Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh trưởng sinh tổng hợp acid clavulanic sinh ra từ chủng xạ khuẩn streptomyces clavuligerus

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI : “ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNGSINH TRƯỞNG–SINH TỔNG HỢPACID CLAVULANIC TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS” Giáo viên hướng dẫn : TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên thực : Trình Thị Thanh Hương Lớp : KSCNSH -1302 Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Tạ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chun mơn vơ q báu lòng nhiệt tình suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ cho em kiến thức đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Đồng thời em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo – Kỹ sư cơng nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình học tập hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, người ln bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian khả thân hạn chế, khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo thầy đóng góp ý kiến bạn để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày15 tháng năm 2017 Sinh viên Trình Thị Thanh Hương ` MỤCLỤC MỞ ĐẦU Phần 1:TỔNG QUAN 1.1.Đại cương kháng sinh 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2 Khái niệm kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5.Các kháng sinh nhóm β-lactam 11 1.2.Đại cương xạ khuẩn 13 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn 13 1.2.2.Cấu tạo xạ khuẩn 13 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh axit xạ khuẩn 17 1.3.Tổng quan xạ khuẩn Streptomyces clavunigerus 18 1.3.1.Giới thiệu Streptomyces clavuligerus 18 1.3.2 Lịch sử nghiên cứu 21 1.3.4.Cơ chế hoạt động axit clavulanic 22 1.3.5 Ứng dụng 22 1.4.Mục tiêu nội dung đề tài 23 1.4.1 Mục tiêu đề tài 23 1.4.2 Nội dung đề tài 23 1.4.3 Sơ đồ quy trình nghiên cứu: 23 PHẦN 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu, hóa chất, mơi trường nuôi cấy chủng VSVvà thiết bị 25 2.1.1.Vật liệu môi trường nuôi cấy chủng VSV 25 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiếtbị 25 2.2.Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 28 ` 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 30 2.2.3.Phương pháp xác định khối lượng tế bào 30 2.2.4 Phương pháp thí nghiệm xác định khả sinh trưởng sinh axit 31 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính axit 33 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1.Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 35 3.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 35 3.1.2 Đặc điểm sinh hóa 37 3.1.3 Khả sinh axit clavulanic ức chế β-lactam chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên 40 3.1.4 Khả hỗ trợ tăng hoạt tính axit chủngS.clavuligerus 41 3.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp 42 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng glycerol 42 3.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng pepton 44 3.2.3 Ảnh hưởng chất khoáng 46 3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 50 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 50 3.3.2.Ảnh hưởng nhiệt độ 51 3.3.3.Ảnh hưởng pH 53 3.3.4.Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm từ chủng S.clavuligerus54 Phần : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55 4.1 Kết luận 55 4.2 Đề xuất 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ` DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CKS D Chất kháng sinh Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn tính theo milimet Gram (-) Gram dương Gram (+) Gram âm h Giờ HSCC Hệ sợi chất HSKS Hế sợi khí sinh ISP2 The International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) LB Luria Bertani s Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh (độ lệch chuẩn) v/p Vòng/phút VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn ` DANH MỤC BẢNG Bảng Cơ chế tác dụng kháng sinh 10 Bảng 2.1 Dụng cụ thiết bị dùng đề tài 25 Bảng 2.2 Thành phần 1000ml môi trường giàu khoáng 27 Bảng 2.3 Thành phần 1000ml môi trường ISP2 27 Bảng 2.4 Môi trường LB 28 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 37 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất khoáng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 39 Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 40 Bảng 3.5 Kết khả ức chế vi sinh vật chủng xạ khuẩn 41 Bảng 3.6 Thử nồng độ kháng sinh 41 Bảng 3.7 Kết hợp axit clavulanic với kháng sinh amoxicilin 42 Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng glycerol đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 43 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 45 Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 46 Bảng 3.11 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 48 ` DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum bào tử chúng Hình 1.2 Cơ chế tác dụng kháng sinh 10 Hình 1.3 Khuẩn ty xạ khuẩn 16 Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn 17 Hình 1.5 Cơng thức phân tử axit clavulanic 20 Hình 1.6 Quá trình tổng hợp axit clavulanic 21 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng S.clavuligerus tự nhiên đĩa thạch 35 Hình 3.2 Hình thái khuẩn ty chủng xạ khuẩn S.clavuligerus 36 Hình 3.3 Bào tử xạ khuẩn 37 Hình 3.4 Màu sắc dịch nuôi sau 24h 72h chủng S.clavuligerus 37 Hình 3.5 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat khác đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 38 Hình 3.6 Ảnh hưởng nguồn nito khác đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 39 Hình 3.7 Ảnh hưởng chất khống đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 40 Hình 3.8 Vòng kháng khuẩn vi sinh vật kiểm định 41 Hình 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng glycerol đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên 43 Hình 3.10 Vòng kháng khuẩn chủng 44 Hình 3.11 Ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên 45 Hình 3.12 Vòng kháng khuẩn B.cereus hàm lượng pepton khác nhau46 Hình 3.13 Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên 47 Hình 3.14 Vòng kháng khuẩn B.cereus hàm lượng K2HPO4 khác 47 ` Hình 3.16 Vòng kháng khuẩn B.cereus hàm lượng MgSO4.7H2O khác 49 Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên 50 Hình 3.18 Vòng kháng khuẩn B.cereus thời gian ni cấy khác 51 Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên 52 Hình 3.20 Vòng kháng khuẩn B.cereus ni cấy nhiệt độ khác 52 Hình 3.21 Biểu đồ ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên 53 Hình 3.22 Vòng kháng khuẩn B.cereus nuôi cấy pH khác 54 Hình 3.23 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn chủng S.clavuligerus 54 ` Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Trung bình năm có 200.000 người chết/năm kháng kháng sinh ước tính tới năm 2020 số lên tới khoảng 10.000.000 người/ năm.Cơn ác mộng mang tên kháng kháng sinh đến gần.Đó tượng vi khuẩn khơng bị tiêu diệt thuốc kháng sinh Đáng buồn điều xảy lồi người sử dụng kháng sinh bừa bãi không liều lượng tạo điều kiện cho vi khuẩn sống sót, thích nghi tự tiến hóa gen kháng thuốc.Chúng sinh sôi nảy nở nhanh phát triển thành loại Hàng năm có tới 50.000 người Mỹ chết nhiễm trùng mà khơng có thuốc chữa Chúng ta q chậm chạy đua với chúng đến ngày người chết vết thương nhỏ kháng sinh ngăn chặn vi khuẩn tiêu diệt người Việc kiểm soát loại bệnh chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn.Kết phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin Việt Nam cao (71,4%) Hàn Quốc (54,8%), Hồng Kông (43,2%) Đài Loan (38,6%) Tỷ lệ kháng erythromycin cao, Việt Nam 92,1%, Đài Loan 86%, Hàn Quốc 80,6%, Hồng Kông 76,8% Trung Quốc 73,9% Hiện sử dụng chất ức chế β- lactamase kết hợp với kháng sinh βlactam coi biện pháp hiệu chống lại chế kháng thuốc đặc hiệu vi khuẩn Phổ kháng khuẩn axit mở rộng chủng vi khuẩn đề kháng khả ức chế dẫn đến bất hoạt đa số β-lactamase tiết vi khuẩn gram âm, gram dương vi khuẩn kỵ khí Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy chế phẩm phối hợp có hiệu điều trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng ổ bụng, nhiễm trùng da mơ mềm Cũng có chứng ghi nhận hiệu điều trị kháng sinh Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội điều trị sốt giảm bạch cầu trung tính nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt kết hợp với axit khác Một nguyên nhân vi khuẩn kháng kháng sinh vi khuẩn tiết enzyme β-lactamase khác số vi khuẩn gây bệnh Các βlactamase phổ rộng enzyme tạo vi khuẩn gram âm, có khả thủy phân kháng sinh β-lactam có chứa nhóm oxyimino (các cephalosporins hệ 3) chúng lại bị ức chế axit clavulanic Hiện nay, chế phẩm phối hợp axit β-lactam chất ức chế βlactamase sử dụng rộng rãi bao gồm amoxicilin/axit clavulanic,ampicilin/axit clavulanic Axit clavulanic sinh tổng hợp từ chủng Streptomyces clavuligerus quan tâm nghiên cứu nhiều nước giới có Việt Nam,chủng xạ khuẩn có triển vọng ứng dụng thực tiễn Chính vậy,song song với việc tìm loại thuốc kháng sinh việc nâng cao hiệu suất trình tổng hợp axit clavulanic – chế phẩm phối hợp giúp tăng hoạt tính kháng sinh nhóm nghiên cứu thực đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh trưởng-sinh tổng hợp acid clavulanic sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus ” Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus Hàm lượng Pepton Trọng lượng ướt Khả tăng hoạt tính (%) (g/l) axit D (mm) 0,2% 24,89 9,3 0,3% 25,78 9,5 0,4% 26,61 10,1 0,5% 27,92 10,8 0,6% 27,24 10 11 Vòng kháng khuẩn (mm) 10.8 10.5 10.1 10 9.5 10 9.5 9.3 8.5 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% 0.60% Hàm lượng pepton Hình 3.11Ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên Kết biểu đồ cho thấy hàm lượng pepton thích hợp cho khả năngsinh axit chủng 0,5% nồng độ thu đường kính vòng vơ khuẩn trung bình lớn 10,8 mm, với hàm lượng pepton khác đường kính vòng vơ khuẩn trung bình thu nhỏ hơn.Do đó, lựa chọn nồng độpepton 0,5% lànồng độ thích hợp cho mơi trường ni cấy Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 45 Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.12Vòng kháng khuẩn B.cereus hàm lượng pepton khác Ghi chú:1- Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng pepton 0,4% 2- Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng pepton 0,3 % 3- Chủng S.clavuligerus môi trườngcó hàm lượng pepton 0,2 % 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng pepton 0,5 % 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng pepton 0,6 % 3.2.3 Ảnh hưởng chất khoáng Ảnh hưởng nồng độ K2HPO4 Với điều kiện tối ưu khảo sát trên, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn hàm lượng K2HPO4môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit cụ thể 1g/l ; 3g/l; 5g/l ;7 g/l; 9g/l Kết xác định phương pháp đo vòng kháng khuẩn sau ngày ni cấy với VSV kiểm định B.cereus trình bày bảng sau: Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus Khối lượng (g) Trọng lượng ướt (g/l) g/l 26,06 9,4 g/l 27,95 10,5 g/l 27,55 11 g/l 27,35 10 g/l 26,75 Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 Khả tăng hoạt tính axit D (mm) 46 Khoa Cơng nghệ Sinh họọc Viện Đạii h học Mở Hà Nội Vòng kháng khuẩn (mm) 12 11 10.5 10 10 9.4 9 Hàm lượng K2HPO4 (g/l) Hình 3.13 Ảnh hưởng ng c hàm lượng K2HPO4 đến khả ng sinh ttổng hợp axit c chủng S.clavuligerus tự nhiên Qua biểu đồ ta thấy: th Hàm lượng muối thích hợpp cho kh khả sinh trưởng g/l trọng ng lượng lư ướt trung bình đạt lớn nhấất Hàm lượng muối thích hợp cho khảả sinh axit chủng 5g/l đườ ờng kính vòng kháng khuẩn tạii hàm lư lượng khác đường ng kính vòng kháng khu khuẩn thu nhỏ Như vậy,, nồng n độ khoáng cao hay thấp ảnh nh hư hưởng đên khả sinh axit chủng ng Hình 3.14Vòng Vòng kháng khu khuẩn củaởhàm lượng K2HPO4 khác Ghi chú: Trình Thị Thanh Hương ương - Lớp 1302 47 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 1- Chủng S.clavuligerus môi trường có hàm lượng K2HPO4 7g/l 2- Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng K2HPO4 1g/l 3- Chủng S.clavuligerus mơi trườngcó hàm lượngK2HPO4 5g/l 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng K2HPO4 9g/l 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng K2HPO4 3g/l Ảnh hưởng nồng độ MgSO4.7H2O Với điều kiện tối ưu khảo sát trên, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn hàm lượng MgSO4.7H2Okhác để khảo sát ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2Otrong môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit cụ thể 2g/l ; 4g/l; 6g/l ; 8g/l; 10g/l Kết xác định phương pháp đo vòng kháng khuẩn sau ngày nuôi cấy với VSV kiểm định B.cereus amoxicillin trình bày bảng sau: Bảng 3.11Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus Khối lượng Trọng lượng ướt Khả tăng hoạt MgSO4.7H2O (g) (g/l) tính axit D (mm) g/l 25,58 9,3 g/l 26,45 10 g/l 27,68 11,2 g/l 27,61 10,5 10 g/l 26,88 9,4 Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 48 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Vòng kháng khuẩn (mm) 12 11.2 10 10.5 10 9.3 9.4 2 10 Hàm lượng MgSO4 (g/l) Hình 3.15 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus Qua biểu đồ ta thấy: Hàm lượng muối thích hợp cho khả sinh trưởng g/l trọng lượng ướt trung bình đạt lớn nhất, đường kính vòng kháng khuẩn hàm lượng khác đường kính vòng kháng khuẩn thu lớn Như vậy, nồng độ khoáng cao hay thấp ảnh hưởng đên khả sinh axit chủng Hình 3.16Vòng kháng khuẩn củaB.cereus cáchàm lượng MgSO4.7H2O khác Ghi chú: Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 49 Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 1- Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O2g/l 2- Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O4g/l 3- Chủng S.clavuligerus mơi trườngcó hàm lượngMgSO4.7H2O8g/l 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượngMgSO4.7H2O 6g/l 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O10g/l 3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Với hàm lượng glycerol 2,2% pepton 0,5%, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn thời gian để khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit 24h, 48h, 72h, 96h, 120h Đối với mốc thời gian nghiên cứu, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính axit với VSV kiểm định làB.cereus amoxicillin, thu kết hình sau: 11 Vòng kháng khuẩn (mm) 10.8 10.5 10.2 10 9.6 9.5 9.4 9.2 8.5 24h 48h 72h 96h 120h Thời gian ni cấy (h) Hình 3.17Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên phát triển tốt khoảng thời gian 72h, khoảng thời gian lượng sản phẩm tạo nhiều xạ khuẩn tăng trưởng với số lượng lớn lượng sản phẩm trao đổi chất tạo nhiều Trước khoảng thời gian lượng axit tạo chưa nhiều xạ khuẩn thích ứng chậm với mơi trường ni cấy Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 50 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Sau khoảng thời gian 96h nuôi cấy xạ khuẩn phát triển chậm lại mơi trường dinh dưỡng cạn kiệt lượng axit tạo giảm dần Hình 3.18Vòng kháng khuẩn củaB.cereus thời gian ni cấy khác Ghi chú:1- Chủng S.clavuligerus trongmơi trường cóthời gian 24h 2- Chủng S.clavuligerus mơi trường có thời gian 48h 3- Chủng S.clavuligerus trongmơi trường cóthời gian 72h 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có thời gian 96h 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có thời gian 120h 3.3.2Ảnh hưởng nhiệt độ Với hàm lượng glycerol 2,2% pepton 0,5%, nuôi cấy khoảng thời gian 72 giờ, pH 7, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn mốc nhiệt độ khác để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên 24oC; 26 oC; 28 oC; 30 oC; 32 oC.Sau tiến hành kiểm tra hoạt tính axit với VSV kiểm định làB.cereusvà amoxicillin, thu kết hình Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 51 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 14 12 11.5 10.8 10.2 10 9.4 9.1 24 26 28 30 32 Nhiệt độ Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên ni mơi trường giàu khống tạo nhiều sản phẩm nhiệt 28oC, lượng axit tạo nuôi chủng môi trường giàu khống nhiệt độ khác hơn, đặc biệt nhiệt độ 24oC lượng axit tạo Điều cho thấy nhiệt độ ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả sinh axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus Hình 3.20Vòng kháng khuẩn củaB.cereus nuôi cấy nhiệt độ khác Ghi chú: 1- Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 32oC Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 52 Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 2- Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 24oC 3- Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 28oC 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 26oC 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ30oC 3.3.3Ảnh hưởng pH Với hàm lượng glycerol 2,2% pepton 0,5%, ni cấy khoảng thời gian 72giờ Nhóm nghiên cứu lựa chọn pH để khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0.Sau đó, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính axit với VSV kiểm định làB.cereus amoxicillin thu kết nhưhình sau: Vòng kháng khuẩn (mm) 12 11.2 10.6 10.4 10 9.2 6 6.5 7.5 pH Hình 3.21 Biểu đồ ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên phát triển tốt mơi trường giàu khống có pH 7,0 mơi trường có pH khác lượng kháng sinh tạo hơn, đặc biệt mơi trường có pH = 6,0 lượng axit tạo Như pH mơi trường ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả sinh axit chủng khuẩn S.clavuligerus tự nhiên, pH cao thấp làm ảnh hưởng đến số khống chất Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 53 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội cần thiết cho sinh tổng hợp kháng sinh, làm cho khả sinh axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên bị giảm Hình 3.22 Vòng kháng khuẩn củaB.cereus nuôi cấy pH khác Ghi chú: 1- Chủng S.clavuligerus mơi trường có pH = 2- Chủng S.clavuligerus mơi trường có pH = 6,5 3- Chủng S.clavuligerus mơi trường có pH = 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có pH = 7,5 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có pH = 3.3.6 Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm từ chủngS.clavuligerus Chủng S.clavuligerus tự nhiên nuôi cấy môi trường giàu khống lỏng Sau đó, dịch ni chủng xạ khuẩn thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc,với vi sinh vật kiểm định B.cereus Hình 3.23 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn chủngS.clavuligerus Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 54 Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu đề thu kết sau: 1)Khảo sát sơ đặc điểm hình thái chủngS.clavuligerustự nhiênbao gồm:hình dạng khuẩn lạc, dạng khuẩn ty, màu sắc môi trường nuôi cấy khác 2)Nghiên cứu khả sinh trưởng sinh kháng sinh chủng S.clavuligerus tự nhiên cho thấy: nguồn cacbonhydratthích hợp để tạo mơi trường ni cấy cho chủng sinh trưởng phát triểnlà glycerol với hàm lượng 2,2%; nguồn nitơ thích hợp pepton với hàm lượng 0,5%; hàm lượng vi lượng tổng thích hợp 0,2% Chủng phát triển mạnh khoảng thời gian 72 ni cấy mơi trường có pH 7, nhiệt độ 280C 4.2 Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu đề tài để cải tạo, nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp axit clavulanic chủngS.clavuligerus phương pháp vật lý phương pháp hóa học - Thực lên men sản xuất axit clavulanic chủng S.clavuligerus quy mô lớn - Nghiên cứu đưa quy trình lên men thu nhận tách axit clavulanic thô từ xạ khuẩn S.clavuligerus - Nghiên cứu phương pháp tách chiết tinh axit clavulanic chủng S.clavuligerus để phục vụ cho y học nghiên cứu Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cao Văn Thu, Bài giảng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Hưng, TV, Malla, S., Park, BC, Liou, K., Lee, HC, Sohng, JK (2007) J Microbiol Công nghệ sinh., 17, 1538-1545 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh CKS chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 Nguyễn Hoàng Chiến , Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh CKS chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội, 2000 Nguyễn Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất y học Hà Nội,Trang 7-20, 2005 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứuvi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 – 345 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 – 41 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 11 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 12 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin, Act.A buraviensis,microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp 13 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 14 Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TSsinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội B TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 A study on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus in batch, FED-batch and continuous processes Article (PDF Available)inBrazilian Journal of Chemical Engineering 22(4) · October 2005 16 Daniela A Viana Marques , Márcia N Carneiro Cunha , Janete M Araújo , José L Lima-Filho , Attilio Converti , 4Adalberto PessoaJr , 1, * Ana L Figueiredo Porto Optimization of clavulanic acid production by Streptomyces daufpe 3060 by response surface methodology.Fermentation Conditions that Affect Clavulanic Acid Production in Streptomyces clavuligerus: A Systematic Review Published online 2016 Apr 22 doi: 10.3389/fmicb.2016.00522 17 Production of Clavulanic Acid by Streptomyces Clavuligerus Bacteria using Rapeseed Meal as The Source of Nitrogen.1Herbal Medicines Research Center, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran (HMRC) 18 Studies on the Biosynthetic Pathways of Clavulanic Acid and Cephamycin C in Streptomyces clavuligerus A.K Mackenzie Faculty of Natural Resources and Agricultural Sciences Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 19 Manipulation of the physiology of clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus Paul R lvest and Michael E Bushell Author for correspondence: Michael E Bushell Tel: +44 1483 259277 Fax: +44 1483 300374 e-mail : m.bushell@surrey.ac.uk Microbial Physiology and Ecology Group, University of Surrey, Guildford, Surrey GU2 5XH, UK ~ 20 Improvement for the production of clavulanic acid by mutant Streptomyces clavuligerus S.D Lee, S.W Park, K.K Oh1 , S.I Hong and S.W Kim Department of Chemical Engineering, Korea University, Seoul, and Department of Industrial Chemistry, Dankook University, Cheonan, Korea 2001/253: received 30 August 2001 and accepted 21 January 2002 21 Parente, E., Ricciardi, A and Addavio, G (1994) Influence of pH on growth and bactriocin production by Lactococcus lactis subsp lactis 140NWC during batch fermentation Applied Microbial Biotechnology 41, 388–394 22 Pitlik, J (1997) The fate of [2,3,3–2H3–1,2–13C2]-D,C,-glycerate in clavulanic acid biosynthesis Chemical Communications 1997, 225–226 Rolinson, G.N (1991) Evolution of b-lactamase inhibitors Reviews of Infectious Diseases 13, 5727–5732 University of Chicago 23 Baggaley, K.H., Brown, A.G and Schofield, C.J (1997) Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams Natural Product Reports 14, 309–333 24 Cole, M (1981) United States patent No 4,525,352 Foulstone, M and Readings, C (1982) Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the components of augmentin, in biological fluids with high performance liquid chromatography Antimicrobial Agents and Chemotherapy 22, 753–762 25 Lee, D.C and Ho, C.C (1996) Production of clavulanic acid and cephamycin C by Streptomyces clavuligerus in palm-oil medium World Journal of Microbiological Biotechnology 12, 73–75 Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 26 Lee, J.H., Lee, I.Y and Park, Y.H (1997) Optimal pH control of batch processes for the production of culdlan by Agrobacterium species Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 23, 143–148 27 Mayer, A.F and Decker, W.D (1996) Simultaneous production and decomposition of clavulanic acid during Streptomyces clavuligerus cultivations Applied Microbiological Biotechnology 45, 41–46 28 SE Jensen, KJ Elder, KA Aidoo, AS ParadkarEnzymes catalyzing the early steps of clavulanic acid biosynthesis are encoded by two sets of paralogous genes in Streptomyces clavuligerus Antimicrob Agents Chemother, 44 (2000), pp 720-726 29 M Cole Clavulanic acid: a beta-lactamase-inhibiting beta-lactam from Streptomyces clavuligerus Antimicrob Agents Chemother, 11 (1977), pp 852–857 C TÀI LIỆU WEBSITE 31.http://vi.wikipedia.org/wiki/Sắc_kí_lớp_mỏng 32.http://www.case.vn/vi-VN/87/88/117/details.case 33.http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung/5463_Nam-kho-bao-vebong-khoi-nam-gay-benh.aspx 34.http://www.sciencefoto.de/detail.php?id=214660&rubrik=Bio&lang=en& q=&qrubrik= http://www.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-va-cong-nghe/xac-dinh-su-sinhtruong-cua-vi-sinh-vat.html http://science.howstuffworks.com/question479.htm Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 ... tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học Streptomyces clavuligerus Nghiên cứu khả sinh tổng hợp- sinh trưởng chủng xạ khuẩn để tạo axit clavulanic 1.4.2 Nội dung đề tài Nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn. .. trình tổng hợp axit clavulanic – chế phẩm phối hợp giúp tăng hoạt tính kháng sinh nhóm nghiên cứu thực đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh trưởng -sinh tổng hợp acid clavulanic sinh từ chủng. .. lượng vào môi trường làm thay đổi đáng kể khả tổng hợp axit nhiều chủng xạ khuẩn 1.3 Tổng quan xạ khuẩn Streptomyces clavunigerus Chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus chủng xạ khuẩn cung cấp từ