình chọn lọc sau bắn gen: Sau khi
bắn gen, mẫu được để trong tối 3 ngày trước khi cắt thành từng mẫu 3 × 3 mm cấy vào môi trường thích hợp có chất chọn lọc spectinomycin và đặt trong điều kiện ánh sáng
mờ Cấy mẫu sang môi trường chọn lọc mới sau
Trang 3mỗi 3 tuần Nồng độ chất chọn lọc
spectinomycin trong môi trường được tăng dần
lên theo thời gian đến 300mg/l Sau khoảng 6-8
tháng, sẽ nhận được dòng chuyển gen giả định
kháng spectinomycin và kiểm tra bằng các kỹ
thuật sinh học phân tử
Kiểm tra mô, cây chuyển gen
Những dòng cà chua kháng spectinomycin
được tách chiết DNA tổng số bằng kit DNeasy
plant (QIAGEN, Đức) DNA này được dùng
cho phản ứng PCR và Southern blot
Phân tích PCR
Kiểm tra sự hiện diện của gen HIV-1 p24 và
aadA trong dòng cà chua chuyển gen bằng kỹ
thuật PCR với những cặp mồi đặc hiệu Gen
aadA: mồi xuôi: 5’-AACCTCCTATAGACT
AGG C-3’ và mồi ngược: 5’-AGCGAAATG
TAGTGCTTACG-3’, chương trình nhiệt: 95oC:
30 giây; 30 chu kỳ (94oC: 1 phút, 52oC: 1 phút,
72oC: 2 phút) 72oC: 5 phút, khuyếch đại đoạn
DNA 250 bp Gen HIV-1 p24: mồi xuôi:
mồi ngược: 5’-TCTAGAGGAATTCTACTC
AGCTTTATGTC-3’, chương trình nhiệt: 95oC:
2 phút; 30 chu kỳ (95oC: 1 phút, 52oC: 1 phút,
72oC: 2 phút) 72oC 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 700 bp
Phân tích Southern blot
Phương pháp Nonradioactive Southern blot được dùng để phân tích dòng cà chua chuyển gen Dùng PCR DIG-labeling kit (Roche) để tạo
probe của đoạn gen lục lạp psaB (hình 2) Phản
ứng PCR gồm: PCR buffer có MgCl2 5µl, PCR DIG Labeling 5 µl, mồi xuôi 2 µl (10 pM), mồi ngược 2 µl (10 pM), Taq polymerase 0,75 µl, DNA template 1 µl, thêm nước cất vô trùng vừa
đủ 50 µl Chương trình nhiệt: 95oC: 2 phút, 30 chu kỳ (95oC: 1 phút; 52oC: 1 phút; 72oC: 2 phút) 72oC: 5 phút, khuyếch đại đoạn DNA 543
bp Cho 5 µg DNA của mỗi dòng chuyển nạp gen và đối chứng âm (cây không được chuyển
nạp gen) ủ với enzyme giới hạn BglII ở 37oC trong 4 giờ Mẫu DNA được điện di trên gel agarose 0,8% ở 25vol qua đêm cùng với thang chuẩn Hind III Dùng phương pháp của
McCabe et al (1997) [9] chuyển DNA lên màng
lai Hybond (GE healthcare) và hiện phim
Hình 2 Sơ đồ probe và enzyme cắt giới hạn
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chọn lọc và tái sinh tế bào chuyển nạp gen
Trong chuyển nạp gen lục lạp, gen aadA mã
hóa protein aminoglycoside-3′-adenyl transferase
có tính kháng spectinomycin và streptomycin
Dòng cây chuyển gen sẽ phát triển xanh tốt còn
cây không chuyển gen sẽ có màu xanh nhợt nhạt
hoặc trắng và chậm phát triển Vì khi có mặt
trong môi trường, spectinomycin và streptomycin
gắn với ribosome 70S của lục lạp gây ra sự ức
chế tổng hợp protein bên trong lục lạp Trong
thời gian đầu, lạp thể chuyển gen trong một tế
bào còn ít, nên khả năng kháng kháng sinh của tế
bào chưa cao Do đó, chúng tôi chọn lọc ở nồng
độ tối thiểu gây ức chế khả năng tái sinh của mẫu
mô là 50 mg/l spectinomycin Dưới áp lực của chất chọn lọc, lạp thể chuyển gen sẽ dần thay thế lạp thể không chuyển gen, nên khả năng kháng spectinomycin tăng lên đến nồng độ 300 mg/l Việc cắt nhỏ mẫu sau bắn gen thành 3 × 3 mm có vai trò làm tăng khả năng tái sinh cây do cây cà chua chủ yếu tái sinh từ vết cắt của mẫu lá Khi đặt mẫu trong điều kiện ánh sáng mờ nhằm tăng
số lượng bộ gen trong một lạp thể đồng thời kéo dài thời gian phân chia lạp thể Với những điều kiện nuôi cấy ở trên cùng với môi trường tái sinh thích hợp giúp tạo điều kiện tối ưu để nhận được dòng cà chua kháng spectinomycin (hình 3)
Trang 4
Hình 3 a Mô sẹo sống trên môi trường có spectinomycin;
b Chồi tái sinh trên môi trường có spectinomycin
Xác định gen HIV-1 p24 và aadA
Một dòng cà chua kháng kháng sinh
spectinomycin được tách chiết DNA tổng số để
phân tích PCR Kết quả cho thấy, qua khuếch
đại với các cặp mồi đặc hiệu của gen aadA, có
sự hiện diện của các băng DNA tương ứng
250bp (hình 4) Tiếp tục dùng dòng cà chua
chuyển nạp gen đã có kết quả dương tính gen
aadA để phân tích PCR gen HIV-1 p24 với cặp mồi đặc hiệu của gen HIV-1 p24 Kết quả cho
thấy, có sự hiện diện của các băng DNA tương ứng là 700bp (hình 5) Những kết quả này trùng
với băng đối chứng dương là những gen aadA, HIV-1 p24 trong plasmid pITB HIV-1 p24
Hình 4 Phân tích PCR gen aadA
M Thang chuẩn 1kb (BioLabs);
1 Cây cà chua không chuyển gen;
2 Gen aadA của plasmid;
3: Dòng cà chua chuyển gen
Hình 5 Phân tích PCR gen HIV-1 p24
M Thang chuẩn 1kb (BioLabs);
1 Cây cà chua không chuyển gen;
2 Đối chứng dương (Gen HIV-1 p24 của plasmid);
3 Đối chứng âm (nước cất);
4: Dòng cà chua chuyển gen
Trang 5Phân tích sự xuất hiện gen HIV-1 p24 trong
lục lạp
Hệ thống đánh dấu các DNA không dùng
đồng vị phóng xạ (nonradioactive), với ưu điểm
an toàn, probe ổn định hơn so với hệ thống sử
dụng đồng vị phóng xạ, được chúng tôi sử dụng
trong kỹ thuật southern blot Trong nghiên cứu
này, chúng tôi sử dụng hệ thống phát hiện và
đánh dấu không dùng phóng xạ, hoạt động trên
cơ sở sử dụng digoxigenin (DIG) Dòng cà chua
đã qua kiểm tra PCR tiếp tục được nghiên cứu
chứng minh thêm về sự biến nạp gen chuyển
trong bộ gen lục lạp bằng kỹ thuật Southern
blot, qua đó xác định chính xác cây cà chua
chuyển nạp gen bền vững và đồng nhất trong
lục lạp (homoplasmic) hoặc chưa đồng nhất (heteroplasmic) khi trong tế bào chứa cả hai dạng, lạp thể mang gen cần chuyển và lạp thể không mang gen cần chuyển Dưới áp lực của chất chọn lọc, những lạp thể không mang gen chuyển sẽ dần bị loại bỏ và tế bào chỉ còn loại lạp thể mang gen chuyển Lúc này kết quả nhận được sẽ là dòng cây chuyển nạp gen đồng nhấtm bền vững Kết quả thí nghiệm cho thấy,
HIV-1 p24 đã được cài vào bộ gen lạp thể
của cây cà chua nhưng ở dạng chưa đồng nhất vì có cả hai băng 5,8 kb và 3,5 kb Đối chứng âm chỉ có băng 3,5 kb, không thấy băng DNA 5,8 kb so với các dòng chuyển nạp gen (hình 6)
Hình 6 Phân tích Southern blot cây chuyển gen
a: Bảng gel điện di cho Southern blot; b: Kết quả phân tích Southern blot;
M: Thang chuẩn HindIII; 1: Cây cà chua không chuyển gen; 2: Dòng cà chua chuyển gen
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu ứng dụng công nghệ
chuyển nạp gen vào lạp thể cà chua bằng phương
pháp bắn gen, cho phép thu nhận được một dòng
cà chua TN84 kháng spectinomycin 300 mg/l
Phân tích PCR các gen HIV-1 p24 và aadA nhận
được các băng DNA được khuếch đại tương ứng
700 bp và 250 bp Phân tích Southern blot, chúng
tôi xác nhận gen cần chuyển đã vào bộ gen lạp
thể đối với dòng chuyển gen nhưng ở dạng chưa
đồng nhất Dòng cà chua này cần tiếp tục chọn
lọc, tái sinh để nhận được dòng chuyển gen lạp
thể đồng nhất
Lời cảm ơn: Công trình được sự hỗ trợ của Văn
phòng các Chương trình Khoa học và Công
nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, Ban chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10 đã tài trợ cho nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Apel Wiebke, Bock Ralph, 2009 Enhancement of Carotenoid Biosynthesis in Transplastomic Tomatoes by Induced Lycopene-to-Provitamin A Conversion Plant Physiology, 151: 59-66
2 De Cosa B., Moar W., Lee S B., Miller M.,
Daniell H., 2001 Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to
formation of insecticidal crystals Nature Biotechnology, 19: 71-74
Trang 63 Dufourmantel N., Dubald M., Matringe M.,
Canard H., Garcon F., Job C., Kay E.,
Wisniewski J P., Ferullo J M., Pelissier B.,
Sailland A., Tissot G 2007 Generation and
characterization of soybean and marker-free
tobacco plastid transformants overexpressing
a bacterial 4-hydroxyphenylpyruvate
dioxygenase which provides strong herbicide
Plant Biotechnology Journal, 5: 118-133
4 Glenz K., Bouchon B., Stehle T., Wallich
R., Simon M M., Warzecha H., 2006
Production of a recombinant bacterial
lipoprotein in higher plant chloroplasts
Nature Biotechnology, 24: 76-77
5 Kikkert J R., Vidal J R., Reisch B I., 2005
Stable Transformation of Plant Cells by
Particle Bombardment/Biolistics In: Peña
L (Ed.) Transgenic Plants: Methods and
Protocols Humana Press Inc., Totowa, NJ
61-78
6 Leelavathi S., Reddy V S., 2003
Chloroplast expression of His-tagged
GUS-fusions: a general strategy to overproduce
and purify foreign proteins using
transplastomic plants as bioreactors
Molecular Breeding, 11: 49-58
7 Lelivelt C L., McCabe M S., Newell C A.,
Desnoo C B., van Dun K M.,
Birch-Machin I., Gray J C., Mills K H., Nugent J
M., 2005 Stable plastid transformation in
lettuce (Lactuca sativa L.) Plant Molecular
Biology, 58: 763-774
8 Magee A M., Coyne S., Murphy D.,
Horvath E M., Medgyesy P., Kavanagh T
A., 2004 T7 RNA polymerase-directed
expression of an antibody fragment
transgene in plastids causes a semi-lethal
pale-green seedling phenotype Transgenic
Research, 13: 325-337
9 McCabe M S., Power J B., De Laat Ad M
M., Davery M R., 1997 Detection of
single-copy genes in DNA from transgenic plants
by nonradioaction southern blot analysis
Molecular Biotechnology, 7: 79-84
10 Nugent G D., Ten Have M., Van Der Gulik
A., Dix P J., Uijtewaal B A., Mordhorst A
P., 2005 Plastid transformants of tomato
selected using mutations affecting ribosome structure Plant Cell Report, 24: 341-349
11 Obembe O O., Popoola J O., Leelavathi S., Reddy V S., 2010 Recent advances in plastid transformation Indian Journal of Science and Technology, 3(12): 1229-1235
12 Ruf S., Hermann M., Berger I J., Carrer H., Bock R., 2001 Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit
Nature Biotechnology, 19: 870-875
13 Sanford J C., Smith F D., Russell J A.,
1993 Optimizing the biolistic process for different biological applications Methods in Enzymology, 217: 483-509
14 Staub J M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P T J., Hunter P., Nehra N.,
2000 High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts Nature Biotechnology, 18: 333-338
15 Svab Z., Maliga P., 1993 High frequency plastid transformation in tobacco by
selection for a chimeric aadA gene PNAS,
90: 913-917
16 Verma D., Daniell H., 2007 Chloroplast vector systems for biotechnology
application Plant Physiology, 145:
1129-1143
17 Wang Huan-Huan, Yin Wei-Bo, Hu Zan-Min, 2009 Advances in chloroplast engineering Journal of Genetic & Genomics, 36: 387-398
18 Wurbs D., Ruf S., Bock R., 2007 Contained metabolic engineering in tomatoes by expression of carotenoid biosynthesis genes from the plastid genome Plant Journal, 49: 276-288
19 Ye G N., Hajdukiewicz P T., Broyles D., Rodriguez D., Xu C W., Nehra N., Staub J M., 2001 Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco Plant Journal, 25:
261-270
20 Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K.,
Trang 7Borchers A.-M Inka, Maloney A P.,
Kavanagh T A., Gray J C., Bock R., 2008
High-level expression of human
immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes Plant Biotechnology Journal, 6: 897-913
PLASTID TRANSFORMATION OF TOMATO (Solanum lycopersicum L.) WITH HIV-1 P24 GENE BY BIOLISTIC PARTICLE DELIVERY SYSTEM
Pham Duc Tri*, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho
Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology
SUMMARY
Plastid transformation in tomato (Solanum Lycopersicum L.) is carried out using vector carrying HIV-1 p24 gene and a selection of aadA gene, spectinomycin for resistance to antibiotics, and streptomycin We
used the hepta adaptor to replace the rupture disk retaining cap and microcarrier launch assembly Three days after bombardment, the leaves and cotyledons were cut into small pieces each of 3 × 3 mm and placed on medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l Zeatin, 0.2 mg/l IAA, 50 mg/l spectinomycin for leaves, and medium MS salts and B5 vitamins containing 2.0 mg/l BAP, 1.0 mg/l IAA, 0.5mg/l Kinetin, 50 mg/l spectinomycin for cotyledons Selected further time on the medium containing spectinomycin was up to
300 mg/l PCR analysis of aadA and HIV-1 p24 genes of the tomato plastid transformation lines showed the
presence of DNA amplification with the corresponding 250bp and 700bp Southern blot analysis confirmed that the foreign genes were inserted into the tomato plastid genome The result indicated the presence of
HIV-1 p24 in the tomato plastid genome with the presence of DNA band of 5.8 kb However, it is heteroplasmic transformant because it has a DNA band of 3.5 kb of wide type plant
Keywords: Chloroplast transformation, Solanum lycopersicum L., HIV-1 p24 gene, aadA gene, promoter
RRN
Ngày nhận bài: 21-6-2012