Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng gây hại trên kính của một số chủng nấm sợi trên kính quang học ở việt nam

DANH MỤC CÁC BẢNG 2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại đoạn ITS rDNA 20 3.1 Số lượng chủng nấm phân lập từ kính quang học nhiễm nấm 23 3.2 Đặc điểm hình thá

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -





       -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG GÂY HẠI TRÊN KÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI

TRÊN KÍNH QUANG HỌC Ở VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn 1 : Th.S Ngô Cao Cường Giáo viên hướng dẫn 2 : TS Phí Quyết Tiến Sinh viên thực hiện : Tô Lan Phương Lớp : 13-02

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã dạy dỗ em trong suốt 4 năm học tại trường, trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm bài báo cáo tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến, TS Phí Quyết Tiến – Viện phó Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ; Th.S Ngô Cao Cường – NCV Phân viện Công Nghệ Sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga, người đã truyền cho em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú, các anh chị, trong Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực tập

Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cảm ơn sâu sắc vì đã luôn giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian học tập

Sinh viên

Tô Lan Phương

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1 Bio-A Chế phẩm chống nấm mốc trên khí tài quang học

2 GOST Tiêu chuẩn thử nghiệm gia tốc Cộng hòa Liên bang Nga

(TOCT)

3 PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

4 PDA Môi trường nuôi cấy nấm sợi (Potato Dextrose Agar)

5 DNA Deoxyribonucleic acid

6 rDNA DNA ribosom

7 ITS Vùng đệm trong được sao mã ( Internal Transcribed Spacer

8 Bp Cặp bazơ (base pair)

9 Atm Đơn vị đo áp suất (atmosphere)

10 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

11 Kb Kilo bazơ

12 SSC Sodium clorua sodium citrate

13 EtBr Ethidium bromide

14 Dntp Deoxynucleotide

15 cs Cộng sự

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR

khuếch đại đoạn ITS rDNA

20

3.1 Số lượng chủng nấm phân lập từ kính quang học nhiễm nấm 23

3.2 Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập từ thiết bị

quan sát tại Xuân Mai

24

3.3 Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập từ thiết bị

quan sát tại Nghệ An

28

3.4 Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập từ thiết bị

quan sát tại Đồng Nai

31

3.5 So sánh trình tự đoạn ITS của một số chủng nấm đại diện

với trình tự tương ứng trên GenBank

34

3.6 Kết quả phân tích trình tự đoạn ITS rDNA của các chủng

nấm sợi kho miền Trung

34

3.7 Kết quả phân tích trình tự đoạn ITS rDNA của các chủng

nấm sợi kho miền Nam

35

3.8 Phân bố chi nấm phân lập trên mẫu kính nhiễm kho lưu

trữ Xuân Mai – Hà Nội

36

3.9 Phân bố chi nấm phân lập trên mẫu kính nhiễm kho lưu

trữ Thái Hòa – Nghệ An

37

3.10 Phân bố chi nấm phân lập trên mẫu kính nhiễm kho lưu

trữ Đồng Nai – Biên Hòa

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Một số thiết bị quang học lấy mẫu điển hình 22

3.2 Lăng kính của thiết bị quan sát quân sự bị nhiễm nấm 22

3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn ITS rDNA

trên gel agarose 1,0%

33

3.4 Tỷ lệ phân bố của các chủng nấm đại diện phân lập từ

thiết bị quan sát quân sự tại ba kho Xuân Mai, Nghệ An,

Đồng Nai

39

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bảo quản thiết bị quan sát quân sự trong điều kiện nhiệt đới Việt Nam 3

1.1.1 Kho lưu trữ Xuân Mai – Hà Nội 3

1.1.2 Kho lưu trữ Thái Hòa - Nghệ An 4

1.1.3 Kho lưu trữ Đồng Nai – Biên Hòa 4

1.2 Nấm sợi gây phá hủy thiết bị quang học 4

1.2.1 Tác động của nấm sợi lên vật liệu kính 4

1.2.2 Phân lập và phân loại nấm sợi 8

1.2.3 Đa dạng nấm sợi trên thiết bị quang học 10

1.2.4 Ảnh hưởng đến tính năng thiết bị 11

1.2.5 Khả năng sinh axit của nấm sợi 12

1.3 Các biện pháp bảo vệ chi tiết kính và thiết bị quang học 13

1.3.1 Phương pháp cách ly 14

1.3.2 Phương pháp điều khiển thông số nhiệt ẩm 14

1.3.3 Phương pháp bảo quản bằng khí khô và chân không 15

1.3.4 Phương pháp sử dụng bioaxit 15

1.3.5 Chế phẩm Bioxit-A 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Thu thập mẫu kính quang học nhiễm nấm mốc, chế phẩm Bio-A 18

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 18

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Chọn mẫu 18

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu, phân lập 19

2.2.3 Phương pháp thuần khiết chủng 19

2.2.4 Phương pháp giữ giống 19

2.2.5 Phương pháp quan sát hình thái và cấu trúc sinh bào tử nấm 19

2.2.6 Tách ADN tổng số và PCR 20

2.2.7 Phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự đoạn ITS rDNA 20

2.2.8 Xác định khả năng sinh axit 21

2.2.9 Thử nghiệm gia tốc khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm sợi của Bio-A theo TCVN 7699-2-10-2007 21

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Phân lập nấm sợi trên thiết bị quang học ở ba miền khí hậu của Việt Nam 22

3.2 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy thiết bị quang học ở các miền khí hậu 24

3.2.1 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy quang học Xuân Mai – Hà Nội 24

3.2.2 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy quang học Thái Hòa – Nghệ An 27

3.2.3 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy quang học Biên Hòa – Đồng Nai 31

3.3 Phân loại dựa trên xác định trình tự đoạn ITS rDNA của các chủng nấm sợi 32

3.3.1 Tách AND tổng số và khuếch đại đoạn ITS rDNA 33

3.3.2 Giải trình tự đoạn ITS rDNA và phân loại 33

3.3.3 Phân loại các chủng nấm sợi miền Trung 34

3.3.4 Phân loại các chủng nấm sợi kho Đồng Nai – Biên Hòa 35

3.4 Phân bố nấm sợi trên thiết bị quang học 36

3.4.1 Phân bố nấm sợi kho lưu trữ Xuân Mai – Hà Nội 36

3.4.2 Phân bố nấm sợi kho lưu trữ Thái Hòa – Nghệ An 37

3.4.3 Phân bố nấm sợi kho lưu trữ Đồng Nai – Biên Hòa 37

3.4.4 Phân bố nấm sợi theo ba kho Xuân Mai, Nghệ An, Đồng Nai 39

3.5 Khả năng sinh axit của một số chủng nấm sợi đại diện ba miền 40

3.6 Khả năng ức chế của Bio-A đối với một số chủng đơn nấm sợi 42

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

KẾT LUẬN 44

KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 51

MỞ ĐẦU

Vi sinh vật đóng vai trò trong hệ thống sinh thái học và mang lại nhiều lợi ích cho con người, chúng được ứng dụng rộng trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, y – dược, nhưng đồng thời một số vi sinh vật đã gây tổn thất không nhỏ bởi quá trình phá hủy sinh học do vi sinh vật gây nên [5]

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm mưa nhiều Điều kiện này rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật nói chung trong đó có nấm sợi Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên bề mặt vật liệu đã làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu kỹ thuật và chất lượng sản phẩm

Đa số các thiết bị sử dụng trong nước đều nhập khẩu từ các nước Đông

Âu cần phải được nhiệt đới hóa Thiết bị quang học là một bộ phân cấu thành của nhiều thiết bị phục vụ quan sát mục tiêu, sử dụng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm thường có bị nấm mốc sinh trưởng Theo Tổ chức Quốc tế

về tiêu chuẩn hóa, nấm không thể mọc trên bề mặt kính trơn bóng sạch nếu không tiếp cận nguồn dinh dưỡng như: sợi vải, bụi, dầu mỡ, dấu vân tay hoặc sơn Nấm mốc sinh trưởng bắt đầu từ dạng sợi và lan tỏa trên bề mặt kính nhờ nguồn chất hữu cơ từ mép kính ở điều kiện nhiệt độ 28 – 30oC, độ ẩm từ 75% trở lên Nhiều khu vực ở Châu Phi, Đông Nam Á, Mỹ La Tinh là điều kiện lý tưởng cho sự phát triển của nấm Sự tán xạ hay hấp thụ ánh sáng của những sợi nấm mọc lan trên bề mặt kính là nguyên nhân làm giảm độ truyền dẫn ánh sáng và chất lượng hình ảnh của thiết bị quang học [27, 28]

Nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm sợi đến các thiết bị quang học đã được nhiều chuyên gia trên thế giới quan tâm Các chủng nấm sợi trên thiết bị quang học được xác định thuộc họ Phycomycetes, Ascomycetes gồm một số chi như:

Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Cladosporium…[27, 28] Ở Việt Nam

từ những thập niên 80 trở về trước, nghiên cứu về chống mốc cho kính quang học đã được đề cập bởi tác giả Đặng Hồng Miên, Phạm Hồ Trương [1] Tuy nhiên chế phẩm Thymol gây mờ cho kính quang học sau một thời gian sử dụng

Ống nhòm quân sự là một trong những đối tượng quang học được trang

bị trong Quân đội và trong quá trình sử dụng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới một số lớn bị hỏng do tình trạng nhiễm nấm từ đó hạn chế khả năng quan sát

và phải thải loại Nghiên cứu phân lập nấm mốc trên kính quang học và đề xuất các biện pháp bảo vệ là một trong những nhiệm vụ nghiên cứu của Trung tâm nhiệt đới Việt – Nga Trên cơ sở đó đã thực hiện đề tài Luận văn “

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng gây hại trên kính của một số chủng nấm sợi trên kính quang học ở Việt Nam ” gồm một số nội dung chính sau:

- Phân lập nấm sợi trên thiết bị quan sát quân sự kho lưu trữ ở Xuân Mai –

Hà Nội , Thái Hòa – Nghệ An và Đồng Nai – Biên Hòa

- Đặc điểm hình thái của các chủng nấm sợi phân lập

- Định danh các chủng nấm sợi phân lập bằng phương pháp hình thái và phân tích trình tự đoạn ITS rDNA

- Khả năng sinh axit hữu cơ của một số chủng nấm sợi phân lập

- Thử nghiệm khả năng kháng nấm của Bioxit-A đối với một số chủng nấm phân lập theo tiêu chuẩn ISO 9022-11 và định hướng bảo vệ thiết bị quan sát quân sự khỏi bị tác động của nấm sợi trong điều kiện nhiệt đới

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bảo quản thiết bị quan sát quân sự trong điều kiện nhiệt đới Việt Nam

Như chúng ta đã biết Việt Nam là nước nằm trong khí hậu nhiệt đới gió mùa Thời tiết nóng ẩm mưa mùa và có mùa đông lạnh ở miền Bắc Đây là điều kiện rất thuận lợi cho vi sinh vật nói chung và nấm sợi nói riêng phát triển Trên cơ sở nhận thức được sự ảnh hưởng của vi sinh vật tác động đến trang thiết bị quân sự và khí tài quang học mà Quân đội cũng đã xây dựng các kho lưu trữ nhằm làm giảm thiểu sự phá hủy vi sinh đến vật liệu và trang thiết

bị kỹ thuật Ở mỗi vùng khí hậu đặc trưng khác nhau thì lại có khu hệ nấm sợi khác nhau và sự ảnh hưởng của nấm sợi đến tính chất vật liệu, đặc tính kỹ thuật cụm chi tiết cũng không đồng nhất Chính vì lí do đó ta cần phải biết được đặc điểm khí hậu từng vùng có kho lưu trữ và khu hệ nấm sợi đặc trưng nhiễm vào các thiết bị gây phá hủy vật liệu từ đó đưa ra phương pháp bảo quản phù hợp là điều cần thiết

1.1.1 Kho lưu trữ Xuân Mai – Hà Nội

Xuân Mai hiện nay thuộc địa giới hành chính Hà Nội xong lại mang đặc điểm khí hậu như của Hòa Bình Với đặc trưng khí hậu nóng ẩm có mùa đông lạnh Nhiệt độ trung bình năm khoảng 23oC, lượng mưa trung bình năm

1800 mm, độ ẩm tương đối 85%, khí hậu trong năm chia làm hai mùa rõ rệt Mùa hè bắt đầu từ tháng 4 kết thúc vào tháng 9 nhiệt độ trung bình trên

25 oC, có ngày cao điểm lên đến 43 oC

Mùa đông bắt đầu từ tháng 10 năm trước đến tháng 3 năm sau Nhiệt

độ trung bình trong tháng giao động trong khoảng 10 oC - 20 oC, ngày xuống thấp nhất là 3 oC

Với khí hậu đặc trưng của vùng núi phía Tây bắc thì mùa hè nóng ẩm rất cao thuận lợi cho nấm sợi phát triển, biên độ giao động nhiệt ngày và đêm lớn gây nên các hiện tượng nứt hệ thống gioăng đệm tạo điều kiện thuận lợi cho bào tử nấm xâm nhiễm vào trong thiết bị quang học [40]

1.1.2 Kho lưu trữ Thái Hòa - Nghệ An

Nghệ An nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa vừa mang tính chuyển tiếp của khí hậu miền Bắc và miền Nam Nhiệt độ trung bình năm khoảng 23 oC, cao nhất là 42 oC và thấp nhất là 4 oC, lượng mưa trung bình năm là 1800mm – 2000mm, độ ẩm trung bình là 85% - 90% Tuy nhiên hàng năm Nghệ An còn phải chịu ảnh hưởng của những đợt gió tây nam khô nóng

và bão lụt lớn

Sự chênh lệch nhiệt độ từ 4 oC đến 42 oC sẽ làm ảnh hưởng đến hệ thống gioăng đệm trong thiết bi quang học gây nên hiện tượng nứt, vênh…khi không được bảo ôn tốt Độ ẩm cao cùng với khí hậu chuyển tiếp sẽ tạo nên sự

đa dạng nấm sợi đặc trưng của vùng Đây cũng là một điều cần hết sức chú ý trong quá trình niêm cất và vận chuyển thiết bị trong năm [43]

1.1.3 Kho lưu trữ Đồng Nai – Biên Hòa

Đồng Nai nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa cận xích đạo, với khí hậu ôn hòa ít chịu ảnh hưởng của thiên tai Nhiệt độ cao quanh năm bình quân khoảng 25 oC - 27 oC, lượng mưa tương đối lớn, phân bố theo vùng và theo khu vực 2080mm, độ ẩm trung bình khoảng 80 - 82% Trong năm có hai mùa

rõ rệt: mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11, lượng mưa tương đối lớn khoảng

1700 – 1800mm Mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau Thời tiết nóng

ẩm mưa mùa rất đặc trưng cho khí hậu của miền Nam Mùa mưa chiếm phần lớn lượng mưa trong năm Chính vì thế mùa mưa sẽ tạo độ ẩm tương đối của không khí lớn, cùng với nhiệt độ nắng nóng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho nấm sợi phát triển Sự phát triển của nấm sợi cũng đồng nghĩa với bào tử nấm trong không khí lớn, đây có thể là thời điểm bào tử nấm xâm nhiễm vào thiết

bị quang học nếu chúng ta không có cách phòng tránh hiệu quả [44]

1.2 Nấm sợi gây phá hủy thiết bị quang học

1.2.1 Tác động của nấm sợi lên vật liệu kính

Thuật ngữ phá hủy sinh học chỉ sự thay đổi tính chất vật liệu ngoài ý muốn do các hoạt động sống của của các cơ thể sinh vật gây nên, gồm có

động vật, thực vật và nhất là vi sinh vật Quá trình phá hủy do vi sinh vật diễn

ra theo sáu giai đoạn [38]:

Giai đoạn đầu: Vi sinh vật từ không khí, nước hoặc đất nhiễm lên bề mặt vật liệu, chi tiết, thiết bị Giai đoạn này gọi là tiền phá hủy sinh học và phụ thuộc vào vị trí đặt thiết bị, yếu tố môi trường và bề mặt thiết bị

Giai đoạn hai: Sự hấp phụ của vi sinh vật và bụi bẩn trên bề mặt thiết bị, đây là giai đoạn quan trọng trong cơ chế phá hủy sinh học Các yếu tố quyết định của giai đoạn này là hoạt tính sinh enzym của vi sinh vật, yếu tố môi trường, tính chất vật liệu và điều kiện tiếp xúc giữa vi sinh vật với bề mặt vật liệu

Giai đoạn ba: Hình thành, phát triển các khuẩn lạc vi sinh vật và thay đổi tính chất vật liệu đến khi nhìn thấy bằng mắt thường Quá trình này xuất hiện các sản phẩm trao đổi chất gây ra ăn mòn và thay đổi tính chất vật liệu dẫn đến giảm tính năng tác dụng của thiết bị

Giai đoạn bốn: Tác động của sản phẩm trao đổi chất được tạo thành trong hoạt động sống của vi sinh vật Các sản phẩm này có thể là axit, kiềm, chất oxy hóa và enzym

Giai đoạn năm: có sự tác động tổng hợp của quá trình phá hủy hóa học

và lão hóa

Giai đoạn sáu: Quá trình phá hủy sinh học được biểu hiện do tác động tổng hợp của hàng loạt các yếu tố và thúc đẩy quá trình phá hủy tổng thể gồm lão hóa ăn mòn…[38]

Sự phát triển của nấm mốc trên vật liệu được chia ra các dạng như sau: Bào tử nấm có trong đất và không khí khi gặp điều kiện thích hợp về nhiệt độ, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng, bào tử nấm sinh trưởng nhanh tạo thành các hệ sợi Đối với mỗi loại vật liệu hay chi tiết thì cách thức sinh trưởng của nấm khác nhau Ta có thể chia ra hai dạng cơ bản sau:

Nấm sinh trưởng trên bụi bám ở bề mặt vật liệu: trong môi trường bụi theo không khí bám dính trên bề mặt vật liệu và mang theo vi sinh vật Chúng gây phá hủy trực tiếp bằng cách sử dụng vật liệu làm cơ chất hoặc làm giá thể

sinh trưởng Sự sinh trưởng của nấm sợi cũng phát sinh nhiệt, chúng ta không thể cảm nhận được sự việc này là do tổng tích nhiệt sinh ra nhỏ mà không gian nghiên cứu lớn Tuy nhiên trong một vi tiểu vùng của vật liệu thì nhiệt

độ tăng lên là đáng kể, đây cũng là một nguyên nhân làm giảm tuổi thọ của vật liệu [36]

Nấm sinh trưởng trên bề mặt của vật liệu và ăn sâu vào trong vật liệu: trường hợp nấm dùng vật liệu làm cơ chất cho sự sinh trưởng Nấm sinh ra các enzym ngoại bào làm biến đổi thành phần cấu tạo nên vật liệu Sự phát triển về số lượng của nấm đồng nghĩa với nhu cầu về cơ chất tăng lên, điều này dẫn đến tăng quá trình phá hủy vật liệu [38]

Từ rất lâu một số nhà khoa học trên thế giới đã thấy được sự ảnh hưởng của nấm sợi đến các thiết bị quang học nói chung Sự mô tả của nấm sợi phát triển trên bề mặt kính quang học được ví như mây mù, sợi tóc hay các nhánh được phát triển từ một điểm trung tâm [30]

Khi quân đội ÚC hoạt động ở New Guinea năm 1939 họ đã thấy rằng với các điều kiện ẩm ướt thì chỉ sau 4 – 8 tuần là các dụng cụ quang học như ống nhòm và máy ảnh bị nhiễm nấm mốc Tới năm 1943 các nhà khoa học

ÚC và Bộ đạn dược thành lập một tiểu ban để nghiên cứu về vấn đề trên Các loại nấm phân lập được trên các dụng cụ quang học thuộc nhóm Phycomycetes, Ascomycetes và nấm Imperfecti Các loài thường xuyên bắt

gặp như Penicillium spinulosum, Penicillium citrinum, Aspergillus niger, Trichoderma Viride, Mucor racemosus Các sợi nấm thường bắt nguồn từ các

phần ẩm ướt của thiết bị, các loại gioăng đệm, keo nhựa gắn giữa các thị kính

và vật kính với thân thiết bị hoặc các mảnh vụn hữu cơ rồi sau đó lan ra mặt kính Nếu để sợi nấm phát triển khoảng vài tháng trên bề mặt kính thì sau khi loại bỏ sợi nấm đi vẫn còn các vết mờ in hình sợi nấm trên bề mặt [47]

Năm 1959 trong cuộc hội thảo về thiết bị quang học được tổ chức ở thành phố DEHRADUN thuộc Ấn Độ thì sự xâm nhiễm của nấm sợi vào các thiết bị đã được nghiên cứu Các chủng nấm được phân lập và xác định bao

gồm: Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus candidus, Penicillium sp., Paecilomyces sp., Syncephalastrum sp., Sepedonium sp., Curvularia sp., Fusarium sp và Cladosporium sp Trong các vùng khí hậu

nhiệt đới với nhiệt độ cao cùng độ ẩm lớn là điều kiện thuận lợi cho nấm xâm nhiễm vào trong thiết bị quang học Đặc biệt là về đêm khi mà sự ngưng tụ hơi nước xảy ra mạnh làm độ ẩm trong khoang thiết bị tăng lên cũng làm gia tăng sự phát triển của các bào tử nấm khi xâm nhiễm vào trong thiết bị Tuy

có sự cấu tạo khác nhau giữa các thiết bị quang học như ống nhòm, kính thiên văn hay máy ảnh nhưng đã phát hiện ra sự có mặt của nấm sợi trên các chi tiết kính khác nhau (thị kính, vật kính, lăng kính) Trong các chi tiết kính thì lăng kính được cho là có nhiều nấm sợi hơn cả Ngoài ra nấm sợi còn phát tán ra các bộ phận khác của thiết bị như sơn, keo và gioăng [47]

Trước khi thấy hiện tượng mốc của thiết bị quang học ta thường quan sát thấy hiện tượng mờ sương xảy ra trên bề mặt kính Tuy nhiên nấm thường phát triển ở các phần khác của thiết bị quang học hơn là từ các chi tiết kính [2]

Mặc dù nấm sợi mọc ở hầu hết các điều kiện môi trường trên hành tinh này, đa số đều thích nhiệt độ từ 20-30 °C và độ ẩm tương đối lớn hơn 90% Chúng có thể nảy mầm từ các chất dinh dưỡng được lưu trữ trong các bào tử, nhưng để cho sự tăng trưởng, chúng cần một nguồn bổ sung các chất dinh dưỡng như protein, carbohydrate và cellulose Các khoang trong thiết bị quang học tạo ra một vùng để giữ lại các hạt bụi có chứa chất dinh dưỡng, và

có thể duy trì các điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cần thiết cho sự tăng trưởng Theo Tổ chức Tiêu chuẩn hóa quốc tế, một bào tử không thể phát triển trên bề mặt quang kính của thấu kính, lăng kính, gương và những bộ lọc mà không bám vào các nguồn dinh dưỡng - chẳng hạn như các loại sợi dệt và bụi, dầu

mỡ và dấu vân tay, hoặc hệ thống gioăng đệm [28, 29]

Theo nghiên cứu của Magdalena Bartosik và cộng sự khi thử nghiệm

sự tác động của chủng Aspergillus niger đối với vật liệu cấu tạo nên kính

quang học đã cho thấy ảnh hưởng của nấm sợi lên vật liệu kính theo thời gian

Với thành phần hóa học đặc trưng của vật liệu kính quang học ( SiO2-59,6%;

B2O3-3%; Na2O-3%; K2O-10%; ZnO-4,8%; BaO-19%; As2O3-0.6%; 0.3%), nấm sợi được cấy trên môi trường thạch agar có 0.1% gluco sau thời gian 3, 6, 12 tháng thử nghiệm mẫu được tẩy sạch bằng cồn 70% và đánh giá kết quả trên Kết quả cho thấy sau 3 và 6 tháng thử nghiệm chưa có dấu hiệu gây hại, tuy nhiên sau 12 tháng thử nghiệm bắt đầu có dấu hiệu thay đổi về cấu trúc của vật liệu Như vậy nấm sợi có thể tác động đến kết cấu của vật liệu trong quá trình sinh trưởng và phát triển trên bề mặt Tuy nhiên thời gian

PbO-để hiện tượng này xảy ra thường là lâu, có thể là do khả năng tạo axit ở các điều kiện khác nhau của các chủng nấm sợi Ở Việt Nam chúng ta mới chỉ chú

ý đến hiện tượng do nấm sợi gây hại đối với các chi tiết kính, chưa có nghiên cứu chuyên sâu nào về cơ chế gây phá hủy tới vật liệu kính của nấm sợi [22]

1.2.2 Phân lập và phân loại nấm sợi

Phân lập vi sinh vật là bước đầu tiên và quan trọng trong nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và nghiên cứu đặc điểm của các chủng đơn Tùy vào mỗi đối tượng vi sinh vật là loại nào (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn) mà ta lựa chọn môi trường phân lập cho phù hợp Tuy nhiên việc phân lập được các

vi sinh vật này còn phụ thuộc một yếu tố hết sức quan trọng đó là đặc tính mẫu mang vi sinh vật Các phương pháp phân lập thông thường sử dụng đó là mẫu được cho vào dung dịch muối sinh lí vô trùng sau đó lắc đều và cấy trải trên môi trường đặc trưng [4]

Một số tác giả phân lập nấm sợi trên thiết bị quang học bằng cách để các mảnh kính vụn vào đĩa petri chứa môi trường PDA hay Czapeck Khi bề mặt các mảnh kính có nấm sợi tiếp xúc với môi trường thì nấm bắt đầu phát triển tuy nhiên phương pháp này dẫn đến sự phát triển không đều của các chủng nấm ở phía không tiếp xúc với môi trường Trong thực tế không phải lúc nào ta cũng có thể lấy được mẫu kính mang về phòng thí nghiệm để phân lập như trên

Qua nghiêm cứu và cải tiến từ các hướng dẫn lấy mẫu vi sinh vật gây phá hủy vật liệu theo GOST của Nga, tác giả Nguyễn Thu Hoài và cs đã xây dựng phương pháp lấy mẫu nấm sợi trên các thiết bị quang học đảm bảo giữ nguyên được hiện trạng các chi tiết kính, không phải mang các chi tiết kính về phòng thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác và đồng nhất mẫu khi phân lập [5] Phân loại vi sinh vật nói chung và nấm sợi nói riêng hiện nay có thể chia thành hai loại cơ bản: Phương pháp phân loại bằng hình thái và phương pháp phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Phương pháp hình thái là sử dụng các khóa phân loại đã được công bố của các nhà khoa học nghiên cứu về nấm sợi đã được công bố Riêng đối với nấm sợi thì quan sát hình thái khuẩn lạc, hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử

từ đó sử dụng các khóa phân loại (Ví dụ Workshop on Taxonomy and Identification of Fungi, Katsuhiko Ando, Dr, 2003) để định tên [21]

Hiện nay phân loại vi sinh vật theo phương pháp hình thái cần nhiều thời gian và cán bộ thực hành cần nhiều kinh nghiệm Cùng vơi sự phát triển của các ngành khoa học khác và công nghệ thông tin thì phân loại vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử ngày càng phổ biến

Phân loại nấm sợi bằng phương pháp sinh học phân tử đã và đang được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam sử dụng để đánh giá đa dạng loài hay nghiên cứu các đặc tính của các chủng nấm

Theo nghiên cứu của Yuko Takada Hoshono và một số nhà khoa học khác, xác định thành phần loài các chủng nấm bằng việc nhân các đoạn 18S rDNA hay vùng ITS (Internal Transcribed Spacer-Vùng đệm trong được sao

mã [3, 7, 37], là điều phổ biến, ngoài ra 28S rDNA và các đoạn gen chức năng

mã hóa cho protein nào đó cũng được sử dụng để phân loại

Việc lựa chọn cặp mồi cho phản ứng PCR và dùng sản phẩm PCR để giải trình là việc làm quan trọng, vì một số cặp mồi này đặc hiệu cho ngành này trong khi cặp mồi khác lại đặc hiệu hơn với nghành kia Các cặp mồi để nhân gen 18S rDNA và vùng ITS được thiết kế cho phổ rộng các chủng nấm

sợi Việc sử dụng phản ứng PCR để nhân đoạn gen 18S rDNA hay vùng ITS bằng các mồi đặc hiệu có thể cho chúng ta biết vị trí phát sinh chủng loài các mẫu nấm sợi nghiên cứu [15, 37]

Các vùng ITS có độ dài 600 bp đến 700bp là các vùng tiến hóa nhanh nên có thể thay đổi về trình tự cũng như độ dài Các vùng bên cạnh ITS lại rất bảo thủ nên được sử dụng để thiết kế các mồi chung cho nhân bản vùng ITS

Số bản sao các đoạn lặp lại của rDNA lên tới 30 000 trong một tế bào Điều này làm cho ITS trở thành đối tượng nghiên cứu lý thú cho nghiên cứu tiến hóa, phát sinh loài [3]

Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng ITS có thể tiến hành bằng việc giải trình tự trực tiếp vùng quan tâm từ các cá thể khác nhau sau đó tiến hành xây dựng cây phân loại dựa vào số liệu so sánh các trình tự Vì những

lí do đó chúng tôi lựa chọn cặp mồi ITS1F và ITS4 để khuếch đại đoạn gen

so sánh phân loại

1.2.3 Đa dạng nấm sợi trên thiết bị quang học

Nấm có thể mọc ở môi trường có ít hơi nước được do áp suất thẩm thấu bên trong sợi nấm có thể đạt tới 200 atm Khả năng đó cho phép các tế bào nấm hút được hơi nước trong khí quyển một cách dễ dàng Tuy nhiên khả năng hút được hơi ẩm quá cao đó lại có thể phá vỡ các tế bào của nấm khi chúng được đặt trong môi trường có độ ẩm 100% hay được dìm trong nước Trái lại nếu áp suất thẩm thấu bên trong sợi nấm thấp dưới 10 atm thì chúng vẫn sống được ngay cả khi bị dìm trong nước

Ngoài những điều đã kể trên, để mọc được dễ dàng trên thấu kính, nấm

có những đặc tính sau:

Bản năng nảy mầm được trong khí quyển

Khả năng nảy mầm của các bào tử khi đứng đơn độc

Có thể nảy mầm dể dàng trên một mặt nhẵn không có chỗ bám

Nấm có bản năng nảy mầm được trong khí quyển do các bào tử nấm có khả năng hút được lượng nước cần thiết cho sự nảy mầm khi nước ở trạng thái hơi

Khả năng nảy mầm của một bào tử đứng đơn độc là đặc tính của 2 loại

nấm Aspergillus restrictus, Eurotiumtonophilum Ohtsuki vì hầu hết các nấm

chỉ nảy mầm khi có cả một đám tập trung

Một bào tử nấm rơi vào một mặt phẳng thì một mặt có lợi thế là không gian tiếp xúc với khí quyển thoáng hơn nhưng trên bề mặt thấu kính quá nhẵn, rễ nấm khó bám và khó tìm được chất dinh dưỡng và hơi ẩm tích tụ Tuy nhiên, nấm vẫn mọc được, bào tử của nấm này không cần chất dinh dưỡng vẫn nảy mầm được đó là những nghiên cứu của nhà khoa học Nhật Bản Torao Ohtsuki [48] Theo nghiên cứu của Alexandra R và cs, các chủng nấm sợi phổ biến

gây ăn mòn kính học tập trung vào một số nhóm chủ yếu sau: Trichoderma, Cladosporium, Penicillium, Rhizopus, Ulocladium, Aspergillus, Stemphylium, Altemaria, Mucor, Aureobasidium, Chaetomium, Verticillium, Fusarium [9] Còn theo nghiên cứu của Nguyễn Thu Hoài và cs, khi phân lập kính nhiễm

mốc tại nhà máy sản xuất thiết bị quang học tại Phúc Yên, Vĩnh Phúc có 18 chủng nấm sợi được xác định có trên các mẫu kính nhiễm nấm mốc:

Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, Aspergillus ostianus, Aspergillus asperescens, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Cladosporium herbarum, Pithomyces spp., Paecilomyces spp., Curvularia lutana, Penicillium roqueforti, Penicillium lanoso, Penicillium adametzi, Humicola insolens, Chaetomium globosum, Pleospora herbarum, Pestalotiopsis sp Việc xác định các chủng nấm sợi nhiễm trên các chi tiết kính quang học ở ba miền khí hậu nhiệt đới ngoài việc đánh giá đa dạng các chủng nấm gây hại cho thiết bị quang học theo đặc điểm khí hậu nhiệt đới còn giúp ta một phần biết được nguồn lây nhiễm của nấm sợi vào các chi tiết kính của thiết bị quang học khi so sánh với đa dạng nấm sợi ở kho sản xuất thiết bị quang học của Việt Nam ở vùng Phúc Yên, Vĩnh Phúc [6]

1.2.4 Ảnh hưởng đến tính năng thiết bị

Chất lượng các chi tiết kính được đặc trưng bởi độ đồng nhất và độ chiết quang Tuy nhiên nấm làm giảm chất lượng của các chi kính một cách

đáng kể Thấu kính bị phủ một lớp mờ mốc mất tính trong suốt, các sợi nấm phân tán ánh sáng làm cho ảnh mất sắc nét

Dù nấm đã mọc được trên mặt kính, sợi của nó thường chưa bám chặt vào bề mặt của kính thì có thể lau để cứu vãn chất lượng của kính Nếu sợi nấm để lại những vết ăn mòn độ trong suốt của kính không cứu vãn được nữa,

sự việc đó xảy ra như thế nào? Đó là khi có các sợi nấm bám vào bề mặt thấu kính, để lâu hơi nước sẽ tích tụ lại tại đó, hơi nước sẽ hòa tan với một axit hữu

cơ do nấm tiết ra và ăn mòn mặt bóng của thấu kính Nghĩa là một cơ chế sinh học phức tạp kết hợp với một phản ứng hóa học đã xảy ra trên bề mặt của thấu kính Khi ấy, chỉ còn một giải pháp là thay bỏ cái thấu kính đó bằng một cái mới Các sợi nấm với khả năng hút ẩm cao cũng làm gia tăng hiện tượng mù ở

bề mặt các chi tiết kính, điều này làm giảm sự truyền quang và phân tán ánh sáng bởi các hạt nước [48]

Thêm vào đó trên thị kính của một số thiết bị quang học chuyên dụng còn có thước đo để tính tiêu cự, góc lệch….Sự phát triển của nấm cộng với sự tán xạ ánh sáng có thể dẫn đến sai số trong việc tính toán hoặc làm chậm khả năng nhận biết con số trên thước đo của người quan sát điều này làm giảm tính năng kỹ thuật của thiết bị quang học [2, 48]

1.2.5 Khả năng sinh axit của nấm sợi

Như trên đã nói, một trong những yếu tố gây ăn mòn kính là các sản phẩm trao đổi chất của nấm sợi tạo ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển

Nghiên cứu của Kerner-Gang cho thấy kính quang học có dấu hiệu bị

ăn mòn sau 5 ngày thử nghiệm bởi chủng nấm Aspergillus versicolor, đối với

các chủng Penicillium funiculosum, Alternaria tenuis và Aspergillus fischeri

thì sự ăn mòn sảy ra chậm hơn Sự phát triển của nấm tạo thành các đường rãnh sau khi đã tẩy hết các nấm sợi bám trên bề mặt Nguyên nhân cũng được chỉ ra là do các sản phẩm trao đổi chất của nấm sợi [20] Theo Magdalena Bartosik et al [22] chu trình làm biến đổi tính chất vật liệu kính cấu tạo nên

các thiết bị quang học được xác định bởi sự phát triển của Aspergillus niger

Axit sản sinh ra trong quá trình trao đổi chất là nguyên nhân tác động đến bề mặt kính Kể cả những kính có hàm lượng SiO2 cao cũng bị các sản phẩm trao đổi chất của Aspergillus niger ảnh hưởng Chủng Aspergillus niger mã 0439 khi lên men với cơ chất là glucose trong môi trường khoáng cơ bản có thể tạo

ra axit citric, malic và oxalic Khi nghiên cứu về sản phẩm lên men của chủng

Trichoderma harzianum, Shafiquzzaman Siddiquee và cộng sự đã xác định được tổng cộng 232 hợp chất khi chiết bằng dung môi hexan, trong đó có ít nhất 13 loại axit khác nhau (Trifluoroacetic acid, 1,2-benzenedicarboxylic acid, hexanedioic acid, Arachidic acid, Octadecanoic acid, n-hexadecanoic acid…) W.I.A Saber và cộng sự khi nghiên cứu các axit được tạo thành khi

lên men với nguồn cơ chất là gạo với hai chủng Aspergillus niger GU295947

và Penicillium chrysogenum GU 295948 đã cho thấy các loại axit được tạo

thành (axit acetic, axit ascorbic, axit citric, axit fomic, axit oxalic, axit itaconic, axit levulinic, axit maleic, axit succinic) [35, 36]

Theo nghiên cứu của W.I.A Saber et al (2010) về khả năng sinh axit

hữu cơ đối với hai chủng nấm sợi là Aspergillus niger và Penicillium chrysogenum cho thấy trên các nguồn cơ chất khác nhau thì lượng axit tạo thành khác nhau.[35]

Như vậy các chủng nấm khác nhau có thể tạo ra một đến vài loại axit khác nhau, cơ chất khác nhau cũng làm cho khả năng sinh axit khác nhau Tuy nhiên vật liệu cấu tạo nên kính quang học cũng như lớp phủ chủ yếu là các nguyên tố khoáng được cho là bị ảnh hưởng bởi các loại axit Vì đó mà nghiên cứu khả năng tạo axit trong quá trình sinh trưởng và phát triển là một tiêu chí quan trọng

1.3 Các biện pháp bảo vệ chi tiết kính và thiết bị quang học

Bảo vệ vật liệu nói chung và vật liệu kính quang học nói riêng có rất nhiều phương pháp đang được áp dụng trên thế giới và Việt Nam Việc lựa chọn phương pháp nào để đạt được hiệu quả cao nhất phụ thuộc vào đặc điểm

cấu tạo thiết bị quang học, điều kiện sử dụng Với một số thiết bị quang học được sử dụng cho mục đích đặc thù thì cần có các nghiên cứu riêng biệt để áp dụng đảm bảo yếu tố bảo vệ thiết bị quang học nhưng cũng phải đảm bảo yêu cầu đặt ra của ngành

1.3.1 Phương pháp cách ly

Phương pháp dùng các lớp phủ như sơn, vecni…để phủ lên bề mặt vật liệu tránh sự tiếp xúc trực tiếp của vi sinh vật tới bề mặt của vật liệu cần được bảo vệ Phương pháp bảo quản vật liệu dùng lớp phủ có tác dụng chống phá hủy của vi sinh vật tạm thời và lâu dài tùy vào từng loại lớp phủ và điều kiện

sử dụng Tuy nhiên tác nhân gây phá hủy là vi sinh vật thì không bị ảnh hưởng vẫn tồn tại và có thể phá hủy vật liệu khi các lớp phủ bị bong, tróc khỏi lớp bảo vệ Đối với vật liệu quang khi phủ bằng sơn hay vecni thì khi sử dụng lại chúng ta phải tẩy bỏ lớp phủ, đây là một việc làm mất thời gian do đó phương pháp cách li bằng lớp phủ sơn hay vecni thường không được sử dụng [38]

Để khắc phục nhược điểm này một phương pháp được sử dụng đó là phủ lên bề mặt một lớp mỏng vật chất có bổ sung chất kháng khuẩn và cho ánh sáng truyền qua Tuy nhiên cho dù là lớp mỏng nhưng nó vẫn ảnh hưởng đến độ chiết quang của kính Do vậy người ta đã nghĩ đến các phương pháp bảo quản khác

Một phương pháp cách ly khác có thể sử dụng đó là cho thiết bị quang học vào trong một thiết bị kín đã được vô trùng bằng các loại hóa chất hoặc đèn UV Phương pháp này được cho là có hiệu quả nhưng nó chỉ phù hợp với các bảo quản thiết bị đơn lẻ, trong bảo quản với số lượng nhiều thì cách này là không khả thi [18]

1.3.2 Phương pháp điều khiển thông số nhiệt ẩm

Khi nghiên cứu về sự điều khiển các yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm sợi trên kính quang học Rod D Watkins và cộng sự cho rằng khi bảo quản các thiết bị quang học trong các kho với độ ẩm dưới 65% sẽ ngăn chặn được sự phát triển của nấm sợi Để làm việc này người ta thường để các thiết bị quang học vào trong một phòng và dùng máy hút ẩm hay sấy khô để

hạ xuống độ ẩm cần đặt Đối với các thiết bị đơn lẻ thì ta có thể cho vào các

tủ chống ẩm chạy bằng điện và đặt ở độ ẩm mong muốn Phương pháp này cũng có hiệu quả nhất định, tuy nhiên khi thiết bị quang học của ta sử dụng thường xuyên, độ kín không cao thì sự xâm nhập hơi ẩm vào bên trong khoang của thiết bị là cực kỳ nguy hiểm Vì khi độ ẩm vào trong khoang thiết

bị chúng liên kết với các thành của ống kính bằng các liên kết Vandervan hay mao dẫn làm cho hệ thống hút ẩm không thể hút hết ẩm trong khoang của thiết bị về độ ẩm mong muốn [25]

1.3.3 Phương pháp bảo quản bằng khí khô và chân không

Phương pháp bảo quản vật liệu bằng khí khô là tạo ra xung quanh vật liệu một môi trường khí có tính trơ về mặt hóa học (thông thường sử dụng khí nitơ…) nhằm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật Điều kiện áp dụng phương pháp này là vật liệu, thiết bị bảo quản phải được đặt trong một hộp kín Bảo quản chân không cũng giống như bảo quản bằng khí khô là phương pháp dùng các thiết bị hút gần như toàn bộ không khí để tạo ra chân không trong khoang bảo quản vật liệu trang thiết bị cần bảo quản Phương pháp này đơn giản, hiệu quả tuy nhiên yêu cầu các khoang chứa phải kín Mà các thiết bị quang học của ta thường có các khớp nối để điều chỉnh tiêu cự, cho nên một khi đã sử dụng thì khó có thể kín hoàn toàn Chính vì thế phương pháp này chỉ áp dụng trong trạng thái thiết bị mới và bảo quản niêm cất tại các kho

1.3.4 Phương pháp sử dụng bioaxit

Microbioxit là những chất hóa học có tác dụng giết chết vi sinh vật đang tồn tại dưới bất cứ dạng sống nào như tế bào sinh dưỡng, bào tử….Một chất có thể tiêu diệt một số vi sinh vật nhưng lại không có tác dụng đối với các vi sinh khác, ngoài ra hoạt tính hoạt tính chỉ thể hiện trong nững điều kiện xác định như nhiệt độ, nồng độ và thời gian [5]

Bản chất tương tác giữa microbioxit và vi sinh vật được phân biệt theo hai cơ chế hóa lý và cơ chế hóa học Cơ chế hóa lý diễn ra khi microbioxit tác động thông qua sự phong tỏa bề mặt tế bào, gây cản trở trao đổi chất qua

màng, làm biến tính tạm thời protein,…do tạo ra liên kết không đặc hiệu và lỏng lẻo (liên kết vander-val, liên kết kỵ nước, liên kết hydro) với thành tế bào vi sinh vật Những microbioxit tác động theo cơ chế này là các chất hoạt động bề mặt [38]

Các hợp chất trên đã được thử nghiệm để xác định tính kháng nấm, do một số chất độc hại với con người và môi trường nên không được áp dụng cho bảo vệ kính quang học

Nấm sợi gây hại cho các thiết bị quang học là một vấn đề cũng được các hãng sản xuất thiết bị kính hiển vi quan tâm Hãng Olympus đã nghiên cứu và thử nghiệm nhiều phương thức chống mốc như:

Chống nấm bằng cách trộn chất diệt nấm vào các chất dẻo

Bằng cách phủ lớp diệt nấm lên các thấu kính

Diệt nấm bằng nhiệt, bằng tia bức xạ, bằng khói

Bằng cách tạo môi trường kháng nấm xung quanh kính hiển vi

Tuy có tác dụng nhưng mỗi phương án đều có những nhược điểm khi đưa vào thực tiễn: việc ứng dụng phiền phức, có hạn chế tính trong suốt của thấu kính,

có tác dụng trong một khoảng thời gian không lâu dài và chi phí quá cao…

Sau nhiều lần khắc phục thì Olympus đã đưa ra một giải pháp để bảo quản cho kính quang học là dùng thuốc chống nấm [39]

1.3.5 Chế phẩm Bioxit-A

Nghiên cứu sự gây hại của nấm sợi trên kính quang học cũng đã được một số tác giả trong nước như Đặng Hồng Miên, Phạm Hồ Trương đề cập từ những năm 80 trở về trước Tiến sĩ Phạm Hồ Trương (Viện KH&CN Quân sự)

đã nghiên cứu khả năng ức chế của Thymol để ứng dụng chống nấm mốc quang học và hiện nay chế phẩm NT không được áp dụng trong khí tài quang học vì sau một thời gian bảo quản gây ra hiện tượng tạo một lớp sưng mù trên

bề mặt chi tiết kính quang học và làm tăng hệ số chiết quang của hệ thống quang học [1]

Với các yêu cầu về chất kháng nấm có các đặc điểm như: thăng hoa thành thể hơi độc với nấm mà không độc với con người, không ăn mòn các kết cấu của kính và không ngưng đọng trên bề mặt các lăng kính, thấu kính và không ảnh hưởng đến độ trong suốt của chúng Các yêu cầu đưa ra tương tự các tiêu chí mà Olympus lựa chọn đối với chất chống nấm Từ các căn cứ trên Phân viện Công nghệ Sinh học – Trung tâm nhiệt đới Việt Nga đã chế tạo chế phẩm chống mốc phù hợp với yêu cầu của thiết bị quan sát quân sự Chế phẩm Bio-A là dạng viên nén mang một lượng chất kháng nấm Đặt chế phẩm vào trong thiết bị quan sát nó sẽ thăng hoa từ từ và liên tục cho đến khi hết và tạo ra môi trường bên trong thiết bị luôn có một lượng hơi chất làm cho nấm

bị tiêu diệt hoàn toàn Chế phẩm Bio-A được thiết kế để nhả chậm chất kháng nấm mục đích kéo dài tác dụng của chế phẩm [5]

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Thu thập mẫu kính quang học nhiễm nấm mốc, chế phẩm Bio-A

Thu thập 15 mẫu thiết bị quan sát quân sự (kính quang học) ở cấp độ 5 bị nhiễm nấm tại ba kho lưu trữ ở Xuân Mai – Hà Nội, Thái Hòa - Nghệ An và Đồng Nai - Biên Hòa

Chế phẩm Bio-A được chế tạo tại Phân Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga

2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất: Glucoza (merck); Saccaroza (Merck); NaNO3 (merck);

K2HPO4 (merck); MgSO4 (merck); FeSO4 (merck); Skimilk (merck); môi trường PDA ( Potato Dextrose Agar, merck); kít tách DNA tổng số Fungi/Yeast DNA Extraction (Norgen, Canada); d-NTP (Affymetric, Canada)

Thiết bị: Máy soi gel (Nyx technik, L2126B, Mỹ); Máy nhân gien (Nyx technik, ATC 201, Mỹ; Hệ thống kính hiển vi đầu quan sát 3 cực(Olympus, Nhật bản), máy ảnh(Olympus, Nhật bản) và truyền hình kỹ thuật số, máy tính (Đông nam á, Việt nam); Máy đo pH Hanna ( Ý , pH 211); Máy li tâm eppendoft (Đức); Bể hằng nhiệt hồi lưu (Hàn Quốc); Nồi hấp khử trùng (SANYO, Nhật) và một số thiết bị nghiên cứu khác

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong lưu giữ giống, phân lập, xác định đặc điểm sinh học và môi trường sinh axit (Phụ lục 1)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chọn mẫu

Lựa chọn 5 mẫu đại diện trong các thiết bị quan sát quân sự ở kho lưu trữ

có các hiện tượng sau: Kính bị mờ khi soi, xuất hiện kiểu mạng nhệ trên các chi tiết kính (lăng kính, thị kính, vật kính)

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu, phân lập

Các mẫu kính được xác định vùng bị nhiễm nấm, sử dụng tăm bông sạch đã khử trùng quết lên bề mặt kính bị nhiễm nấm và cấy trải trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar, Merck CAS 1101300500), ủ ở nhiệt độ

30oC, trong điều kiện tối Sau 48-72 giờ nuôi cấy, các khuẩn lạc được quan sát, chọn lọc và cấy thuần trên môi trường đặc trưng cho nấm sợi (Demain, Davies., 1999)

2.2.3 Phương pháp thuần khiết chủng

Phân biệt bằng hình thái khuẩn lạc, màu sắc, hệ sợi và cấu trúc sinh bào

tử để tách các chủng nấm sinh trưởng trên đĩa thạch PDA Từng chủng đơn lẻ được cấy sang các đĩa thạch mới, nuôi cấy ở điều kiện 30oC trong 72 giờ để thu nhận khuẩn lạc

2.2.4 Phương pháp giữ giống

Các chủng nấm đã được làm sạch sau đó cấy trên môi trường Dox (Saccaroza-30g; NaNO3 –30g; K2HPO4-1g; MgSO4-0.5g; FeSO4-0.01g; Thạch-20g; nước cất-1000ml; pH-7.2; khử trùng 1atm/20 phút) Nấm sinh trưởng tốt từ 3 – 5 ngày, lấy bào tử cho vào trong dung dịch Skimilk, sau đó lắc đều và hút 1ml dịch bào tử vào từng ống ampul vô trùng Đông khô dịch bào tử bằng thiết bị Alpha 1-2LD plus, hàn kín ampul và bảo quản ở nhiệt độ phòng

Czapek-2.2.5 Phương pháp quan sát hình thái và cấu trúc sinh bào tử nấm

Nấm được nuôi cấy trong tủ ấm 28- 30°C trên môi trường Czapek có cắm la men nghiêng Sau 72 giờ, lấy ra quan sát hình thái cuống sinh bào tử và bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40, 100 lần (Katsuhiko., 2013)

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Đặc điểm của cơ quan sinh bào tử trần và bào tử trần (tế bào chân, giá sinh bào tử trần, bọng đỉnh giá, cuống thể bình, thể bình, hình dạng, kích thước )

Đặc điểm của bào tử túi (thể quả, nang bào tử, bào tử túi)

Dựa vào đặc điểm hình thái và một số khóa phân loại ta có thể định danh được tên của nấm sợi (Khóa phân loại của H.L.Barnet và cộng sự; phân loại chi Aspergillus dùng khóa phân loại của Raper và Fennell, 1996 ) Khóa phân loại của Katsuhiko Ando, Dr, 2003 cũng được sử dụng để định dánh nấm sợi

2.2.6 Tách ADN tổng số và PCR

Tách chiết ADN : Vi sinh vật được nuôi cấy 2 ngày trên môi trường thích hợp Lấy 1 vòng que cấy khuẩn ty vào ống eppendorf vô trùng, thêm 500 µl 2×SSC vào mỗi ống Lắc đều và giữ ở 99 °C trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 1 lần bằng nuớc cất vô trùng Sau đó tiến hành tách ADN theo trình tự đã hướng dẫn của kít Fungi/Yeast DNA Extraction (Norgen, Canada) ADN sau khi tách chiết được giữ ở -20°C và dùng để làm khuôn cho các phản ứng PCR

Phân đoạn rDNA của nấm sợi được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1F và ITS4 trên thiết bị Nyx technik, ATC 201 với chương trình nhiệt được thiết lập với pha biến tính ở 95°C trong 2 phút kết tiếp là 35 chu kỳ nhiệt (95°C/30 giây, 55°C/30 giây và 72°C/1 phút) Quá trình khuếch đại được hoàn tất ở 72°C trong 10 phút và sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở 4°C

2.2.7 Phân loại nấm dựa trên phân tích trình tự đoạn ITS rDNA

Đoạn ITS rDNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi ITS1F và ITS4 (White et al., 1990; Gardes & Bruns., 1993) có trình tự trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại

đoạn ITS rDNA

Tên đoạn mồi Trình tự mồi

ITS1F 5'- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'

ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1% agarose, đệm TAE, 110 V, 15 phút Gel điện di được nhuộm với edithidium bromide (5 mg/ml) trên máy soi gel Nyxtechnix/Mỹ Kích thước đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được

so sánh với thang chuẩn (Thermo scientific, Mỹ)

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra, tinh sạch, giải trên máy đọc trình tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại công ty 1st BASE (Singapore) Kết quả giải trình tự gen được kiểm tra bằng phần mềm phân tích BioEdit (ver 6.0.7, Mỹ), so sánh với các gen tương ứng đăng ký trên ngân hàng cơ sở dữ liệu GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), phân loại bằng công cụ Blast tree view

2.2.8 Xác định khả năng sinh axit

Nuôi cấy các chủng nấm trên môi trường Czapek – Dox lỏng Sau 5 ngày nuôi cấy, đo giá trị pH của dịch nuôi cấy bằng thiết bị pH HANNA 211

2.2.9 Thử nghiệm gia tốc khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm sợi của Bio-A theo TCVN 7699-2-10-2007

Cấy bào tử các chủng đơn nấm sợi thử nghiệm trên môi trường thạch PDA, đặt các đĩa petri vào trong bình hút ẩm, đặt chế phẩm Bio-A sao cho đạt nồng độ mong muốn (theo mô tả của Nguyễn Thu Hoài và cộng sự 2013) Thử nghiệm duy trì ở độ ẩm khoảng 97%, nhiệt độ 28 ± 2 oC Sau 7 ngày và

28 ngày quan sát đánh giá kết quả Mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng không có bioxit Nồng độ bioxit-A được coi là có hiệu quả nếu ức chế sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm sợi

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nấm sợi trên thiết bị quang học ở ba miền khí hậu của Việt Nam

Quan sát các mẫu kính quang học trên thiết bị quan sát quân sự nhận thấy thấu kính mất độ trong suốt, phân tán ánh sáng giảm rõ rệt và có dấu hiệu

được soi trên kính hiển vi độ phóng đại 40 lần

Các kho bảo quản ở Xuân Mai, Nghệ An, Biên Hòa là các địa điểm được khảo sát và lựa chọn mẫu ống nhòm có những dấu hiệu hư hỏng do nấm gây nên (mẫu ở cấp độ 5) Các địa điểm được khảo sát với những điều kiện khí hậu trung bình năm khác nhau và đặc trưng cho 3 miền Bắc, miền Trung, miền Nam với khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Quan sát và thu 5 mẫu có dấu hiệu hỏng do nấm phá hủy với từng địa điểm khảo sát Phân lập được 61 chủng nấm từ 15 mẫu tại 3 kho bảo quản Dựa trên hình thái, màu sắc của khuẩn lạc nấm chúng tôi đã xác định các chủng nấm xuất hiện trong từng mẫu kính riêng biệt với số lượng khác nhau, trong đó Xuân Mai - 22 chủng, Nghệ An - 23 chủng, Biên Hòa - 16 chủng (bảng 3.1) Như vậy nấm sợi ở hai kho thuộc Xuân Mai và Nghệ An nhiều hơn số nấm sợi trên thiết bị quang học phân lập được ở kho của xí nghiệp 23 Vĩnh Phúc 18 chủng [Nguyễn Thu Hoài và cs 2013]

Bảng 3.1 Số lượng chủng nấm phân lập từ kính quang học nhiễm nấm

MT2_ ON 7x50 (Triều Tiên) 4 MT3_ ON 6x30 (Liên Xô) 4 MT4_ ON 6x30 (Hungari) 5 MT5_ ON 6x30 (Tiệp Khắc) 4

ĐỒNG NAI

-BIÊN HÒA

Tổng 16 chủng

MN2_ ON 6x30 (Z133/VN) 3

MN5_ ON 6x30 (Liên Xô) 3

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy số lượng các chủng nấm tại các kho lấy mẫu ở miền Nam có số lượng thấp hơn so với hai khu vực miền Bắc và miền Trung trên hầu hết các kính có nguồn gốc sản xuất trong nước và nước ngoài

Để làm rõ sự khác biệt về số lượng cũng như thành phần các loài nấm xuất hiện trên kính nhiễm tại ba địa điểm lấy mẫu, chúng tôi phân loại bằng hình thái sơ

bộ để xác định các chi nấm thu được Các thiết bị quan sát quân sự trên có thời gian sản xuất ở các thời điểm khác nhau và các nước khác nhau, tuy nhiên không có sự khác biệt nhiều về số lượng chủng nấm phân lập trên các mẫu

3.2 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy thiết bị quang học ở các miền khí hậu

Các chủng nấm sợi sau khi được phân lập và thuần khiết, được nuôi cấy trên môi trường Czapek để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, khuẩn lạc, sắc tố, giọt tiết, bào tử…để phân loại theo truyền thống

3.2.1 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy quang học Xuân Mai – Hà Nội

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái các chủng nấm sợi phân lập từ các mẫu

kính kho lưu trữ Xuân Mai và phân loại sơ bộ dựa theo hình thái và cuống sinh bào tử

B01 Khuẩn lạc có màu xanh

xám hoặc trắng viền xanh Cuống sinh bào tử là hình

đế gắn trên các thể bình, dạng phức tạp phân nhánh một hoặc hai lần, đối xứng hoặc không Toàn bộ cuống đính bào tử đang mang bào

tử dạng một cái chổi

B07

B08

Khuẩn lác có màu vàng, nâu, đen, lục xám… Cuống đính bào tử gồm một cuống hình ống, hình thành trên một tế bào của sợi nấm gọi

là tế bào chân, đầu cuống phình to hình cầu, hình bầu dục hay hình chùy, trên nó

là giá thể hình chai để đính các chuỗi bào tử gọi là thể bình Nếu chỉ có một lớp thể bình thì gọi là thể bình

sơ cấp, nếu có hai lớp thì lớp mang bào tử là thể bình thứ cấp, lớp đính với đầu cuống đính bào tử là thể bình thứ cấp Toàn bộ cuống đính bào tử đang mang bào tử trông giống như một bông hoa trinh nữ thu nhỏ

B09

B10

Aspergillus niger

B04 dạng đơn, phân nhánh dưới

dạng vòng không đều, mỗi vòng gồm 2 – 3 thể bình Thể bình có phần đáy hình trụ, phía trên thon dần thành một cổ mỏng Bào tử đính dạng chuỗi đính trên các thể bình

4 Curvularia

Spp

B05 Khuẩn lạc dầy, màu xám

đen, bề mặt khuẩn lạc thường dạng nỉ Sợi nấm gần như trong suốt hoặc nâu nhẵn Cuống sinh bào

tử trần, đơn độc, có màu nâu Bào tử sinh ra tạo thành cụm thường hơi cong, có hình elip hoặc hình thoi tròn nhưng

thường không đối xứng

B18

B19

Các chủng nấm được phân lập từ các mẫu kính quang học nhiễm nấm ở Xuân Mai, Hà Nội khá phong phú về màu sắc khuẩn lạc như trắng, xanh, xám, nâu, vàng v.v Hình dạng khuẩn lạc thường có hình tròn hoặc hình dạng không xác định có viền hoặc không với các sợi nấm bông, xốp, dẹt hoặc tạo thành một số tia đối xứng qua tâm Dựa vào màu sắc, đặc điểm bề mặt khuẩn lạc, cuống sinh bào tử, 16 chủng nấm với những đặc điểm đặc trưng có thể được xếp vào 5 nhóm (Bảng 3.2) Trong đó, chi Aspergillus chiếm 5/16

chủng, chi Penicillium chiếm 4/16 chủng, chi Curvularia và chi Paecilomyces

chiếm 2/16 chủng, 3 chủng còn lại chưa xác định Kết quả cho thấy hai chi

chiếm đa số là Aspergillus và chi Penicillium Trong số các chủng thuộc chi Aspergillus, hai chủng B03 và B10 có thể được phân loại thành 2 loài tương

ứng là Aspergillus flavus và Aspergillus niger dựa vào đặc điểm bào tử và cuống sinh bào tử của chúng Chủng B03 có giá bào tử trần thành dày, không màu, ráp; bọng hình dạng dài khi non, sau gần cầu đến cầu; thể bình 1 hoặc 2 tầng nhưng hiếm khi 2 cấu trúc này có cùng trên một đầu Bào tử trần gần cầu đến cầu, gai ráp, thỉnh thoảng elíp khi mới tạo thành Chủng B10 có đầu sinh bào tử trần lớn, màu đen điển hình, lúc đầu hình cầu sau tẽ ra Cuống sinh bào

tử trần kích thước thay đổi, nhẵn, không mầu hoặc nâu nhẹ ở nửa phía trên của cuống Bọng hình cầu hoặc gần cầu, thể bình 2 tầng, có mầu nâu nhạt, thể

bình tương đối đồng đều Ngoài ra, chủng B16 có cuống sinh bào tử trần kích thước thay đổi với đầu sinh bào tử nhỏ, tỏa ra lỏng lẻo giống với loài A carneus Để có kết luận chính xác tên loài của chủng B16 cần có những

nghiên cứu sâu hơn tiếp theo Như vậy, những chủng nấm thuộc hai chi nấm

sợi Aspergillus và Penicillium là những chủng phổ biến trên mẫu kính quang

học nhiễm nấm ở kho lưu trữ Xuân Mai, Hà Nội

3.2.2 Đặc trưng nấm sợi gây phá hủy quang học Thái Hòa – Nghệ An

Qua bảng 3.3 cho thấy các chủng nấm sợi khá phong phú về màu sắc

khuẩn lạc (xanh, xám, nâu, vàng…) Các chi Penicillium thường có màu xanh

xám Cuống sinh bào tử là hình đế gắn trên các thể bình, dạng phức tạp phân

nhánh một hoặc hai lần, đối xứng hoặc không.Toàn bộ cuống đính bào tử đang mang bào tử dạng một các chổi Trong đó chi Aspergillus chiếm số

lượng chủ yếu Chi Aspergillus thường có màu vàng, nâu….Cuống đính bào tử của Aspergillus gồm một cuống hình ống, hình thành trên một tế bào của sợi

nấm gọi là tế bào chân, đầu cuống phình to hình cầu, hình bầu dục hay hình chùy, trên nó là giá thể hình chai để đính các chuỗi bào tử gọi là thể bình

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái các chủng nấm phân lập từ các mẫu kính

kho lưu trữ Thái Hòa - Nghệ An và phân loại sơ bộ dựa theo hình thái và cuống sinh bào tử

T12 Khuẩn lạc có màu xanh

viền trắng Cuống sinh bào

tử là hình đế gắn trên các thể bình, dạng nhánh hai lần đối xứng Toàn bộ cuống đính bào tử đang mang bào tử dạng một cái chổi

2 Aspergillus

Spp

T02

Aspergillus niger

Khuẩn lác có màu vàng, nâu, đen, lục xám… Cuống đính bào tử gồm một cuống hình ống, hình thành trên một tế bào của sợi nấm gọi

là tế bào chân, đầu cuống phình to hình cầu, hình bầu

T04

T08 dục hay hình chùy, trên nó

là giá thể hình chai để đính các chuỗi bào tử gọi là thể bình Nếu chỉ có một lớp thể bình thì gọi là thể bình

sơ cấp, nếu có hai lớp thì lớp mang bào tử là thể bình thứ cấp, lớp đính với đầu cuống đính bào tử là thể bình thứ cấp Toàn bộ cuống đính bào tử đang mang bào tử trông giống như một bông hoa trinh nữ thu nhỏ

T10

T18

3 Trichoderma

Spp

T14 Khuẩn lạc màu trắng sau

xanh, sợi mọc lan mặt thạch

Bào tử áo ở giữa sợi nấm hoặc ở đỉnh các nhánh, hình cầu, nhẵn, không màu

4 Curvularia

Spp

T01 Khuẩn lạc dầy, màu xám

đến nâu đen, bề mặt khuẩn lạc thường dạng nỉ Sợi nấm gần như trong suốt hoặc nâu nhẵn Cuống sinh bào tử trần, đơn độc, có màu nâu, thường hơi cong,

có hình elip hoặc hình thoi tròn nhưng thường không đối xứng

T05