Thiết kế vector đột biến gen DNRU trong chủng xạ khuẩn streptomyces peucetius

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “THIẾT KẾ VECTOR ĐỘT BIẾN GEN DNRU TRONG CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES PEUCETIUS ” Người hướng dẫn: TS.Tạ Thị Thu Thủy Th.S Nguyễn Thành Chung Sinh viên thực hiện: Nguyễn Nhân Hậu Lớp :KS CNSH- 1202 HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy, cô công tác khoa công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo điều kiện cho em học tập môi trường khoa học hoàn thiện Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy, cô giáo - ThS Nguyễn Thành Chung TS Tạ Thị Thu Thủy Người dành nhiều thời gian tâm huyết định hướng nghiên cứu giúp đỡ em suốt trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo- Kỹ sư khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình thực tập hoàn thành đề tài Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân toàn thể bạn phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập nghiên cứu Trong trình nghiên cứu đề tài, thân em có nhiều cố gắng nhiên tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên em mong nhận góp ý quý thầy – cô để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Nhân Hậu MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN .3 Tổng quan kháng sinh 1.1 Lịch sử hình thành chất kháng sinh .3 1.2 Định nghĩa chất kháng sinh .4 1.3 Phân loại kháng sinh 1.4 Cơ chế tác dụng chất kháng sinh 1.4.1 Ức chế chức màng tế bào 1.4.2 Ức chế trình sinh tổng hợp protein 1.4.3 Ức chế chế trình sinh tổng hợp nucleic acid .7 1.2 Tổng quan xạ khuẩn 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên 1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peuticeus ATCC27952 .10 1.3Kháng sinh Doxorubicin 11 1.3.1 Cấu trúc kháng sinh Doxorubicin .11 1.3.2 Cơ chế hoạt động hoạt tính sinh học Doxorubicin 12 1.3.2.1 Hoạt tính sinh học Doxorubicin 12 1.3.2.2 Cơ chế hoạt động kháng sinh Doxorubicin 13 1.3.3.2 Thành tựu nghiên cứu 14 1.4 Tổng quan gen dnrU .16 1.4.1 cấu trúc gen dnrU 16 1.4.2 Vai trò gen dnrU .17 1.5 Mục tiêu nội dung nghiên cứu .17 1.5.1 Mục tiêu đề tài 17 Phần II .18 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 18 2.1.1 Vật liệu .18 2.1.2 Môi trường .19 2.1.3 Hóa chất .20 2.1.4 Thiết bị 24 2.2 Các phương pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Thiết kế mồi .26 2.2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số xạ khuẩn 26 2.2.3 Phương pháp PCR 28 2.2.4 Phương pháp fusion PCR 30 2.2.5 Phương pháp điện di gel agarose 31 2.2.6 Phương pháp tinh ADN từ gel agarose 31 2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 32 2.2.8 Phương pháp chuyển gen phương pháp sốc nhiệt 33 2.2.9 Phương pháp cắt DNA enzyme giới hạn 34 2.2.10 Phương pháp nối DNA 35 2.2.11 Phương pháp giải trình tự gen 36 PHẦN III .38 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1Kết thiết kế mồi tạo vector đột biến gen dnrU .38 3.2 Tách dòng đoạn TU, SU Neor 39 3.2.1 Tách chiết DNA genome chủng xạ khuẩn S.peucetius 39 3.2.2 Tách đoạn Neor từ plasmid pFDNEO-S modified 39 3.2.3 Tách dòng đoạn gene TU 40 3.2.4 Tách dòng đoạn gen SU .41 3.3 Tạo đoạn fusion PCR nối đoạn gen TU-Neor –SU .42 3.4 Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gen TU, Neor, SU 43 3.5 Kết ghép nối đoạn gen TU-Neor-SU vào vector PKC1139, biến nạp vào tế bào E.coli JM109 44 3.5.1 Kết cắt TU-Neor –SU Vector pGEM T-TU-Neor-SU 44 3.5.2 Tạo vector pKC 1139 TU-Neor-SU .45 Phần IV 48 Kết luận đề xuất .48 4.1 kết luận 48 4.2 Đề xuất 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Tài liệu tiếng việt: 49 Tài liệu tiếng anh: 49 Trang web tham khảo: 50 Chữ viết tắt Amp Apr Bp C CKS Cm DMSO DNA dNTPs ORFs RNA Gr+ GrKb Neo Neor PCR DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chú thích Ampicillin Apramycin Base pair Carbon Chất kháng sinh Chloramphenicol Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotides Open reading frames Ribonucleic Acid Gram dương Gram âm Kilobase Neomycin Gen kháng neomycin Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate Ter Tetramycin DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2 cấu trúc kháng sinh doxorubicin 11 Hình 2.1: a) Cấu trúc pGEM – T vector; b) vector PKC1139 19 Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng Fusion PCR 30 Hình 2.3: Phản ứng cắt enzyme giới hạn 35 Hình 2.4 trình nối DNA 35 Hình 2.5 Giải trình tự đánh dấu huỳnh quang 37 Hình 3.1 Điện di AND genome 39 Hình 3.2 Kết tinh đoạn gen Neor 40 Hình 3.3.điện di PCR đoạn TU 41 Hình 3.4 điện di PCR đoạn gen SU 41 Hình 3.5 Nối đoạn gen TU-Neor-SU fusion PCR 42 Hình 3.6 Điện di đoạn gen TU-Neor-SU sau phản ứng fusion PCR 43 Hình 3.7.Quá trình tạo vector tái tổ hợp pGEM T-TU-Neor-SU 43 Hình 3.8 Điện di trình tạo vector pGEM T-TU-Neor-SU 44 Hình 3.9 Quá trình tạo vector đột biến gen dnrU 45 Hình 3.10 khuẩn lạc E.coli JM109 45 Hình 3.11 điện di plasmid PKC-TU-neor-SU 46 Hình 3.12 kết cắt kiểm tra PKC-TU-Neor-SU biến nạp E.coli JM109 BamHI 46 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 thiết bị dùng trình thực đề tài 24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Kháng sinh nhóm thuốc thiết yếu y học đại Nhờ thuốc kháng sinh mà y học loại bỏ dịch bệnh nguy hiểm dịch hạch, tả, thương hàn điều trị hiệu nhiều loại bệnh gây vi khuẩn Đặc biệt nước nghèo, thuốc kháng sinh lại giữ vị trí quan trọng nước điều kiện vệ sinh yếu mức sống thấp nên thường xảy vụ dịch ỉa chảy, kiết lỵ, nhiễm khuẩn hô hấp Theo số liệu thống kê nhất, kháng sinh chiếm khoảng 10% tổng số thuốc sử dụng toàn giới (tính sở giá trị tiền thuốc đôla Mỹ) Tuy nhiên báo hàng năm nguy toàn cầu diễn đàn kinh tế Thế giới (WEF) kết luận : nguy lớn sức khỏe người xảy dạng vi khuẩn đề kháng kháng sinh Đó việc sử dụng CKS không hợp lý làm cho tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển ngày lan rộng Việc sử dụng số chất đặc hiệu để chữa trị số loại bệnh không mang lại hiệu mong muốn Số lượng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh ngày gia tăng Doxorubicin kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin gây độc tế bào phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius var caecius Hiện tổng hợp từ Daunorubicin Doxorubicin kích ứng mạnh mô gây hoại tử mô, ví dụ trường hợp tiêm mạch máu Hoạt tính sinh học doxorubicin doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế enzym cần thiết để chép phiên mã DNA Doxorubicin gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào giai đoạn phân bào S giai đoạn gián phân, thuốc tác dụng giai đoạn khác chu kỳ phát triển tế bào Doxorubicin dùng đơn độc phối hợp với thuốc chống ung thư khác Sự kháng thuốc chéo xảy khối u kháng Doxorubicin NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Daunorubicin Doxorobicin kháng sinh có giá thành đắt Việt Nam chưa sản xuất Trong đường sinh tổng hợp kháng sinh doxorubicin gen dnrU mã hóa enzyme Daunorubicin -13 ketoredustase thực chuyển hóa DNR thành 13S-13-dihydrodaunorubicin khiến cho DNR không chuyển hóa thành DXR Vì em thực đề tài “ Thiết kế vector đột biến gen dnrU Streptomyces peucetius” nhằm đột biến gen dnrU để DNR không bị chuyển hóa thành (13s)-13 dihydrodaunnorubicin Từ DNR chuyển hóa thành DXR nhờ hoạt động enzyme Daunorubicin (-13) hydroxylase làm tăng sản lượng DXR NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP phosphodiester giữu đầu 5’ (PO4) đầu 3’ (OH) hai nucleotide đứng cạnh Thường dùng enzyme T4 DNA ligase Hình 2.6: Phản ứng nối enzyme ligase Thành phần phản ứng nối: Vector µl Insert DNA µl T4 DNA Ligase (Takara) µl 2X Rapid Ligation Buffer (Takara) µl Tổng phản ứng : 20 µl Thực phản ứng 16oC qua đêm, chạy điện di kiểm tra 2.2.11 Phương pháp giải trình tự gen Từ năm 1977 số phương pháp giải trình tự gen phát minh: Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học ( Alan Maxam Walter Gilbert) Phương pháp giải trình tự gen enzyme hay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger) Cả hai phương pháp đánh dấu bước ngoặt lớn lịch sử phát triển môn sinh học đại Ngày nay, nhiều máy giải trình tự gen tự động dựa nguyên tắc phương pháp giải trình tự gen Sanger Nguyên lý phương pháp Sanger: sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) nhóm 3’-OH phân tử đường làm cho dNTPs tự không gắn vào đầu C-3’ không hình thành liên kết phosphodieste Do DNA polymerase xúc tác cho việc kéo dài chuỗi polynucleotide gặp ngẫu nhiên ddNTP trình tổng hợp dừng lại, tạo nên đoạn polynucleotide có chiều dài khác Nếu chia làm phản ứng với việc bổ sung 1% loại ddNTP (riêng biệt) chạy điện di giếng điện NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 36 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP di khác Các băng DNA xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi vào dideoxy thực kỹ thuật xạ ký tự ghi Khi giải trình tự người ta thường dùng máy tự động với việc đánh dấu huỳnh quang loại dideoxynucleotide fluochrome (chất huỳnh quang) có màu khác Như mạch DNA đơn sinh ống phản ứng đánh dấu huỳnh quang Các vạch điện di mạch đơn qua chùm tia sáng laser phát sáng lên tạo tín hiệu truyền máy tính Phần mềm máy tính tự động giải trình tự giữ liệu từ gel điện di cho hình ảnh kết giải trình tự Do giải trình tự mẫu nghiên cứu phản ứng (1 giếng điện di) thay cho phản ứng riêng biệt phương pháp Sanger Hình 2.5 Giải trình tự đánh dấu huỳnh quang NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 37 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết thiết kế mồi tạo vector đột biến gen dnrU Đoạn TU đoạn gen nằm phía trước gen dnrU Đoạn SU đoạn gen nằm phía sau gen dnrU Trên sở trình tự đoạn gen TU, SU xác định DNA genome xạ khuẩn Streptomyces peucetius từ ngân hàng gen, thiết kế cặp mồi đặc hiệu U1-F/U2-R, U5-F/U6-R để khuếch đại đoạn TU SU, cặp mồi U3-F/U4-R để khuếch đại gen Neor từ pFDNEO-S modified, nhằm mục đích xóa bỏ gen dnrU tạo vector đột biến gen dnrU Mồi U1-F mang trình tự nhận biết enzyme EcoRI, mồi U6-R mang trình tự nhận biết BamHI, có trình tự sau: Primer U1-F: 5’-CGGAATTCTACGACTGGACGTGCGGAACC-3’ EcoRI Primer U2 -R: 5’- GTTGCCGATTCTGGTCTAGCTCGATCCGGCCCTGGGTGTAC-3’ PrimerU3 F 5’-GGCCGGATCGAGCTAGACCAGAATCGGCAAC-3’ Primer U4 -R: 5’-TCGCTGTAGTAGCCGCCCGTCCGAACCCCAGAGTCCGT-3’ Primer U5-F: 5’-ACGGACTCTGGGGTTCGGACGGGCGGCTACTACAGCGA-3’ Primer U6-R: 5’-CGGGATCCGGCGAACAGCACGGCCCAGT-3’ BamHI NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 38 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.2 Tách dòng đoạn TU, SU Neor 3.2.1 Tách chiết DNA genome chủng xạ khuẩn S.peucetius Chủng xạ khuẩn nuôi môi trường NDYE nhiệt độ 28-30oC 96-100h sử dụng phương pháp tách chiết phenol-choroform (1:1) mục 2.2.2 để tách DNA genome Sau đó, tiến hành chạy điện di kiểm tra Hình 3.1 Điện di AND genome M : thang vạch DNA marker 1kb, 1,2 mẫu DNA genome S.peucetius Kết điện di cho thấy vạch sáng nằm phía vạch 10000bp ADN marker 1kb ladder (Hình 3.1) Như tách chiết thành công ADN genome xạ khuẩn Streptomyces peucetius 3.2.2 Tách đoạn Neor từ plasmid pFDNEO-S modified Plasmid pFDNEO-S modified cắt enzyme KpnI pFDNEO-S modified sau cắt tạo đoạn gen Neor, dùng mồi xuôi U3 mồi ngược U4 để nhân đoạn gen Neor sau cho sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết nhận sản phẩm PCR có vạch sang tương ứng 1,0kb AND ladder, vị trí phù hợp với kích thước đoạn gen Neor 1,012kb Đồng thời, kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR đặc hiệu đủ điều kiện áp dụng cho trình chuyển gen vào vector tách dòng (hình 3.2) NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 39 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 3.2 Kết tinh đoạn gen Neor M: Thang DNA marker 1kb 1,2 :các mẫu tinh Neor sau cắt pFDNEO-S KpnI 3.2.3 Tách dòng đoạn gene TU AND tổng số xạ khuẩn sau tách chiết sử dụng làm khuôn phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen TU với cặp mồi đặc hiệu U1 U2 Sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% để phân tích kết Sản phẩm PCR có vạch sáng tương đương với vị trí vạch 750bp AND ladder, vị trí phù hợp với kích thước đoạn gen TU 0,7 kb Đồng thời kết điện di cho thấy, sản phẩm PCR đặc hiệu đủ hàm lượng cho mục đích tách dòng gen đủ điều kiện áp dụng cho trình chuyển gen vào vector tách dòng (hình 3.3) NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 40 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 3.3.điện di PCR đoạn TU 3.2.4 Tách dòng đoạn gen SU Để nhân đoạn SU với cặp mồi đặc hiệu U5,U6 cho đoạn gen SU, với gengen dnrU gen tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR từ chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952.kết sản phẩm phản ứng PCR chạy điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết nhận sản phẩm PCR có vạch sáng tương ứng với vị trí vạch 1kb AND ladder, vị trí phù hợp với kích thước đoạn gen SU 1,1 kb Đồng thới kết điện di cho thấy , sản phẩm PCR đặc hiệu đủ hàm lượng cho mục đích tách dòng gen đủ điểu kiện áp dụng cho trình chuyển gen vào vector tách dòng ( hình 3.4) Hình 3.4 điện di PCR đoạn gen SU NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 41 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.3 Tạo đoạn fusion PCR nối đoạn gen TU-Neor –SU đoạn đoạn giai đoạn Đoạn Giai đoạn Giai đoạn U1 TU Neor SU U6 Hình 3.5 Nối đoạn gen TU-Neor-SU fusion PCR Giai đoạn : sau tách đoạn gen TU,SU từ ADN genome chúng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ta tiến hành pha mồi đoạn gen nhận thấy với đoạn TU có đoạn gen có cặp mồi đầu U1 U2 đoạn mồi U2 xuất đoạn gen nhỏ có chứa trình tự nucleotit giống với Neor Tiếp tục đoạn có chứa đoạn gen SU thiết kế với cặp mồi U5,U6 nhận thấy mồi U5 có đoạn trình tự nucleotit giống với Neor Ngoài nhờ vào mồi U3,U4 khuếch đại Neor từ plasmid pFDNEO-S modified để loại bỏ gen dnrU Giai đoạn 2: Ta đem đoạn gen vừa tách nhân đoạn gen phản ứng PCR sau thực chu trình phản ứng Fusion PCR nối đoạn gen với nhiệt độ tương thích 65oC Giai đoạn 3: Quá trình thực Fusion PCR kết thúc ta đoạn gen hoàn chỉnh TU-Neor-SU NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 42 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Sau chạy Fusion PCR đoạn gen TU-Neor-SU ta đem chạy điện di gel agarose 1% thu băng vạch có kích thước khoảng 2800bp Kết nhận phù hợp với trình tách dòng đoạn gen Phù hợp đề chuyển gen vào PGEM-T Hình 3.6 Điện di đoạn gen TU-Neor-SU sau phản ứng fusion PCR 3.4 Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gen TU, Neor, SU Đoạn gen TU-Neor-SU sau chạy phản ứng fusion PCR ta đem đoạn gen chuyển vào vector PGEM-T ` Hình 3.7.Quá trình tạo vector tái tổ hợp pGEM T-TU-Neor-SU Sau Vector tái tổ hợp pGEM –T-TU-Neor-SU tạo biến nạp vào tế bào E.coli JM109, nuôi cấy môi trường LB chứa Apr 100 µg/ml 37oC Tiến hành lựa chọn khuẩn lạc mọc môi trường nuôi cấy NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 43 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP để tách plasmid, thực phản ứng cắt enzyme EcoRI để kiểm tra Kết thể hình Hình 3.8 Điện di trình tạo vector pGEM T-TU-Neor-SU 3.5 Kết ghép nối đoạn gen TU-Neor-SU vào vector PKC1139, biến nạp vào tế bào E.coli JM109 3.5.1 Kết cắt TU-Neor –SU Vector pGEM T-TU-Neor-SU vector pKC 1139 NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 3.9 Quá trình tạo vector đột biến gen dnrU 3.5.2 Tạo vector pKC 1139 TU-Neor-SU Vector pGEM T-TU-Neor-SU vector PKC1139 sau tách chiết cắt enzyme BamHI tạo đầu đính PGEM-T sau cắt tạo đoạn DNA PGEM-T đoạn TU-Neor-SU Sau sản phẩm tinh qua cột hút chân không thực phản ứng nối đoạn gen TU-NeorSU với Vector pKC1139 Vector đột biến pKC-TU-Neor-SU tạo biến nạp vào tế bào E.coli JM109, nuôi cấy môi trường chứa Apr 100µg/ml 37oC Hình 3.10 khuẩn lạc E.coli JM109 Tiến hành chọn lựa khuẩn lạc số khuẩn lạc mọc môi trường chọn lọc khuẩn lạc nuôi cấy tách plasmid, đánh số 1,2 chạy điện di kiểm tra với mẫu vector pKC 1139 đánh số Kết điện di sản phẩm gel agarose 1% cho thấy mẫu 1,2 có kích thước dài mẫu Đồng thời vector pKC 1139 có kích thước ban đầu 6,5 kb, sau chèn đoạn gen TU-Neor-SU với kích thước khoảng 2800bp có kích thước 9300bp nhìn vào hình kết luận tạm thời biến nạp thành công vector đột biến pKC-TU-Neor-SU vào tế bào E.coli JM109 NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hình 3.11 điện di plasmid PKC-TU-neor-SU M: marker 1kb DNA ladder ;3:mẫu vector PKC1139 1,2 mẫu vector PKC-TU-Neor-SU biến nạp vào E.coli JM109 Tuy nhiên, để khẳng định khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen mong muốn , tiến hành kiểm tra vector đột biến enzyme giới hạn tiếp tục sử dụng hai mẫu plasmid tiến hành phản ứng cắt enzyme BamHI Kết thu hình Hình 3.12 kết cắt kiểm tra PKC-TU-Neor-SU biến nạp E.coli JM109 BamHI ; M: thang DNA marker 1kb 1,2 mẫu PKC-TU-Neor-SU biến nạp vào E.coli JM109 Vector pKC-TU-Neor-SU có kích thước 9300 bp với điểm cắt nhân biết enzyme giới hạn BamHI Theo tính toán, cắt vector pKC-TUNeor-SU BamHI thu đoạn TU-Neor-SU có kích thước 2800bp NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP pKC có kích thước 6500bp Nhìn vào hình khẳng định biến nạp thành công vector đột biến pKC –TU-Neor-SU vào E.coli JM109 NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Phần IV Kết luận đề xuất 4.1 kết luận Từ kết thu trên, nghiên cứu rút kết luận sau: 1/Tách dòng thành công đoạn TU đoạn tương đồng với đoạn AND phía trước gene dnrU từ DNA genome xạ khuẩn Streptomyces peucetius 2/ Tách dòng thành công đoạn SU đoạn tương đồng với DNA phía sau gene dnrU từ DNA genome xạ khuẩn Streptomyces peucetius 3/ Tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gen TU-Neor-SU vào pGEMT biến nạp thành công vào tế bào khả biến E.coli JM109 4/ Tạo vector đột biến gen dnrU vector pKC 1139 biến nạp thành công vào tế bào E.coli JM109 4.2 Đề xuất Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu đây, em xin đề xuất số kiến nghị sau Chuyển vector tái tổ hợp vào chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius tự nhiên để tạo đột biến Tạo chủng đột biến để kiểm tra hiệu suất kháng sinh Tạo vector đột biến gen dnrU vector PKC 1139 biến nạp vào tế bào E.coli XL1 Blue NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Bùi Thị Thanh Tịnh (2006), Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α, luận văn kỹ sư sinh học, Đại học Nông Lâm TP HCM Cao Văn Thu (2000), Bài giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn công nghiệp dược, Đại học dược Hà Nội Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Kiều Hữu Ảnh (2007), Giáo trình vi sinh vật học (tập 2), Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật Lê Đỗ Huyền Trang (2012), Nghiên cứu biểu gen GerF nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường dTDP-6-deoxy-D-allose cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Công nghệ sinh học-Viện đại học Mở Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Vi Thị Đoan Chính, Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 – TN07 – 02 Nguyễn Thị Phương Thảo, Bùi Văn Trình (2013), Nghiên cứu gây đột biến gen MI mã hóa cho enzyme O-methyltransferase chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP phương pháp tiếp hợp,Báo cáo khoa học, Khoa Công nghệ sinh học-Viện đại học Mở Hà Nội Tài liệu tiếng anh: Bate N, Cundliffe E The mycinose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin, 1999, J Ind Microbiol Biotechnol 23, 118-122 10 Jaishy, Bharat Prasad, Si Kyu Lim, Ick Dong Yoo, Jin Cheol Yoo, Jae Kyung Sohng, and Doo Hyun Nam, Cloning and Characterization of a Gene Cluster for the Production of Polyketide Macrolide Dihydrochalcomycin in Streptomyces sp KCTC 0041BP, 2006, J Microbiol Biotechnol., 16, 764-770 11 Goo, Y M., Y Y Lee, and B T Kim, A new 16-membered chalcomycin type macrolide antibiotic, 1997, J Antibiot 50, 85-88 NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 12 Hansen, J L., Ippolito, J A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P B., Steitz, T A., The Structures of Four Macrolide Antibiotics Bound to the Large Ribosomal Subunit , 2002, Mol Cell., 10, 117-128 13.Kim, S.D., IJ Ryoo., CJ Kim., WG Kim., JP.Kim., JY Kong., H Koshino.,M Uramot o and ID Yoo, GERI‐155 a new macrolide antibiotic related to chalcomycin, 1996, J Antibiot 49, 955‐957 14 Kirst HA, Sides GD, New directions for macrolide antibiotics: structural modifications and in vitro activity Antimicrob Agents Chemother, 1989 Sep, 33(9), 1413–1418 15 Martin, J F, A.L Demain, Control of antibiotics synthesis, 1980, Microbiol Rev, 44 (2), 230 – 252 16 Poehlsgaard, J., Douthwait, S., The macrolide binding site on the bacterial ribosome Current drug targets Infectious disorders, 2002, 2(1), 67-78 17 Rohr, J Deoxysugar, polyketides and related class: Synthesis, biosynthesis, enzymes Bioorganic Chemistry, 1997, 47-50 18 Ta Thi Thu Thuy, Biosynthesis pathway of dihydrochalcomycin produced by Streptomyces sp KCTC 0041BP: deoxysugar and glycosyltransferase, 2006 19 Tresner H D, M C Davies, and E Jackus, Electron icroscopy of Streptomyces spore morphology and its role in species ifferentiation, 1961, J Bacteriol, 81, 70 – 80 20 Xuemei M., and Hung-wen Liu, Formation Of Unusual Sugars: Mechanistic Studies and Biosynthetic Applications, Annu Rev Biochem 71, 2002, 701-754 21 Yoo JC, Kim JH, Ha JW, Park NS, Sohng JK, Production and biological activity of laidlomycin, anti – MRSA/ VRE antibiotic from Streptomyces sp CS684, J Microbiol, 2007/ 2, 45 (1): – 16 Trang web tham khảo: 22 http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=584.html 23 http://luanvan.co/luan-van/vector-cac-dac-tinh-quan-trong-vector-can-co-cac-loai- vector-3117/ 24 http://www.zun.vn/tai-lieu/de-tai-phuong-phap-pcr-4854/ NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 50 [...]... cao khả năng sinh tổng hợp doxorubicin trong Streptomyces peucetius 1.5.2 Nội dung thực hiện 1/ Tách dòng đoạn TU là đoạn tương đồng với đoạn AND phía trước của gene dnrU từ DNA genome xạ khuẩn Streptomyces peucetius 2/ Tách dòng đoạn SU là đoạn tương đồng với DNA phía sau gene dnrU 3/ Nhân đoạn gen TU-Neor-SU và giải trình tự 4/ Thiết kế vector đột biến pKC .dnrU NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 17 KHÓA LUẬN... Tổng quan về xạ khuẩn 1.2.1 Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Theo Waksman thì trong một gam... VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 2.1.1 Vật liệu Chủng vi sinh vật Chủng E coli XL1 Blue và E.coli JM109 được sử dụng làm vật chủ trong tách dòng gen, sống trong môi trường LB Chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 được phân lập tại Hàn Quốc do khoa Hóa học trường Đại học Sun Moon – Hàn Quốc cung cấp Đây là chủng xạ khuẩn tự nhiên sản sinh ra kháng sinh DXR được dùng... Vai trò của gen dnrU dnrU trong Daunorubixin mã hóa enzyme Daunorubicin -13 ketoredustase thực hiện chuyển hóa DNR thành 13S-13-dihydrodaunorubicin khiến cho Daunorubicin không chuyển hóa thành Doxorubicin và làm giảm khả năng sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces peuticeus 1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.5.1 Mục tiêu của đề tài Mục tiêu: tạo vector đột biến để gây đột biến gene dnrU nhằm... sinh 1.2.3 Xạ khuẩn Streptomyces peuticeus ATCC27952 Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, với khoảng 500 loài, có tỷ lệ G, C cao (69 ÷ 73%) trong ADN Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong điều trị có nguồn gốc từ các loài thuộc chi Streptomyces trong đó được biết đến nhiều nhất là Streptomycin, erythromycin và tetracyclin Streptomyces là chi xạ khuẩn bậc... liên kết với nhau thành từng búi sợi Mỗi sợi khuẩn ty bao gồm nhiều đốt nhỏ và mỗi đốt nhỏ là một tế bào xạ khuẩn Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 có khả năng hấp thụ các nguồn cacbohydrat khác nhau Chúng có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có glucose, sacharose và maltose Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn này sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất là trong. .. 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 ÷ 45% tổng số vi sinh vật Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [1] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như: Miccromonospora... hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 thuộc chi Streptomyces, là chủng sản sinh ra kháng sinh doxorubicin Khi sinh trưởng trên môi trường NDYE ở nhiệt độ 280C sau 4-5 ngày thì bắt đầu xuất hiện khuẩn lạc NGUYỄN NHÂN HẬU-1202 Page 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Về hình thái xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 tồn tại ở dạng khuẩn ty Khi nuôi trên môi trường đĩa... nhóm anthracyline bằng phương pháp tạo chủng Streptomyces Violaceus tái tổ hợp Gene dnrK mã hóa cho carminomycin 4-Ometyltransferase Chủng thuộc nhóm gen sinh tổng hợp DXR được chuyển vào chủng xạ khuẩn Streptomyces Violaceus Chủng này đã tạo ra kháng sinh anthracyline mới là dẫn xuất của DNR và DXR (4-O-methylepelmycin D) Cho tới năm 1991 đã có tới 553 dẫn xuất đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng... bệnh bạch hầu 1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS Trên thế giới, trong số hơn 8000 CKS do vi sinh vật tổng hợp hiện nay thì trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi CKS chỉ có tác