Nghiên cứu chuyển gen tạo protein tái tổ hợp HIV 1 p24 vào lục lạp cây cà chua (lycopersicon esculentum mill )

Lu n án ti n s : Sinh h c M CL C TRANG PH BÌA L I CAM OAN M C L C ……………………………………………………………………………….1 DANH M C CÁC B NG DANH M C CÁC HÌNH DANH M C CÁC KÝ T VI T T T M U CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 11 1.1 i t ng nghiên c u: Cà Chua 12 1.2 Virus HIV type 14 1.3 L p th - bào quan s ng t bào th c v t 16 1.4 S n xu t protein d c li u t th c v t 26 1.5 Công ngh chuy n gen l c l p 29 1.5.1 Nh ng thành t u c a công ngh chuy n gen l c l p 29 1.5.2 Nh ng u m khó kh n c a công ngh chuy n gen l c l p 30 1.5.3 Thi t k m t vector chuy n gen l c l p 32 1.6 Các ph ng pháp chuy n gen vào l c l p 37 1.7 Các ph ng pháp lo i b gen ch n l c 37 1.8 Nh ng công trình chuy n gen c a HIV vào th c v t 40 1.9 Chuy n gen vào l c l p cà chua 42 1.9.1 L c l p cà chua 42 1.9.2 So sánh v i b gen l c l p thu c 44 1.9.3 Nh ng công trình chuy n gen vào l c l p cà chua thành công 46 1.9.4 Vector chuy n gen vào l c l p pITB-HIV-1-p24 50 CH NG 2: V T LI U & PH NG PHÁP NGHIÊN C U 52 2.1 Kh o sát môi tr ng tái sinh 54 2.2 Kh o sát tính kháng spectinomycin c a mô th t, t di p 55 2.3 Tách chi t DNA plasmid 56 2.4 Chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p cà chua b ng ph ng pháp b n gen 57 2.5 Tách chi t DNA t ng s t th c v t 61 2.6 Ph ng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 61 2.7 Southern blot 66 U U U Lu n án ti n s : Sinh h c 2.8 Tr ng cà chua v n m 73 2.9 Tách chi t protein t ng s 74 2.10 nh l ng protein t ng b ng ph ng pháp Bradford 74 2.11 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis) 75 2.12 Western blot 78 2.13 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 81 CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N 86 3.1 Xác đ nh t l tái sinh 87 3.1.1 Xác đ nh t l tái sinh c a t di p 87 3.1.2 Xác đ nh t l tái sinh c a th t 90 3.2 K t qu kh o sát nh h ng c a n ng đ kháng sinh 94 3.2.1 nh h ng c a spectinomycin lên kh n ng tái sinh c a th t 94 3.2.2 nh h ng c a spectinomycin lên kh n ng tái sinh c a t di p 95 3.3 K t qu b n gen 96 3.3.1 Thí nghi m b n gen n ng đ spectinomycin ban đ u 50mg/l 96 3.3.2 Thí nghi m b n gen ch n l c môi tr ng tái sinh tr c ti p 100 3.4 Ki u hình cà chua chuy n gen l c l p 103 3.5 K t qu phân tích PCR dòng cà chua kháng spectinomycin 108 3.5.1 K t qu phân tích PCR gen aadA 108 3.5.2 K t qu phân tích PCR gen HIV-1-p24 109 3.6 Xác đ nh gen HIV-1-p24 vào b gen l p th cà chua 111 3.6.1 K t qu phân tích PCR dòng cà chua chuy n n p gen 111 3.6.2 K t qu phân tích Southern blot dòng cà chua chuy n n p gen 113 3.7 Phân tích Western blot 117 3.7.1 Hàm l ng protein t ng s m u kh o sát 117 3.7.2 Phân tích Western blot nh ng dòng cà chua chuy n n p gen l c l p 119 3.7.3 So sánh Western blot thu c cà chua chuy n n p gen l c l p 122 3.8 ELISA 125 CH NG 4: K T LU N VÀ KI N NGH 132 TÀI LI U THAM KH O 136 PH L C 155 PH L C 164 Lu n án ti n s : Sinh h c DANH M C CÁC B NG B B B B B B B B B B B B B B B ng 1.1: Nh ng protein d c li u tái t h p đ c t o t th c v t 27 ng 1.2: Nh ng công trình chuy n gen vào l c l p dùng aadA làm gen ch n l c 35 ng 1.3: Nh ng k t qu chuy n gen t o protein HIV-1 vào th c v t 41 ng 1.4: So sánh b gen l c l p c a thu c v i b gen l c l p cà chua 44 ng 1.5: So sánh đ t ng đ ng c a gen l c l p cà chua, thu c 45 ng 2.1: Thành ph n cho m t ph n ng PCR 50µl 70 ng 2.2: Thành ph n c a resolving gel stacking gel 77 ng 3.1: K t qu t l tái sinh t di p môi tr ng kh o sát sau tu n 87 ng 3.2: K t qu t l tái sinh th t môi tr ng kh o sát sau tu n 92 ng 3.3: Thí nghi m b n gen n ng đ spectinomycin ch n l c ban đ u 50mg/l 97 ng 3.4: K t qu OD c a n ng đ BSA dùng làm đ ng chu n 117 ng 3.5: Hàm l ng protein t ng m u kh o sát 119 ng 3.6: K t qu OD n ng đ protein p24 (AG 6054) dùng làm đ ng chu n 125 ng 3.7: N ng đ protein t ng protein HIV-1-p24 m u kh o sát 126 ng 3.8: Ph n tr m n ng đ protein HIV-1-p24 protein t ng 129 Lu n án ti n s : Sinh h c DANH M C CÁC HÌNH Hình 1.1: C u trúc Virus HIV 15 Hình 1.2: S hi n di n c a protein HIV-1-p24 huy t theo th i gian 16 Hình 1.3: S bi t hóa c a l c l p t ti n l p th 18 Hình 1.4: C u t o l c l p 20 Hình 1.5: S đ DNA l p th 23 Hình 1.6: S đ mRNA c a l p th 26 Hình 1.7: S đ c u t o m t vector chuy n gen l c l p 36 Hình 1.8: S đ c u trúc b gen l c l p cà chua 42 Hình 1.9: Vector mang gen aadA c a Ruf S et al 2001 47 Hình 1.10: Vector chuy n gen c a nhóm Wurbs et al n m 2007 47 Hình 1.11: Vector chuy n gen c a nhóm Apel Bock n m 2009 49 Hình 1.12: Vector chuy n gen c a nhóm Zhou F et al n m 2008 49 Hình 1.13: C u trúc vector pITB-HIV-1-p24 c a tác gi Nguy n Th Thanh 50 Hình 2.1: S đ thí nghi m 57 Hình 2.2: B Hepta adaptor (Bio-Rad, M ) 57 Hình 2.3: H th ng súng b n gen PDS-1000/He (Bio-Rad, M ) 58 Hình 2.4: M u chu n b b n gen 59 Hình 2.5: Ph n ng PCR t o Probe DIG 66 Hình 2.6: S đ miêu t ph ng pháp Southern blot 69 Hình 2.7: S đ s n ph m DNA sau x lý b ng enzyme BglII 71 Hình 2.8: Nguyên lý c a Western blot 78 Hình 2.9: Chuy n protein qua màng b ng Semi-dry blotter 80 Hình 2.10: Nguyên lý c a ELISA Sandwich 82 Hình 3.1: K t qu t l tái sinh t di p môi tr ng kh o sát sau tu n 88 Hình 3.2: K t qu t l tái sinh th t môi tr ng kh o sát sau tu n 93 Hình 3.3: Kh o sát kh n ng tái sinh c a th t môi tr ng có spectinomycin 94 Hình 3.4: Kh o sát kh n ng tái sinh c a t di p môi tr ng có spectinomycin 95 Hình 3.5: a,b,c: Mô s o s ng môi tr ng có Spectinomycin 99 Hình 3.6: a,b,c: Mô s o chuy n màu xanh đ c chuy n sáng 99 Hình 3.7: a,b,c,d,e: Ch i chuy n gen hình thành môi tr ng tái sinh 100 Hình 3.8: Quy trình chuy n gen vào l c l p cà chua b ng ph ng pháp b n gen 102 Lu n án ti n s : Sinh h c Hình 3.9: So sánh dòng kháng spectinomycin v i đ i ch ng không chuy n gen 103 Hình 3.10: Các dòng cà chua chuy n gen in vitro 104 Hình 3.11: Cây cà chua tr ng Versatile Environmental Test Chamber tu n 105 Hình 3.12: Các dòng cà chua chuy n gen tr ng v n m 30 ngày 106 Hình 3.13: Cây cà chua 386 cà chua chuy n gen trái v n m 106 Hình 3.14: H t cà chua chuy n gen n y m m môi tr ng có spectinomycin 107 Hình 3.15: K t qu n di s n ph m PCR c a gen aadA 109 Hình 3.16: K t qu phân tích PCR gen HIV-1 p24 110 Hình 3.17: K t qu phân tích PCR b ng c p m i gen l c l p cà chua 112 Hình 3.18: PCR probe lai DNA c a gen l c l p psaB 113 Hình 3.19: i n di gel agarose m u phân tích Southern blot 114 Hình 3.20: K t qu Southern blot dòng cà chua chuy n gen 116 Hình 3.21: Tái t h p b gen l c l p 117 Hình 3.22: th đ ng chu n BSA 118 Hình 3.23: SDS-PAGE nh ng dòng cà chua chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p 120 Hình 3.24: Western blot nh ng dòng cà chua chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p 121 Hình 3.25: SDS-PAGE dòng cà chua thu c chuy n gen HIV-1-p24 123 Hình 3.26: Western blot cà chua thu c chuy n gen HIV-1 p24 124 Hình 3.27: ng chu n protein HIV-1 p24 (AG 6054 Aalto Bio Reagents) 125 Hình 3.28: th bi u di n hàm l ng protein HIV-1-p24 m u kh o sát… 127 Hình 3.29: th bi u di n ph n tr m protein HIV-1-p24 protein t ng s 130 Lu n án ti n s : Sinh h c DANH M C CÁC KÝ T VI T T T aadA aminoglycoside 3'-adenylytransferase gene AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome APS Ammonium persulfate BA Benzyl Adenine bp Base pairs BSA Bovine Serum Albumin DIG Digoxigenin DIG-AP Digoxigenin-Alkaline Phosphatase DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs deoxyribonucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HIV Human Immunodeficiency Virus HRP Horseradish peroxidase IAA Indole-3-acetic acid IR Inverted Repeat kDa Kilo Dalton Lu n án ti n s : Sinh h c LB Luria Broth LSC Large Single Copy MS Murashige and Skoog NAA 1-Naphthaleneacetic acid NT Nghi m th c PBS Phosphate Buffer Saline PBST Phosphate Buffer Saline Tween 20 PCR Polymerase Chain Reaction PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride pNPP p-Nitrophenyl Phosphate Prrn ribosomal RNA operon promoter PVDF Polyvinylidene difluoride RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SSC Saline Sodium Citrate SSC Small Single Copy TBS Tris Buffered Saline TBST Tris Buffered Saline Tween 20 UTR Untranslated region Lu n án ti n s : Sinh h c M U Lu n án “Nghiên c u chuy n gen t o protein tái t h p HIV-1-p24 vào l c l p cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.)” đ c th c hi n t i Phòng Công ngh Gen, Phòng thí nghi m tr ng m phía Nam v công ngh t bào th c v t - Vi n Sinh h c Nhi t đ i, v i s tài tr kinh phí t V n phòng Ch Công ngh tr ng m c p Nhà n c, ban ch nhi m Ch ng trình Khoa h c ng trình KC.04/06-10 Tính c p thi t c a lu n án H i ngh qu c t v AIDS l n th 19 nhóm h p t i Washington D.C t ngày 22-27 tháng n m 2012 đ a tuyên b chung “Together we will end AIDS” [71] v n cho th y m i quan tâm c a toàn nhân lo i đ i v i đ i d ch HIV/AIDS T i Vi t Nam, tính đ n ngày 31 tháng 12 n m 2011, phát hi n có ng t t c 63 t nh, 98% s huy n 77% s xã đ u i nhi m HIV T ng s ca tích l y t ghi nh n ca nhi m HIV đ u tiên cho đ n th i m 249.660 ca, v i 197.335 ng i nhi m HIV hi n v n s ng 52.325 ca t vong liên quan đ n AIDS [4] Cùng đóng góp vi c tìm ph ng pháp phòng ch ng b nh HIV/AIDS, công ngh chuy n gen th c v t có nhi u công trình chuy n gen t o nhi u dòng mang gen t o protein tái t h p c a HIV (b ng 1.3) N i b t, tìm vaccine phòng ch ng HIV m t nh ng h ng nghiên c u đ c ti n hành protein HIV-1- p24 m t thành ph n không th thi u vaccine phòng ch ng HIV Do v y, h nghiên c u t o protein tái t h p HIV-1-p24 đ nhu c u v l ng protein HIV-1-p24 tinh s ch đ ng c quan tâm phát tri n Bên c nh đó, ng d ng kit ch n đoán t o mi n d ch thu nh n kháng th đ n dòng luôn có Lu n án h đ ng đ n vi c t o protein tái t h p HIV-1-p24 t th c v t b ng ng chuy n gen Lu n án ti n s : Sinh h c Tuy nhiên, m t nh ng r i ro r t đáng lo ng i vi c phát tri n th c v t chuy n gen s phát tán gen môi tr Ph ng qua h t ph n c a chuy n gen ng pháp chuy n gen vào l c l p gi i quy t tình tr ng phát tán gen c ch di truy n theo m Hay nói cách khác, h t ph n chuy n gen l c l p không mang gen đ c chuy n n p Vì v y, nghiên c u t o protein HIV-1 p24 tái t h p t th c v t b ng ph ng pháp chuy n gen vào l c l p đáp ng tính c p thi t c a lu n án M c đích c a lu n án Chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p cà chua N i dung c a lu n án Xác đ nh t l tái sinh cho th t t di p cà chua n ng đ ch t u hòa sinh tr môi tr ng có ng th c v t khác Kh o sát ng ng c ch kh n ng tái sinh gây ch t c a spectinomycin đ i v i th t, t di p cà chua xu t qui trình chuy n gen vào l c l p cà chua b ng ph ng pháp b n gen Minh ch ng v m t di truy n nh ng dòng cà chua chuy n gen l c l p b ng k thu t sinh h c phân t (PCR, Southern blot) phân tích bi u hi n gen HIV1- p24 cà chua chuy n gen l c l p b ng ph ng pháp Western blot ELISA Ý ngh a khoa h c th c ti n c a lu n án ng d ng thành công k thu t chuy n gen vào l c l p đ t o cà chua chuy n gen l c l p đ ng l p th mang gen HIV-1-p24 Vi c xây d ng quy trình chuy n gen vào l c l p hoàn ch nh, t khâu b n gen đ n ch n l c m u sau b n gen tái sinh thành hoàn ch nh, m h ng ng d ng k thu t chuy n gen vào l c l p Lu n án ti n s : Sinh h c nh ng đ i t ng khác c ng nh v i nh ng gen h u d ng khác i v i công tác nghiên c u khoa h c, lu n án đóng vai trò góp xây d ng, hoàn thi n quy trình chuy n gen vào l c l p u ki n Vi t Nam V i b n thân, sau th c hi n lu n án, n m v ng k thu t chuy n gen b ng ph ng pháp b n gen, đúc k t nhi u kinh nghi m đ th c hi n t t k thu t phân tích sinh h c phân t , sinh hóa nh PCR, Southern blot, Western blot, ELISA Tính m i c a lu n án ây công trình nghiên c u chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p cà chua đ u tiên t i Vi t Nam Bên c nh vi c dùng th t nh nghiên c u chuy n gen vào l c l p cà chua c a tác gi n c ngoài, lu n án nh n đ c dòng cà chua chuy n gen dùng t di p làm m u chuy n gen C u trúc c a lu n án Lu n án đ li u 40 trang; ch c chia thành ph n: m đ u trang; ch ng 2: V t li u ph qu th o lu n 45 trang; ch ng 1: T ng quan tài ng pháp nghiên c u 33 trang; ch ng 3: K t ng 4: K t lu n ki n ngh trang; tài li u tham kh o 20 trang; ph l c 10 trang Lu n án có 15 b ng s li u; 52 hình bao g m s đ , đ th , hình nh; 189 tài li u tham kh o b ng hai th ti ng Vi t Anh Có công trình nghiên c u liên quan đ n lu n án đ h i ngh chuyên ngành n c 10 c đ ng t p chí Lu n án ti n s : Sinh h c 187 Ye G.N., Hajdukiewicz P.T., Broyles D., Rodriquez D., Xu C.V., Nehra N., StaubJ.M (2001) Plastid-expressed 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco Plant J 25 261-270 188 Yohn C.B., Cohen A., Rosch C., Kuchka M.R., and Mayfield S.P., (1998) Translation of the Chloroplast psbA mRNA Requires the Nuclear-encoded Poly(A)-binding Protein RB47 The Journal of Cell Biology 142(2), 435-442 189 Yusibov V., Modelska A., Steplewski K., Agadjanyan M., Weiner D., Hooper D.C., Koprowski H., (1997) Antigens produced in plants by infection with chimeric plant viruses immunize against rabies virus and HIV-1 Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 94, 57845788 190 Zerges W., and Rochaix J.D., (1994) The 5' Leader of a Chloroplast mRNA Mediates the Translational Requirements for Two Nucleus-Encoded Functions in Chlamydomonas reinhardtii Molecular and Cellular Biology 14(8), 52685277 191 Zghidi W., Merendino L., Cottet A., Mache R., Lerbs-Mache S., (2006) Nucleusencoded plastid sigma factor SIG3 transcribes specifically the psbN gene in plastids Nucleic Acids Research 35(2), 455-464 192 Zhang B., Liu D., Bao Z., Chen B., Li C., Jiang H., Wang X., Mi Z., An X., Lu J., Tong Y., (2011) High level soluble expression, one-step purification and characterization of HIV-1 p24 protein Virology Journal, 8:316 193 Zhang G., Leung C., Murdin L., Rovinski B., White K.A., (2000) In Planta Expression of HIV-1 p24 Protein Using an RNA Plant Virus-Based Expression Vector Molecular Biotechnology 14, 99-107 194 Zhang G., Rodrigues L., Rovinski B., White K.A., (2002) Production of HIV-1 p24 Protein in Transgenic Tobacco Plants Molecular Biotechnology 20, 131136 195 Zhou F., Badillo-Corona J.A., Karcher D., Gonzalez-Rabade N., Piepenburg K., Borchers A.M., Maloney A.P., Kavanagh TA., Gray J.C., Bock R., (2008) High-level expression of human immunodeficiency virus antigens from the tobacco and tomato plastid genomes Plant Biotechnology Journal 6, 897-913 196 Zubko M.K., Zubko E.I., van Zuilen K., Meyer P., Day A., (2004) Stable transformation of petunia plastids Transgenic Res 13, 523-530 154 Lu n án ti n s : Sinh h c PH L C Data file: LA MAM Title: TAI SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to Variable (TS) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 2649.333 331.167 60.416 0.0000 Within 18 98.667 5.481 Total 26 2748.000 Coefficient of Variation = 3.07% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 186.000 62.000 1.73 1.35 3.00 197.000 65.667 2.31 1.35 3.00 220.000 73.333 3.51 1.35 3.00 227.000 75.667 2.31 1.35 3.00 283.000 94.333 2.31 1.35 3.00 267.000 89.000 1.73 1.35 3.00 240.000 80.000 3.00 1.35 3.00 234.000 78.000 1.73 1.35 3.00 207.000 69.000 1.73 1.35 -Total 27.00 2061.000 76.333 10.28 1.98 Within 2.34 Bartlett's test Chi-square = 2.002 155 Lu n án ti n s : Sinh h c Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.981 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 5.481 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 5.502 s_ = 1.352 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 62.00 65.67 73.33 75.67 94.33 89.00 78.00 69.00 69.00 Ranked Order E DE BC B A A B CD CD Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 5= 6= 7= 4= 3= 8= 9= 2= 1= 94.33 89.00 78.00 75.67 73.33 69.00 69.00 65.67 62.00 A A B B BC CD CD DE E Data file: LA MAM Title: TRUNG BINH CHOI Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (Lan) with values from to Variable (Choi) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4.603 0.575 6.068 0.0007 Within 18 1.707 0.095 Total 26 6.310 156 Lu n án ti n s : Sinh h c Coefficient of Variation = 20.58% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 3.100 1.033 0.25 0.18 3.00 3.400 1.133 0.15 0.18 3.00 3.000 1.000 0.17 0.18 3.00 5.700 1.900 0.40 0.18 3.00 6.300 2.100 0.30 0.18 3.00 6.100 2.033 0.50 0.18 3.00 5.000 1.667 0.21 0.18 3.00 4.200 1.400 0.35 0.18 3.00 3.600 1.200 0.26 0.18 -Total 27.00 40.400 1.496 0.49 0.09 Within 0.31 Bartlett's test Chi-square = 3.971 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.860 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.09500 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.7244 s_ = 0.1780 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 1.030 1.130 1.000 1.900 2.100 2.030 Ranked Order C BC C AB A A Mean Mean Mean Mean Mean Mean 157 5= 6= 4= 7= 8= 9= 2.100 2.030 1.900 1.670 1.400 1.200 A A AB ABC ABC BC Lu n án ti n s : Sinh h c Mean = 1.670 ABC Mean = 1.400 ABC Mean = 1.200 BC Mean = 1.130 BC Mean = 1.030 C Mean = 1.000 C Data file: LATHAT Title: TAI SINH Function: ANOVA-1 Data case no to 36 One way ANOVA grouped over variable (NT) with values from to 12 Variable (TS) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 11 7983.524 725.775 21.777 0.0000 Within 24 799.867 33.328 Total 35 8783.391 Coefficient of Variation = 9.31% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 160.000 53.333 6.67 3.33 3.00 173.330 57.777 3.85 3.33 3.00 200.000 66.667 6.67 3.33 3.00 166.670 55.557 7.70 3.33 3.00 246.670 82.223 3.85 3.33 3.00 280.000 93.333 6.67 3.33 3.00 233.330 77.777 3.85 3.33 3.00 193.330 64.443 7.70 3.33 3.00 133.340 44.447 3.85 3.33 10 3.00 166.660 55.553 3.85 3.33 11 3.00 153.340 51.113 7.70 3.33 12 3.00 126.670 42.223 3.85 3.33 -Total 36.00 2233.340 62.037 15.84 2.64 Within 5.77 158 Lu n án ti n s : Sinh h c Bartlett's test Chi-square = 3.848 Number of Degrees of Freedom = 11 Approximate significance = 0.985 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 33.33 Error Degrees of Freedom = 24 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 13.18 s_ = 3.333 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = 12 = Ranked Order 53.33 DEFG 57.78 DEF 66.67 CD 55.56 DEFG 82.22 AB 93.33 A 77.78 BC 64.44 CDE 44.45 FG 55.55 DEFG 51.11 EFG 42.22 G Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 6= 5= 7= 3= 8= 2= 4= 10 = 1= 11 = 9= 12 = 93.33 A 82.22 AB 77.78 BC 66.67 CD 64.44 CDE 57.78 DEF 55.56 DEFG 55.55 DEFG 53.33 DEFG 51.11 EFG 44.45 FG 42.22 G Data file: LA THAT Title: TRUNG BINH CHOI Function: ANOVA-1 Data case no to 36 One way ANOVA grouped over variable (lan) with values from to 12 Variable (choi) 159 Lu n án ti n s : Sinh h c ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 11 5.376 0.489 9.563 0.0000 Within 24 1.227 0.051 Total 35 6.603 Coefficient of Variation = 17.89% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 3.100 1.033 0.25 0.13 3.00 3.000 1.000 0.26 0.13 3.00 3.700 1.233 0.32 0.13 3.00 4.300 1.433 0.21 0.13 3.00 6.300 2.100 0.20 0.13 3.00 5.300 1.767 0.31 0.13 3.00 5.100 1.700 0.26 0.13 3.00 3.700 1.233 0.15 0.13 3.00 2.700 0.900 0.20 0.13 10 3.00 3.000 1.000 0.20 0.13 11 3.00 2.800 0.933 0.12 0.13 12 3.00 2.500 0.833 0.12 0.13 -Total 36.00 45.500 1.264 0.43 0.07 Within 0.23 Bartlett's test Chi-square = 3.765 Number of Degrees of Freedom = 11 Approximate significance = 0.986 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.05100 Error Degrees of Freedom = 24 No of observations to calculate a mean = 160 Lu n án ti n s : Sinh h c Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.5157 s_ = 0.1304 at alpha = 0.010 Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = 12 = Ranked Order 1.030 CD 1.000 CD 1.230 BCD 1.430 BC 2.100 A 1.770 AB 1.700 AB 1.230 BCD 0.9000 CD 1.000 CD 0.9300 CD 0.8300 D Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 5= 6= 7= 4= 8= 3= 1= 2= 10 = 11 = 9= 12 = 2.100 A 1.770 AB 1.700 AB 1.430 BC 1.230 BCD 1.230 BCD 1.030 CD 1.000 CD 1.000 CD 0.9300 CD 0.9000 CD 0.8300 D Data file: BRADFORD Title: PROTEIN TONG Function: ANOVA-1 Data case no to 33 One way ANOVA grouped over variable (lan) with values from to 11 Variable (Tong) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 10 323.285 32.329 178.596 0.0000 Within 22 3.982 0.181 Total 32 327.267 Coefficient of Variation = 4.85% 161 Lu n án ti n s : Sinh h c Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 32.811 10.937 0.45 0.25 3.00 32.189 10.730 0.25 0.25 3.00 33.628 11.209 0.36 0.25 3.00 30.975 10.325 0.57 0.25 3.00 21.672 7.224 0.61 0.25 3.00 22.006 7.335 0.48 0.25 3.00 21.383 7.128 0.30 0.25 3.00 32.777 10.926 0.51 0.25 3.00 29.875 9.958 0.36 0.25 10 3.00 31.870 10.623 0.44 0.25 11 3.00 0.465 0.155 0.06 0.25 -Total 33.00 289.651 8.777 3.20 0.56 Within 0.43 Bartlett's test Chi-square = 7.119 Number of Degrees of Freedom = 10 Approximate significance = 0.714 Data File : Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 0.1810 Error Degrees of Freedom = 22 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.9792 s_ = 0.2456 at alpha = 0.010 162 Lu n án ti n s : Sinh h c Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 1= 2= 3= 4= 5= 6= 7= 8= 9= 10 = 11 = Ranked Order 10.94 AB 10.73 AB 11.21 A 10.33 AB 7.220 C 7.340 C 7.130 C 10.93 AB 9.960 B 10.62 AB 0.1600 D Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 3= 1= 8= 2= 10 = 4= 9= 6= 5= 7= 11 = 11.21 A 10.94 AB 10.93 AB 10.73 AB 10.62 AB 10.33 AB 9.960 B 7.340 C 7.220 C 7.130 C 0.1600 D Data file: ELISA Title: PROTEIN P24 Function: ANOVA-1 Data case no to 27 One way ANOVA grouped over variable (lan) with values from to Variable (ham luong) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.097 0.012 143.399 0.0000 Within 18 0.002 0.000 Total 26 0.099 Coefficient of Variation = 3.76% 163 Lu n án ti n s : Sinh h c Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.799 0.266 0.01 0.01 3.00 0.722 0.241 0.01 0.01 3.00 0.865 0.288 0.01 0.01 3.00 0.686 0.229 0.01 0.01 3.00 0.861 0.287 0.01 0.01 3.00 0.964 0.321 0.01 0.01 3.00 0.297 0.099 0.00 0.01 3.00 0.758 0.253 0.01 0.01 3.00 0.652 0.217 0.01 0.01 -Total 27.00 6.604 0.245 0.06 0.01 Within 0.01 Bartlett's test Chi-square = 2.940 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.938 164 Lu n án ti n s : Sinh h c PH L C Tách chi t plasmid DNA qui mô l n c a b Qiagen plasmid Mega kit L y khu n l c cho vào 20ml môi tr ampicillin nuôi l c 280 vòng/phút ng LB có b nhi t đ 37oC kho ng 8gi L y 1ml c a dung d ch LB nuôi c y b vào 500ml môi tr ch a 100mg/l ampicillin nuôi l c 280 vòng/phút sung 100mg/l ng LB m i có 37oC qua đêm Thu nh n t bào vi khu n b ng cách ly tâm dung d ch LB nuôi vi khu n nuôi qua đêm v i t c đ 2.500 vòng/phút 15 phút nhi t đ 40C b ng máy Avanti® J-E centrifuge v i rotor JLA-16.250 (Beckman Coulter) Hoà vi khu n 50ml dung d ch buffer P1 có thêm RNase A Thêm 50ml dung d ch buffer P2, tr n đ u b ng cách đ o ng l n (đ o nh cho đ n xu t hi n màu xanh) c ng tube 4- nhi t đ phòng (15- 250C) phút Thêm 50ml dung d ch buffer P3 l nh vào tr n đ u b ng cách đ o nh 4-6 l n (đ o nh cho đ n màu xanh c a lyseBlue m t đi) đá 30 phút Ly tâm v i t c đ 10.000 vòng/phút b ng máy Avanti® J-E centrifuge v i rotor JLA-16.250 30 phút 40C Hút c n th n l y ph n d ch phía Ly tâm m t l n n a v i t c đ 10000 vòng/phút 15 phút 40C Hút l y ph n d ch phía Cân b ng m t QIAGEN-tip 2500 b ng 35ml dung d ch buffer QBT ph n d ch thu nh n đ c b c vào c t B ph n d ch ch y qua c t R a QIAGEN-tip v i x 100ml dung d ch buffer QC 165 a Lu n án ti n s : Sinh h c Thôi DNA kh i c t b ng 35ml dung d ch buffer QF Thu nh n d ch DNA ch y qua c t vào m t tube m i 10 K t t a DNA b ng cách thêm vào 24ml isopropanol d ch thu đ 30 phút nhi t đ phòng vào c Ly tâm v i t c đ 6.000 vòng/phút v i rotor JA-25.50 40C C n th n lo i b ph n d ch 11 R a t a DNA b ng 7ml ethanol 70% nhi t đ phòng ly tâm v i t c đ 6000 vòng/phút v i rotor JA-25.50 10 phút 40C C n th n lo i b ph n d ch 12 khô t a DNA t 10-20 phút, sau hòa tan dung d ch TE pH 8.0 B o qu n -20oC Tách chi t DNA t ng s t th c v t Ph ng pháp Dellaporta c i bi n Cân 100mg cà chua ho c mô s o b vào ng Eppendorf 2ml Nghi n m u nitrogen l ng Thêm 1ml dung d ch tách chi t (100mM Tris pH 8, 50mM EDTA pH 8, 500mM NaCl 10mM β-mercaptoethanol) Thêm vào 100μl 20% SDS tr n đ u 65oC 10 phút Thêm vào 500μl 5M Potassium acetate, l c đ u 0oC nh t 20 phút Ly tâm v i t c đ 14.000 vòng/phút b ng máy Hermle Z 300 20 phút Chuy n ph n d ch sang m t eppendorf m i cho thêm 1ml isopropanol Tr n đ u -20oC 30 phút Ly tâm v i t c đ 13.000 vòng/phút 15 phút eppendorf xu ng gi y th m 166 b ph n d ch úp Lu n án ti n s : Sinh h c Hòa tan t a 0,2ml dung d ch ch a 50mM Tris, 10mM EDTA, pH Ly tâm 10 phút v i t c đ 13000 vòng/phút đ lo i b nh ng ph n không tan Cho vào 0,2ml Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 Tr n đ u, ly tâm 10 phút v i t c đ 13.000 vòng/phút 10 Nh nhàng hút l y ph n sang m t tube m i Thêm vào 1/10 th tích 3M sodium acetate 100µl isopropanol Tr n đ u, ly tâm thu nh n t a DNA 11 R a t a DNA b ng 0,2ml ethanol 80% l nh t a DNA khô hòa tan 100µl dung d ch 10mM Tris, 1mM EDTA, pH v i 2µl RNAase 13 o n ng đ DNA b ng máy quang ph t i b DNA Ph 37oC 30 phút 12 c sóng 260/ 280 B o qu n -20oC ng pháp dùng DNeasy plant mini Kit Cân 100mg cà chua ho c mô s o b vào ng Eppendorf 2.0ml Nghi n m u nitrogen l ng Thêm 400µl dung d ch buffer AP1 µl Rnase A Vortex, tr n đ u 10 phút 65oC Tr n đ u 2-3 l n th i gian Thêm 130µl buffer AP2 tr n đ u phút n c đá Ly tâm v i t c đ 14.000 vòng/phút b ng máy Hermle Z 300 phút Chuy n ph n d ch vào c t (QIAshredder spin column), đ t c t vào ng ly tâm 2ml Ly tâm v i t c đ 14.000 vòng/phút phút Chuy n dung d ch thu đ c vào ng m i thêm 1.5 th tích buffer AP3 có ethanol vào tr n đ u (Ví d : 450µl d ch chi t thêm 675µl AP3) 167 Lu n án ti n s : Sinh h c Chuy n 650µl dung d ch b c vào ng DNeasy mini spin column đ t tube ly tâm Ly tâm v i t c đ 5000 vòng/phút phút Lo i b dung d ch L p l i b c v i ph n d ch d b c t DNeasy mini spin column vào ng ly tâm m i Thêm 500µl buffer AW vào c t, ly tâm v i t c đ 5000 vòng/phút phút Lo i b d ch Thêm 500µl buffer AW vào c t, ly tâm 10 14.000 vòng/phút phút t c t l i vào ng ly tâm m i Cho 100µl buffer AE vào c t, phút nhi t đ phòng Ly tâm t c đ 5.000 vòng/phút phút đ thu nh n DNA 11 o n ng đ DNA b ng máy quang ph t i b qu n DNA - 20oC 168 c sóng 260/ 280 b o [...]... HIV- 1- p24 đ làm c s d ng phác đ đi u tr phù h p cho t ng giai đo n c a các b nh nhân nhi m HIV Hình 1. 2: S hi n di n c a protein HIV- 1- p24 trong huy t thanh theo th i gian Hi n nay, protein HIV- 1- p24 đ khu n E.coli [47,60, 61, 116 ,19 2] tr thành s n ph m th c s n xu t và tinh s ch t quá trình nuôi c y vi ho c n m men [19 ,70] Protein HIV- 1- p24 sau khi tinh s ch ng m i (ví d : Protein tái t h p HIV- 1- p24, ... Sinh h c CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 11 Lu n án ti n s : Sinh h c 1. 1 it ng nghiên c u: cây Cà Chua 1. 1 .1 Ngu n g c và phân lo i Cà chua thu c h cà (Solanaceae), chi Lycopersicon Chi này g m 12 loài, có 2 chi ph : chi ph Eriopericon (qu luôn có màu xanh, có s c tía, có lông, h t nh ) và chi ph Eulycopersicon (qu chín đ ho c vàng, hoa to) Chi ph th hai có 2 loài: Lycopersicon esculentum - cà chua thông... tái t h p vào l c l p cây cà chua đ mong mu n có đ c hàm l ng protein tái t h p cao h n trong cây cà chua chuy n vào gen nhân 13 Lu n án ti n s : Sinh h c 1. 2 Virus HIV type 1 Virus HIV (human immunodeficiency virus) có đ c đi m chung c a h Retroviridae Virus hoàn ch nh có c u trúc g m 3 l p: l p v ngoài, l p v trong và ph n lõi [49 ,17 6] (hình 1. 1) 1. 2 .1 L p v ngoài (v peplon) L p này là m t màng lipid... n gen v i m t enzyme Lúa g o Protein đ u tiên t o ra t nuôi t bào lúa g o B p Thu c lá Kháng th IgG đ u tiên bi u hi n th c v t Thu c lá Kháng th IgM đ u tiên bi u hi n th c v t chuy n gen l c l p 27 Tác gi Barta A (19 8 6) Staub, J M (200 0) Sijmons P.C (19 9 0) Millan F.S.A (200 3) Zhu Z (19 9 4) Matsumoto S (19 9 5) Borisjuk N.V (19 9 9) Komarnytsky S (200 0) Torres E (19 9 9) Ruggiero F (200 0) Terashima M (19 9 9). .. Sikdar (19 9 8) [15 4] Lúa aadA_gfp Streptomycin Khan and Maliga (19 9 9) [76] aadA_gfp Streptomycin Lee (200 6) [93] aadA-gfp Spectinomycin Streptomycin Sidorov (19 9 9) [15 2] aadA_gfp Spectinomycin Streptomycin Nguyen (200 5) [12 1] Euglena aadA Spectinomycin Streptomycin Doetsch (20 0 1) [43] Cà chua aadA Spectinomycin Streptomycin Ruf S (20 0 1) [14 2] aadA Spectinomycin Streptomycin Wurbs D (200 7) [17 8] aadA... (polymerase) mã hoá cho các Enzyme: reverve transcriptase (RT: Enzyme sao mã ng c), protease và endonuclease (còn g i kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein l p v peplon c a HIV 14 Lu n án ti n s : Sinh h c Hình 1. 1: C u trúc Virus HIV 1. 2.4 Protein HIV- 1- p24 Kháng nguyên HIV- 1- p24 xu t hi n s m, m t th i gian ng n sau khi nhi m HIV và duy trì trong su t th i gian c p (s m) c a... cho r ng cà chua là cây có ch t đ c b i vì nó cùng h v i cây cà đ c d có màu s c qu đ p nên nó đ đ c kia, ng c i c, nh ng do c tr ng nh cây c nh Mãi đ n n m 17 50, cà chua m i đ th XVIII, cà chua b t đ u đ cđ u c tr ng c dùng làm th c ph m các n Anh Cu i th k c thu c Liên Xô c c nh p vào t nh ng n m 18 60 và cùng th i gian này cà chua c ng đ Pháp M t s nhà nghiên c u cho r ng cà chua đ M , cà chua c phát... (200 4) [16 2] Sà lách aadA Spectinomycin Lelivelt (200 5) [94] aadA Spectinomycin Kanamoto (200 6) [72] aadA Spectinomycin Ruhlman (200 7) [14 3] aadA Spectinomycin Lim Soon (2 011 ) [98] aadA Spectinomycin Nugent (200 6) [12 3] aadA Spectinomycin Okumura (200 6) [12 7] aadA_uidA Spectinomycin Streptomycin Liu (200 7) [10 1] aadA Spectinomycin De Marchis (200 9) [40] aadA Spectinomycin Streptomycin Singh A.K (2 010 ). .. và bi n d ng đ nh nitrogen và t ng h p amino carbon [12 ,12 4 ,17 3], l c l p còn là n i c acid [12 ,25,95 ,17 3 ,18 0], c đ nh và bi n d ng c ng sulphur [17 ,18 ,12 8 ,15 0 ,15 1] 1. 3.3 S phiên mã và d ch mã trong l p th 1. 3.3 .1 Nucleoid l p th DNA trong l p th t n t i d ng ph c h p protein- DNA đ l p th hay nhân l p th (plastid nucleus) S l ph thu c t ng loài nh ng th mì tr c g i là nucleoid ng genome trong m i nucleoid... i cây ho c thay th b ng nh ng gen ch n l c thân thi n, không có h i cho con ng i và môi tr ng [37,50] 1. 5.3 Thi t k m t vector chuy n gen l c l p chuy n gen vào l c l p, c n ph i thi t k m t vector phù h p Bao g m nhi u thành ph n đ c thù riêng không th thi u cho m t vector chuy n gen vào b gen l c l p nh v trí b t c p t giúp bi u hi n gen [24, 91, 111 ,16 2 ,16 4 ,17 9] Vector chuy n gen ti p h p v i b gen ... K t qu phân tích PCR gen HIV- 1- p24 10 9 3.6 Xác đ nh gen HIV- 1- p24 vào b gen l p th cà chua 11 1 3.6 .1 K t qu phân tích PCR dòng cà chua chuy n n p gen 11 1 3.6.2 K t qu phân tích... 11 8 Hình 3.23: SDS-PAGE nh ng dòng cà chua chuy n gen HIV- 1- p24 vào l c l p 12 0 Hình 3.24: Western blot nh ng dòng cà chua chuy n gen HIV- 1- p24 vào l c l p 12 1 Hình 3.25: SDS-PAGE dòng cà chua. .. (200 7) [14 4] Webster (200 5) [18 1] Karasev (200 5) [76] Karasev (200 5) [76] Kim (2004b) [85] Matoba (200 9) [11 9] Matoba (200 4) [12 0] Marusic (20 0 1) [11 8] Kim (2004a) [84] Yusibov (19 9 7) [18 9] TMV-