Nghiên cứu tạo đột biến UV tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn streptomyces clavuligerus

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI:Nghiên cứu tạo đột biến tia UV tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit clavulanictừ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus.” Giáo viên hướng dẫn: TS.Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hồng Hoa Lớp: 13-02 Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắcem xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Tạ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chuyên môn vô quý báu lòng nhiệt tình suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ cho em kiến thức đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập mơi trường khoa học hồn thiện Đồng thời em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo – Kỹ sư công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình học tập hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người ln bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian khả thân hạn chế, khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo thầy đóng góp ý kiến bạn để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Hoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU Phần I : TỔNG QUAN 1.1.Đại cương kháng sinh 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2.Khái niệm kháng sinh 1.1.3.Phân loại kháng sinh 1.1.4.Các kháng sinh nhóm β – lactam 10 1.2 Đại cương xạ khuẩn 14 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn 14 1.2.2.Cấu tạo xạ khuẩn 14 1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 16 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh kháng sinh xạ khuẩn 17 1.2.5.Đặc điểm Streptomyces clavuligerus 18 1.2.6 Giới thiệu axit clavulanic 20 1.3 Đột biến tăng khả sinh kháng sinh vi sinh vật 22 1.3.1.Khái niệm đột biến 22 1.3.2 Mục đích 22 1.3.3 Đột biến nhân tạo tác nhân vật lý 23 1.3.4.Đột biến nhân tạo tác nhân hóa học 23 1.3.5.Đột biến nhân tạo phương pháp sốc nhiệt 24 1.3.6 Một số thành tựu ứng dụng đột biến gen tăng khả sinh kháng sinh vi sinh vật 24 1.4 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 24 1.4.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 1.4.2.Nội dung nghiên cứu 24 Phần - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.1 Các chủng vi sinh vật 25 2.1.2.Hóa chất, dụng cụ thiết bị 25 Bảng 2.3.Môi trường LB 28 2.2.Sơ đồ quy trình nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 29 2.3.2 Phương pháp bảo quản giống 31 2.3.3.Phương pháp xác định khối lượng tế bào 31 2.2.4.Phương pháp gây đột biến xạ khuẩn tia UV 31 2.4.Tách chiết thu kháng sinh 35 Phần - KẾT QUẢ 37 3.1 Xác định hoạt tính axit chủng S.clavuligerus 37 3.3.So sánh khả đột biến từ bào tử khuẩn ty 38 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian gây đột biến UV đến khả sinh trưởng sinh axit 39 3.5 Kết sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến 40 3.7 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng đột biến 41 3.7.1.Ảnh hưởng hàm lượng cacbonhydrat đến khả sinh trưởng sinh axit 41 3.7.2 Ảnh hưởng nguồn pepton tới khả sinh trưởng sinh kháng sinh 42 3.7.3 Ảnh hưởng hàm lượng đa lượng 44 3.8 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 45 3.8.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 45 3.8.2 Ảnh hưởng pH 45 3.8.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 46 3.9 Quy trình tách thu nhận axit quy mơ thí nghiệm 47 4.1 Kết luận 48 4.2.Đề xuất 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT D Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn tính theo milimet Gram (-) Gram dương Gram (+) Gram âm h Giờ HSCC Hệ sợi chất HSKS Hế sợi khí sinh LB Luria Bertani TLC Thin Layer Chromatography v/p Vòng/phút Amp Ampicillin Amo Amoxicillin DANH MỤC BẢNG STT Nội dung Bảng Cơ chế tác dụng kháng sinh Trang 10 Bảng 2.1 Mơi trường NDYE 26 Bảng 2.2 Mơi trường giàu khống 27 Bảng 2.3 Môi trường LB 27 Bảng 3.1 Kết khả ức chế vi sinh vật chủng xạ khuẩn 41 S.clavuligerus Bảng 3.2 Bảng thử nồng độ kháng sinh Amp Amox với B.cereus 37 Bảng 3.3 Bảng thử nồng độ kháng sinh Amp Amox với E.coli 37 Bảng 3.4 Bảng kết kết hợp axit clavulanic kháng sinh 38 Amox Bảng 3.5 Kết so sánh đột biến từ khuẩn ty bào tử 38 Bảng 3.6 Tỉ lệ sống sót chủng xạ khuẩn qua thời gian chiếu tia UV 39 Bảng 3.7 Kết sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến 40 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đến khả sinh trưởng 41 sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến Bảng 3.9 Ảnh hưởng nguồn pepton đến khả sinh trưởng 43 sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến Bảng Ảnh hưởng hàm lượng đa lượngđến khả sinh trưởng 3.10 sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến 44 DANH MỤC HÌNH STT Nội dung Trang Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum bào tử chúng Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin 11 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo kháng sinh Ampicillin 12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo kháng sinh Amoxicillin 12 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo kháng sinh cephalosporin 12 Hình 1.6 Khuẩn lạc,khuẩn ty bào tử xạ khuẩn 16 Hình 1.7 Hình ảnh chủng xạ khuẩn S.clavuligerus khuẩn ty 20 Hinh 1.8 Cấu tạo axit clavulanic 21 Hình 3.1 Hình thử hoạt tính khuẩn ty bào tử 39 Hình 3.2 Chủng S.clavuligerusđột biến UV bào tử 40 Hình 3.3 Kiểm tra tính kháng khuẩn chủng S.clavuligerusđột biến 41 tự nhiên Hình 3.4 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đến khả sinh tổng 42 hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến Hình 3.5 Ảnh hưởng nguồn pepton đến khả sinh tổng hợp axit 43 chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến Hình 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng đa lượng đến khả sinh tổng 44 hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh 45 tổng hợp axit chủng S.clavuligerus Hình 3.8 Biểu đồ ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả sinh tổng 46 hợp axit chủng S.clavuligerus Hình 3.9 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học môn tập hợp ngành khoa học công nghệ bao gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học, cơng nghệ học, nhằm tạo quy trình cơng nghệ khai thác quy mô công nghiệp hoạt động sống vi sinh vật, tế bào động, thực vật để sản xuất sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội bảo vệ môi trường Kháng sinh lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học.Kháng sinh chế phẩm sinh học sản xuất nhằm tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cải thiện tình trạng bệnh lý người, động vật, thực vật Tình trạng kháng kháng sinh lại mối lo ngại nay.Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) dự tính đến năm 2050 giây có người tử vong siêu vi khuẩn kháng thuốc, tương đương với khảng 10 triệu người năm Khi đó, bệnh thơng thường ho hay vết cắt gây tử vong Hiện để ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh người phải tìm chế phẩm để phối hợp với kháng sinh làm giảm nồng độ kháng sinh tăng hoạt lực kháng sinh giúp ngăn chặn nguy kháng kháng sinh ngày trở thành hiểm họa lồi người Trong chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligenus có khả sinh axit clavulanic giúp ta ngăn chặn phần khả kháng thuốc số chủng vi sinh vật có khả sinh enzym β − lactamase Clavulanic acid chất bán tổng hợp có khả ức chế hoạt động nhóm β − lactamase enzym vi sinh vật tiết để làm giảm hoạt lực kháng sinh nhóm β − lactam.Nó sản phẩm chuyển hóa thứ cấp chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus Tuy nhiên, khả sinh axit chủng xạ khuẩn tự nhiên chưa cao, cần có biện pháp cải thiện suất nhằm thu hàm lượng sinh axit cao Vì nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Nghiên cứu tạo đột biến UV tăng suất sinh tổng hợp clavulanic acid từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus” SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Phần I : TỔNG QUAN 1.1.Đại cương kháng sinh 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh - Trên Thế giới Sự phát triển vi sinh vật học nói chung vi sinh vật cơng nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming vào năm 1928, nhà khoa học người Anh tình cờ phát chủng nấm Penicillium notatum nhiễm sinh vào môi trường nuôi cấy Straphylococus aureus ức chế phát triển vi khuẩn Ông chứng minh loại nấm tiết chất có khả ức chế phát triển Starphylococus aureus, chất sau gọi Penicillin [22] [26] Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum bào tử chúng Vìbộ phận sinh sản lồi nấm mốc có hình dạng giống bút lông nên đặt tên Penicillium(tiếng la tinh Penicillium nghĩa bút lông) Năm 1938, Fleming nhận thư hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford Ernst Boris Chain Howard Walter Florey, với lời đề nghị hợp tác với ông để tiếp tục thực cơng trình nghiên cứu Penicillin họ thử nghiệm thành công Penicillin chuột vào năm 1940 Năm 1944,nhóm chọn loại nấm sinhPenicillin ưu việt chủng Penicillium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao triệu lần Penicillin Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928 SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Năm 1945,Fleming giải thưởng Nobel y học Ernst Boris Chain Howard Walter Florey Cùng với việc phát Penicilin,thập kỉ 40,50 kỉ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc việc khám phá hàng loạt chất kháng sinh có giá trị y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard, 1932), Streptomycin (Selman Waksman Albert Schat,1944), Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),… Tốc độ tìm kiếm chất kháng sinh ngày đẩy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học y học, dược phẩm nông nghiệp nhiều nước giới liên tục phát hàng loạt chất kháng sinh có giá trị ứng dụng thực tiễn.Năm 1945 phát 30 chất kháng sinh, năm 1949 số 150 chất kháng sinh, năm 1953 xấp xỉ 450 chất kháng sinh, năm 1980 có 5.500 chất đến số lượng chất kháng sinh phát lên tới 17.000 chất khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp.Tuy nhiên, số chi có 1÷2% chất kháng sinh có đủ tiêu chuẩn để sử dụng y học Năm 1999, kháng sinh Lospomal HA – 92 tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312, cótác dụng ngăn chặncholesterol, tăng sức đề kháng chất độc chuột, ngồi kháng sinh có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Tại Nhật Bản, năm 2003, Yatakemycin tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 phương pháp sắc ký cột Chất kháng sinh có khả kìm hãm phát triển nấm Aspergillus Candida albicans Chất có khả chống lại tế bào ung thư, có giá trị MIC 0,01÷ 0,3 mg/ml Tại Hàn Quốc, năm 2007, phân lập loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh chất kháng sinh Laidlomycin, chất tiêu diệt tụ cầu kháng Methicillin cầu khuẩn kháng Vancomycin Năm 2002, Ấn Độ phân lập chủng Streptomyces sp 201 có khả sinh chất kháng sinh - methylheptyl isonicotinate, chất kháng sinh có khả kháng nhiều loại nấm gây bệnh Furasium oxysporum, F Solina, SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP STT VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Thể tich axit clavulanic bổ Đường kính vòng vô khuẩn với sung vào môi trường B.cereus ( D )(mm) kháng sinh Amox 0,01 mg/ml ml 19 ml 19 ml 18 ml 17,5 0,5 ml 17 Quan sát bảng nhận thấy nồng độ kháng sinh Amox0,01 mg/ml bổ sung thêm 3ml 4ml axit clavulanic vòng kháng khuẩn lớn không thay đổi nên chọn thể tích 3ml để làm thí nghiệm 3.3.So sánh khả đột biến từ bào tử khuẩn ty Sau thực đột biến từ hai dạng bào tử khuẩn ty chủng xạ khuẩn S.clavuligerus sau tiến hành lấy khuẩn lạc từ hai dạng đột biến khoảng thời gian đột biến thu kết sau thơng qua thử hoạt tính axit clavulanic với kháng sinh thuộc nhóm β-lactamvà vi sinh vật kiểm định S.cereus Bảng 3.4.Kết so sánh đột biến từ khuẩn ty bào tử S.clavuligerusđột biến từ S.clavuligerusđột biến từ khuẩn ty bào tử 18 19 Amox 0,01mg/ml SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 38 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Hình 3.1.Hình thử hoạt tính khuẩn ty bào tử (từ trái sang phải) Từ bảng ta thấy đột biến từ bào tử hay khuẩn ty khả sinh axit chủng xạ khuẩn cao so với chủng tự nhiên dạng bào tử khả sinh axit chủng cao nên lựa chọn dạng bào tử 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian gây đột biến UV đến khả sinh trưởng sinh axit Thời gian gây đột biến UV cao chứng tỏ ảnh hưởng đến hệ gen xạ khuẩn lớn chủng sống sót chủng biến đổi DNA Bảng 3.5: Tỉ lệ sống sót chủng xạ khuẩn theo thời gian chiếu tia UV thể bảng sau: Thời gian Tỷ lệ sống sót (%) (giây) Đường kính vòng vơ khuẩn D (mm) Amox ( 0,01 mg/ml) + 3ml axit clavulanic 50 90 14,5 65 80,3 15 80 65,1 16,7 95 40 18 120 20 19 135 17 Quan sát bảng kết cho thấy: thời gian chiếu tia UV tăng tỉ lệ sống sót tế bào giảm dần từ 90% đến 5%, đường kính vòng vơ khuẩn trung bình biến thiên khoảng giá trịtừ 14,5mm ÷ 19,5mm đạt giá trị lớn SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 39 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 19,5mmkhi thời gian chiếu tia UV 120 giây Thời gian cao tỷ lệ sống sót giảm khả sinh axit tăng đến thời điểm định khả sinh axit giảm Như với thời gian chiếu tia UV 120 giây khả đột biến tạo axit lớn Hình 3.2: Chủng S clavuligerus đột biến UV từ bào tử 3.5 Kết quảsàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến Sau lựa chọn khoảng thời gian đột biến chủng có khả sinh axit cao tiếp tục tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên chủng có khả sinh axit cao.Kết thể bảng sau Bảng 3.6.Kết sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến Ký hiệu chủng đột Hoạt tính axit Ký hiệu chủng đột Hoạt tính axit biến S.clavuligerus chủng với B.cereus biến S.clavuligerus chủng với B.cereus D (mm) D (mm) UV5-1 18 UV5-6 19 UV5-2 18 UV5-7 19,5 UV5-3 19 UV5-8 18,7 UV5-4 17,7 UV5-9 18,5 UV5-5 18,3 UV5-10 17,5 SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 40 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Hình 3.3: Hình thử hoạt tính chủng S clavuligerustự nhiên đột biến UV 3.7 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng đột biến 3.7.1.Ảnh hưởng hàm lượng cacbonhydrat đến khả sinh trưởng sinh axit Sau ni cấy chủng xạ khuẩntrên mơi trường giàu khống có nguồn cacbonhydrat khác là: tinh bột tan, saccarozơ, glucozơ maltozơ,glyxerol với khối lượng, theo dõi sau ngày nuôi lắc 28 oC ta thu kết bảng Bảng 3.8 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đếnkhả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerusđột biến Nguồn cacbon Khả phát Trọng lượng ướt Đường kính vòng vơ (cùng khối lượng triển (g/l) khuẩn 10g/l) D (mm) Maltozơ + 16,3 18 Glucozơ + 15,28 16 Tinh bột tan + 17,2 17,5 Saccarozơ ++ 25,36 18 Glyxerol ++ 25,5 19 Fructose + 20,1 17 Ghi chú: + phát triển bình thường, ++ phát triển tốt Kết nghiên cứu cho thấy S.clavuligerusđột biến có khả đồng hóa nguồn cacbonhydrat có khả đồng hóa cao với glyxerol khả sinh trưởng tốt hoạt lực axitmạnh Chủng có khả SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 41 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI đồng hóa số nguồn cacbonhydrat khác với tỷ lệ thấp khả sinh acid thấp Như vậy, nhóm nghiên cứu chọn glyxerol nguồn cacbonhydrat để pha chế mơi trường ni cấy cho chủng • Ảnh hưởng hàm lượng Glyxerol Sau lựa chọn hàm lượng glyxerol khác để khảo sát ảnh hưởng hàm lượng glyxerol môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợpaxit , cụ thể là: 0,1%; 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0% Kết xác định phương pháp đo đường kính vòng vơ khuẩn sau ngày ni cấy với vi sinh vật kiểm địnhlà Khả ức chế β-lactamase Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) B cereusnhư trình bày ởhình 3.4 20 15 10 0.00% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% Hàm lượng glyxerol Hình 3.4 :Ảnh hưởng hàm lượng glycerol đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên ni mơi trường giàu khống có hàm lượng glycerol 1.5% tạo hàm lượng axit nhiều mơi trường giàu khống có hàm lượng glycerol khác hàm lượng axit tạo Như vậy, hàm lượng cacbonhydrat cao hay thấp ảnh hưởng lớn đến khả sinh axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerusđột biến: hàm lượng cacbonhydrat q thấp khơng đủ dinh dưỡng cho phát triển hàm lượng cacbonhydrat q cao lại ức chế tổng hợp axit chủng 3.7.2 Ảnh hưởng nguồn peptontới khả sinh trưởng sinh kháng sinh SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 42 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Tại hàm lượng glyxerol 1,5%tối ưu, chủng xạ khuẩntiếp tục nuôi cấy mơi trường giàu khống nguồn pepton với hàm lượng 0,5%;1,0%; 1,5%; 2,0%;2,5% Khả sinh kháng sinh xác định sau ngày nuôi lắc 28oC phương pháp đo đường kính vòng vơ khuẩn với vi sinh vật kiểm định B.cereusvà kháng sinh Amox Bảng 3.9.Ảnh hưởng nguồn pepton đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerusđột biến Hàm lượng nitơ tổng Trọng lượng ướt Đường kính vòng vơ (g/l) khuẩn D (mm) 23,5 17 1,0% 25,96 19,3 1,5% 24,5 18,7 2,0% 23,84 17,5 2,5% 23,23 17,3 Khả ức chế β-lactamase đường kính vòng vơ khuẩn(mm) 0,5% 20 15 10 0.50% 1% 1.50% 2% 2.50% Hàm lượng pepton Hình 3.5:Ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến Theo kết bảng ta thấy: hàm lượng peptonthích hợp cho khả sinh axit chủng 1,0% đường kính vòng vơ khuẩn trung bình đạt SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 43 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI lớn nhất, hàm lượng khác kính vòng vô khuẩn thu nhỏ Như vậy, nồng độ nitơcao hay thấp ảnh hưởng tới khả sinh axitcủa chủng 3.7.3 Ảnh hưởng hàm lượng đa lượng Với hàm lượng glyxerol 1,5% nitơ 1%, chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường giàu khống có hàm lượng đa lượng khác nhau0,2%,0,25%; 0,3%; 0,35%; 0,4% Sau ngày nuôi cấy chủng, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính axit với vi sinh vật kiểm định B Cereusvà kháng sinh Amox, thu kết bảng 3.3 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng đa lượngđến khả sinh trưởng sinh axit chủng S.clavuligerusđột biến Trọng lượng ướt Đường kính vòng vơ khuẩn (g/l) D (mm) 0,2.% 25,64 18 0,25% 26,1 19,5 0,3% 25,74 18,5 0,35% 25,38 17.7 0,4% 24,67 17 Khả ức chế βlactamase Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) Hàm lượng khống 25 20 15 10 0.00% 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% Hàm lượng đa lượng Hình 3.6:Ảnh hưởng hàm lượng đa lượngđến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến Theo kết bảng ta thấy: hàm lượng đa lượng thích hợp cho khả sinh kháng sinh chủng 0,25% đường kính vòng vơ khuẩn trung bình đạt SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 44 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI lớn nhất, hàm lượng khác kính vòng vơ khuẩn thu nhỏ Như vậy, nồng độ đa lượng cao hay thấp ảnh hưởng tới khả sinh kháng sinh chủng 3.8 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 3.8.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Với hàm lượng glycerol 1,5% pepton 1%,ngng đa lượng 0,25%, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn thời gian để khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit là48h, 72h, 96h, 120h,142h Đối với mốc thời gian nghiên cứu, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm Khả ức chế β-lactamase Đường kính vòng vơ khuẩn(mm) định làS.cereus kháng sinh Amox, thu kết sau 20 15 10 0 50 100 150 Thời gian ni cấy(giờ) Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerusđột biến Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên phát triển tốt khoảng thời gian 72h – 96h, khoảng thời gian lượng sản phẩm tạo nhiều xạ khuẩn tăng trưởng với số lượng lớn lượng sản phẩm trao đổi chất tạo nhiều Trước khoảng thời gian lượng axit tạo chưa nhiều xạ khuẩn thích ứng chậm với môi trường nuôi cấy Sau khoảng thời gian 96h nuôi cấy xạ khuẩn phát triển chậm lại môi trường dinh dưỡng cạn kiệt lượng axit tạo giảm dần 3.8.2 Ảnh hưởng pH Với hàm lượng glyxerol 1,5% pepton1%, nguồn đa lượng 0,25% ni cấy khoảng thời gian 72÷96 Nhóm nghiên cứu lựa chọn pH để khảo sát SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp kháng sinh 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5.Sau đó, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm định B.cereus, thu kết nhưhình 3.7 Khă ức chế β-lactamase Đường kính vòng vơ khuẩn(mm) 20 15 10 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 pH Hình 3.8.Biểu đồ ảnh hưởng pH ni cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 3.8.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Với hàm lượng glycerol 1,0% nitơ 0,25%, yếu tố đa lượng ni cấy khoảng thời gian 72÷96 giờ, pH 7, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn mốc nhiệt độ khác để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên 24oC; 26 oC; 28 oC; 30 oC; 32 oC.Sau tiến hành kiểm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm định làB.cereus kháng sinh Amox, thu kết hình Khả ức chế βlactamase Đường kính vòng vơ khuẩn(mm) 25 20 15 10 20 22 24 26 28 30 32 34 Nhiệt độ (ᵒC) Hình 3.9.Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên ni mơi trường giàu khống tạo nhiều sản phẩm nhiệt 28oC, lượng acid tạo nuôi chủng môi trường giàu khống nhiệt độ khác hơn, đặc biệt nhiệt độ 24oC lượng axit tạo Điều cho thấy nhiệt độ ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả sinh axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus 3.9 Quy trình tách thu nhận axit quy mơ thí nghiệm Quy trình tách chiết axitquy mơ phòng thí nghiệm: Bước 1: Thu dịch ni mơi trường giàu khống Bước 2: Ly tâm nhiệt độ phòng 10 phút với tốc độ 6000 v/p, 4oC để loại bỏ sinh khối tế bào Bước 3: Thu dịch nuôi bổ sung dung môi n-butanol tỷ lệ 2:3 chuẩn pH=2 Bước 4: Lắc hỗn hợp 28oC Bước 5: Ly tâm hỗn hợp nhiệt độ 4oC,10 phút với tốc độ 6000 v/p để tạo phân lớp phần dịch có chứa axit dung mơi Bước 6: Loại lớp dịch đục bên dưới, thu lớp dịch phía bao gồm dung mơi CLA hòa tan Bước 7: Quay khô chân không để thu CLA SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI PHẦN VI:KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu đề thu kết sau: 1.Tối ưu thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp để chủng S.clavuligerusđột biến sinh trưởng sinh tổng hợp axit cao nhất: nguồn cacbonhydrat glycerol với hàm lượng 1,5% , nguồn pepton với hàm lượng 1%, yếu tó đa lượng 0,25g/l Chúng phát triển mạnh khoảng thời gian 72-96 ni cấy mơi trường có pH=7, nhiệt độ 28oC 2.Chọn chủng S.clavuligerus đột biến chiếu tia UV với thời gian 120s cho khả ức chế β − lactamaselớn thu 19mm với vi sinh vật kiểm định làB.cerus 3.Nghiên cứu đưa quy trình tách axit từ xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến quy mơ phòng thí nghiệm 4.2.Đề xuất - Tiếp tục tiến hành đột biến tiếp để tăng suất sinh tổng hợp axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn S.clavuligerus - Thu nhận axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn S.clavuligerus với quy mô lớn để áp dụng vào ngành y –dược SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 48 KHÓA LUẬN TỐT T NGHI NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC CM MỞ HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO A: TÀI LIỆU TIẾNG NG ANH 1.Townsend, Townsend, CA (Oct 2002) "New reactions in clavulanic acid biosynthesis." Current Opinion in Chemical Biology (5): 583–– doi:10.1016/S1367 10.1016/S1367-5931(02)00392-7 PMID 12413541 2.Jump up^ Reading, C.; Cole, M (1 May 1977) "Clavulanic Acid: a BetaBeta Lactamase-Inhibiting Inhibiting Beta-Lactam Beta from Streptomyces clavuligerus" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11 (5): 852 852– 857 doi:10.1128/AAC.11.5.852 10.1128/AAC.11.5.852 3.Arulanantham Arulanantham H, Kershaw NJ, Hewitson KS, Hughes CE, Thirkettle JE, Schofield CJ (January 2006) "ORF17 from the clavulanic acid biosynthesis gene cluster catalyzes the ATP-dependent ATP formation of N-glycyl clavaminic acid" J Biol Chem 281 (1): 279– 87.doi:10.1074/jbc.M507711200 10.1074/jbc.M507711200 PMID 16251194 4.Tahlan Tahlan K, Park HU, Wong A, Beatty PH, Jensen SE (March 2004) "Two sets of paralogous genes encode the enzymes involved in the early stages of clavulanic acid and clavam metabolite biosynthesis in Streptomyces clavuligerus" Antimicrob Agents Chemother Chemother 48 (3): 930– doi:10.1128/AAC.48.3.930 10.1128/AAC.48.3.930-939.2004 PMC 353097  PMID 14982786 5.Reading, C.; Cole, M (1 May 1977) "Clavulanic Acid: a Beta-Lactamase LactamaseInhibiting Beta-Lactam Lactam from Streptomyces clavuligerus" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11(5): 11 852–857 doi:10.1128/AAC.11.5.852 PMC 352086  PMID 879738 6.Jump up^ Busby, RW; Townsend, CA (Jul 1996) "A single monomeric iron center in clavaminate synthase catalyzes three nonsuccessive oxidative transformations." Bioorganic & Medicinal Chemistry (7): 1059 1059– 64 doi:10.1016/0968 10.1016/0968-0896(96)00088-0 PMID 8831977 SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG H HOA Page 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 7.Jump up^ Bachmann, BO; Townsend, CA (Sep 19, 2000) "Kinetic mechanism of the beta-lactam synthetase of Streptomyces clavuligerus." Biochemistry 39 (37): 11187– 93.doi:10.1021/bi000709i PMID 10985764 8.Jump up^ Khaleeli, Nusrat; Li, Rongfeng; Townsend, Craig A "Origin of the β-Lactam Carbons in Clavulanic Acid from an Unusual Thiamine Pyrophosphate-Mediated Reaction" Journal of the American Chemical Society 121 (39): 9223–9224 doi:10.1021/ja9923134 9.Jump up^ Joint Formulary Committee British National Formulary, 47th edition London: British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain; 2004 10.Jump up^ "Drug Record - Amoxicillin-Clavulanate" LiverTox - Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury Retrieved April 24, 2013 11.Jump up^ Tortajada Girbés M, Ferrer Franco A, Gracia Antequera M, Clement Paredes A, García Moz E, Tallón Guerola M (2008) "Hypersensitivity to clavulanic acid in children".Allergol Immunopathol (Madr) 36 (5): 308–10 doi:10.1016/S0301-0546(08)75228-5.PMID 19080805 12.Baggaley K, Brown A, Schofield C (1997) "Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams" Nat Prod Rep 14 (4): 309– 33 doi:10.1039/np9971400309 PMID 9281835 13.Jump up^ Doran J, Leskiw B, Aippersbach S, Jensen S (1990) "Isolation and characterization of a beta-lactamase-inhibitory protein from Streptomyces clavuligerus and cloning and analysis of the corresponding gene" J Bacteriol 172 (9): 4909–18 PMC 213145  PMID 2203736 14.Jump up^ Aharonowitz Y, Demain A (1 August 1978) "Carbon Catabolite Regulation of Cephalosporin Production in SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 50 KHÓA LUẬN TỐT T NGHI NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC CM MỞ HÀ NỘI Streptomycesclavuligerus" Streptomycesclavuligerus Antimicrob Agents Chemother 14 (2): 159 159– 64.doi:10.1128/aac.14.2.159 10.1128/aac.14.2.159 PMC 352426  PMID 697343 15.Jump up^ Garcia-Dominguez Dominguez M, Martin J, Liras P (1989) "Characterization of sugar uptake in wild-type wild Streptomyces clavuligerus,, which is impaired in glucose uptake, and in a glucose-utilizing glucose mutant" J Bacteriol 171 (12): 6808– 14 PMC 210580  PMID 2687256 16.Jump up^ Kirk S (2000) "The physiology of clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus (PhD thesis)" University of Surrey,, UK 17 Reading C, Cole M (1977) "Clavulanic Acid: a Beta-Lactamase Lactamase-Inhibiting Beta-Lactam Lactam from Streptomyces clavuligerus" clavuligerus" Antimicrob Agents Chemother 11 (5): 852–7.doi:10.1128/aac.11.5.852 852 PMC 352086  PMID 879738 18.^ Jump up to:a b Higgens CE, Kastner RE (1971) "Streptomyces clavuligerus sp nov., a beta-lactam lactam antibiotic producer" International Journal of Systematic Bacteriology 21 (4): 326–31.doi:10.1099/00207713-21-4-326 326 19.Jump up^ Nabais AMA, Dafonseca MMR (1995) "The Effect of Solid Medium Composition on Growth and Sporulation of Streptomyces Streptomyces-Clavuligerus - Spore Viability During ring Storage at +4-Degrees-C".Biotechnology +4 C".Biotechnology Techniques (5): 361–4 361 doi:10.1007/BF00638871 20.Jump up^ Tahlan K, Anders C, Jensen S (2004) "The Paralogous Pairs of Genes Involved in Clavulan Clavulanic ic Acid and Clavam Metabolite Biosynthesis Are Differently Regulated in Streptomyces clavuligerus" clavuligerus" J Bacteriol 186 (18): 6286–97 doi:10.1128/JB.186.18.6286 10.1128/JB.186.18.6286-6297.2004 PMC 515150  PMID 15342599 21.Waksman, Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification DNA descriptions of genra ADN species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG H HOA Page 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI B: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 22.Cao Văn Thu, Bài giảng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 23.Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 24.Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 25.Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất y học Hà Nội,Trang 720, 2005 26.Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 – 345 27.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 – 41 28.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 29.PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học (tập 2) – (tr 12 – 19) 30.Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 SVTH:NGUYỄN THỊ HỒNG HOA Page 52 ... pháp cải thiện suất nhằm thu hàm lượng sinh axit cao Vì nhóm nghiên cứu thực đề tài: Nghiên cứu tạo đột biến UV tăng suất sinh tổng hợp clavulanic acid từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus ... sinh trưởng 43 sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S .clavuligerus đột biến Bảng Ảnh hưởng hàm lượng đa lượngđến khả sinh trưởng 3.10 sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S .clavuligerus đột biến 44 DANH... dung nghiên cứu đề tài 1.4.1 Mục tiêu nghiên cứu Đột biến S .clavuligerus phương pháp vật lý để tăng hiệu suất tổng hợp axit clavulanic 1.4.2.Nội dung nghiên cứu - Đột biến S .clavuligerus tia UV