Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen xylan beta xylanase trong e coli sử dụng vectorpET 32a(+)

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ NGH SINH HỌC *** KHÓA LUẬN LU TỐT NGHIỆ ỆP Đề tài:“ Thiếtt kkế vecrtor biểu biểu u hi gen xylan-beta beta-xylanase E coli sử ddụng vectorpET 32a(+)” Giáo áo viên hướng dẫn:TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực th hiện: Hoàng Thị Hương Lớp: p: CNSH – 11-02 Hà Nội, 2015 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đỗ Thị Huyền, Phòng Kĩ Thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tận tình hướng dẫn, dìu dắt suốt trình hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học – Trường Viện Đại học Mở Hà Nội giảng dạy, giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể anh, chị làm việc học tập Phòng Kỹ thuật di truyền – Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ bảo tận tình suốt thời gian thực luận văn Cuối xin gửi tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc quan tâm, động viên góp ý cho suốt trình học tập hoàn thành luận văn Sinh viên thực Hoàng Thị Hương Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xylanase 1.1.1 Phân loại xylanase 1.1.2 Cấu trúc xylanase 1.1.3 Cơ chế xúc tác xylanase 1.1.4 Đặc tính xylanase 1.1.5 Nguồn xylanase 1.1.6 Ứng dụng xylanase 10 1.2 Biểu gen 13 1.2.1 Hệ biểu E coli 13 1.2.2 Chủng biểu E coli BL21 15 1.2.3 Vector biểu pET 32a(+) 16 PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu 18 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 2.1.1 Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid 18 2.1.2 Hóa chất enzyme 18 2.1.3 Máy móc thiết bị 18 2.1.4 Các môi trường dung dịch 18 2.2 Phươngphápnghiêncứu 19 2.2.1 Khuếch đại in vitro DNA phản ứng trùng hợp polymerase (PCR) 19 2.2.2 Phản ứng nối gen ngoại lai vào plasmid 19 2.2.3 Phương pháp xử lý DNA plasmid enzyme cắt hạn chế 19 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 19 2.2.5 Tinh chế DNA QIAGEN thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 20 2.2.6 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bắng phương pháp sốc nhiệt 20 2.2.7 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 20 2.2.8 Phương pháp điện di gel polyacrymide – SDS 20 2.2.9 Cảm ứng, biểu protein ngoại lai 21 PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Thiết kế vector biểu pET32a(+) mang gen xbx 23 3.1.1.Khuếch đại gen xbx kĩ thuật PCR 23 3.1.2 Cắt sản phẩm PCR gen xbxvà pET32a(+)bằng NcoI+XhoI 24 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu pET 32a(+) 25 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 3.1.4 Cắt kiểm tra pET32-xbx XhoI+XbaI 27 3.2 Biểu gen xbx E coli BL21 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 37 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Amp Ampicicillin Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani medium M Mol/L PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris acetate EDTA Tyr Tyrosinase XBX Xylan-beta-xylanase Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤCHÌNH VẼ Hình Cấu trúc hóa học xylan Hình Cấu trúc bậc xylanase GH10 từ S lividans Hình Cấu trúc bậc xylanase GH11 từ S paucimobilis Hình Cơ chế phản ứng thủy phân xylan xylanase Bacillus circulans Hình Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan Hình Bản đồ vector pET32a(+) 17 Hình Sơ đồ thí nghiệm 23 Hình Phân tích sản phẩm nhân gen xbx kĩ thuật PCR 24 Hình Phân tích sản phẩm nhân gen xbx kĩ thuật PCR gel agarose 0,8% 25 Hình 11 Kết điện di tách chiết dòng mang vector pET32-xbx 26 Hình 12 Sơ đồ vị trí cắt enzyme giới hạn XhoI XbaI 27 Hình 13 Ảnh điện di sản phẩm cắt pET32-xbx dòng enzyme giới hạn XhoI XbaI gel agarose 0,8% 28 Hình 14 Kết điện di kiểm tra protein tổng số biểu dòng tế bào mang pET32-xbx 29 Hình 15 Điện di dịch tế bào sau siêu âm để kiểm tra biểu pha tan protein xbx dòng tế bào DE3-pET32a-xbx khác 30 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Xylanase enzyme nhiều nhà khoa học quan tâm Enzyme có khả thủy phân hiệu xylan – thành phần chủ yếu hemicellulose thành tế bào thực vật Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chủ yếu tiến hành đối tượng nấm sợi Tuy nhiên, gần với phát mẽ khoa học công nghệ, ngày nhiều chủng vi sinh vật có khả sinh xylanase phát nghiên cứu sâu Đồng thời, lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase ứng dụng loại enzyme vi khuẩn nhà khoa học ngày quan tâm Do nhu cầu sử dụng xylanase nhiều lĩnh vực ngày tăng, đặc biệt nhu cầu enzyme có hoạt tính mạnh, phân cắt nhanh để đưa vào ứng dụng công nghiệp thiếu Với mục đích tìm loại xylanase có đặc tính tốt hơn, thực đề tài “Nghiên cứu biểu biểu gen xbxs mã hóa xylan-beta-xylanase E coli sử dụng vector pET-32a(+)”nhằm thu xylanase tái tổ hợp có tính tốt để ứng dụng thực tiễn Đề tài thực Phòng Kĩ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam MỤC TIÊU - Thiết kế thành công vector pET 32a(+) mang gen xbxs - Biểu thành công xylanase trongE.coli BL21 Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nộộii Khoa Công ngh nghệ sinh học PH PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương xylanase Xylanse có tên gọọi khác là:β-xylanase; endo-1,4-β-xylanase; xylanase; endo endo-1,4-β-Dxylanase;β-D-xylanase;endo endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; xylanohydrolase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β-1,4-xylan xylan xylannohydrolase Tên hệ thống: 4- β-D-xylan β xylannohydrolase Xylanase enzyme quan tr trọng tham gia thủyy phân xylan xylan[8, 20] Xylanase thủy y phân xylan b cách cắt đứt liên kết β-1,4-glycosid glycoside Hình Cấu trúc hóa học xylan Xylan thành ph phần cấu tạo nên hemicellulose củaa thành ttế bào thực vật số hợ ợp chất polysaccharide quan trọng nhấtt ttự nhiên [24, 31].Xylanchủ yếuu tìm thấy th cấu trúc thứ cấp thành tế bào th thực vật tạo thành pha lignin hhợp chất polysaccharide khác[41].Xylan Xylan ccũng ng polysaccharide phổ ph biến loài thực vậtt thông th thường, chiếm 30% tổng trọng ng lượng lư khô sinh khối thực vật nhiệtt đđới Với gỗ mềm vùng ôn đới, i, xylan phổ ph biến chiếm khoảng 8% tổổng trọng lượng khô[14] Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Sự phân hủy sinh học khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo-1,4-β-xylanase(EC 2.1.8), lớp enzyme thủy phân liên kết 1,4-β-glucoside nối với xylose β-xylosidase (1,4-β-D-xylan xylaohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme thủy phân xylobise xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động enzyme endo-xylanase Các enzyme loại mạch nhánh chẳng hạn αglucoronidase α-L-arabinifuranosidase esterase chẳng hạn acetylxylan esterase ferulyl p-coumaroyl esterase loại bỏ mạch nhánh acetyl mạch nhánh phenol [14] Ở gỗ rắn xylan có công thức O-acetyl-4-Omethylglucuron-oxylan Arabino-4-O-methylglucuroxylan tìm thấy gỗ mềm arabinoxylan điển hình cỏ thực vật bình thường khác [14] 1.1.1 Phân loại xylanase Sự đa dạng xylan dẫn đến đa dạng enzyme xylanase[20] Dựa vào đặc điểm hóa lý, xylanase phân thành nhóm: nhóm có phân tử lượng thấp (30 kDa) pI base.Mặc dù nhiều xylanase phù hợp nhóm số lượng xylanase mô tả trước gia tăng nhiều nhiều xylanase có đặc tính trung gian nhận biết không phù hợp với nhóm phân loại Từ 30 họ xác định vào năm 1991, phân loại cập nhật thường xuyên với enzyme phù hợp tạicó 100 họ (GH1 tới GH106)[13] Hầu hết họ bao gồm enzyme với đặc tính chất giống nhau.Tuy nhiên, nhiều họ lại có nhiều đặc điểm khác nhau, enzyme hoạt động carbonhydrate khác Việc tìm kiếm cấu trúc liên quan họ khác dẫn đến kết việc giới thiệu mức độ thứ bậc phân loại biết đến siêu họ quần hợp nhỏ Dựa tương đồng amino acid cấu trúc không gian xylanase thường phân vào họ 10 (trước F) 11 (trước G)[12] Hai họ bao gồm xylanase nhóm phân tử lượng cao, pI thấp phân tử lượng thấp, pI cao đề cập trước đây; họ bao gồm nhiều xylanase Hoàng Thị Hương Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn (2007), Nghiên cứu hoạt độ enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 25 (2009), tr 101-106 Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2009) “Nhân dòng phân tích trình tự gen mã hóa xylanase từ A.niger DSM1957”,Báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nhà xuất Đại học Thái Nguyên, tr 701 – 704 Trần Đinh Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Nguyễn Thị Hà Giang (2008), Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ actinomycetes để xử lý phế thải nông nghiêp,̣ Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghệ thực phẩm, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 901 – 903 Tiếng Anh Annie Deborah Harris and C Ramalingam Xylanases and its application in food industry: A Review 2010, (7): 01 – 11 Bajpai P, Bhardwai NK, Bajpai PK, Jauhari MB The impact of xylanases on bleaching of eucalyptus kraft pulp, 1994, 38(1): 1–6 Beg QK, M Kapoor, L Mahajan, G.S.Hoondal Microbial xylanases and their industrial applications: a review Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 56 (3-4): 326 – 338 Begg M, Baydoun A, Parsons ME, Molleman A Signal transduction of cannabinoid CB1 receptors in a smooth muscle cell line, 2001, 531(1): 95– 104 Chantasingh D., Pootanakit K., Champreda V., Kanokratana P., Eurwilaichitr L (2005)“Cloning, expression and characterization of a Hoàng Thị Hương 32 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học xylanase 10 from Aspergillus tereus (BCC129)in Pichia pastoris”, Protein Experession and Purification, 46: 143 – 149 Christov I, Kapteyn H, Murnane M “Quasi-phase matching of highharmonics and attosecond pulses in modulated waveguides”, 2000, 7(11): 362–367 10 Clarke, A J., Bray, M R and Strating, H.(1993) β-Glycanases and xylanases Their mechanism of action In: ACS Symposium Series No: 533: 27-41 American Chemical Society, USA 11 Cleemput, G., Hessing, M., van Oort, M., Deconynck, M and Delcour, J A (1997) Purification and characterization of β-D-xylosidase and an endoxylanase from wheat flour Plant Physiol 113(2): 377-386 12 Collins T, Gerday C, Feller G Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases FEMS Microbiol Rev 2005 Jan, 29(1):3–23 13 Coutinho PM, Henrissat B (1999b) J Mol Microbiol Biotechnol, 1:307–308 14 Degefu Y (2003), Cloning and characterization of xylanase gen from phytopathogentic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of thern leaf blight of maize, University of Halsinki 15 Elegir G, Szakacs G, Jeffries TW Purification, Characterization, and Substrate Specificities of Multiple Xylanases from Streptomyces sp Strain B-12-2 Appl Environ Microbiol 1994, 60(7):2609–2615 16 Francis X Diebold, Monika Piazzesi, and Glenn D Rudebusch.Modeling Bond Yields in Finance and Macroeconomics,” American Economic Review (2005), pp 2003-2017 17 Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Scholer HR, Duan L, Ding S Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins Cell Stem Cell 2009, 4:381–38 18 Gray J a., Bemiller J n Bread Staling: Molecular Basis and Control Comprehensive reviews in food science and food safety, 2003, 2(1):1–21 Hoàng Thị Hương 33 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 19 Hakulinen N, Turunen O, Janis J, Leisola M, Rouvinen J (2003) Threedimensional structures of thermophilic beta-1,4-xylanases from Chaetomium thermophilum and Nonomuraea flexuosa Comparison of twelve xylanases in relation to their thermal stability Eur J Biochem 270: 1399–1412 20 Hanif M (2004), Characterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suilus bovines and Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation of fungi, University of Helsinki 21 Hughes Clarke, J.E., Danforth, B.W., Valentine, P., (1997) Areal Seabed Classification UsingBackscatter Angular Response at 95 kHz, NATO SACLANTCEN Conference ProceedingsSeries CP-45, High Frequency Acoustics in Shallow Water, pp 243-250 22 Jeffries T W Biochemistry and genetics of microbial xylanases Curr Opin Biotechnol 1996, 7(3): 337-342 23 Jeffries T W., Biochemistry and genetics of microbial xylanases 1996, vol.10 no 4: 239-242 24 Krengel U, Dijkstra BW Three-dimensional structure of Endo-1,4-betaxylanase I from Aspergillus niger: molecular basis for its low pH optimum J Mol Biol.1996 Oct 18, 263(1):70–78 25 Kulkarni N, Shendye A, Rao M Molecular and biotechnological aspects of xylanases FEMS Microbiol Rev 1999 Jul, 23(4):411–56 26 Leggio LL, Jenkins J, Harris GW and Pickersgill RW,(2000) X-ray cystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescensxylanase A Proteins 41(3): 362-373 27 Liisa Viikari, A Suurnakki, J Buchert “enzymes for Pulp and Paper Processing”, 1996, Page: 15–24 28 Martinez-Anaya MA, Jimenez T Functionality of enzymes that hydrolyse starch and non-starch polysaccharide in breadmaking, 1997, 205(3):209– 214 Hoàng Thị Hương 34 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 29 I M Mathrani and B K Ahring, “Thermophilic and alkalophilic xylanases from several Dictyoglomusisolates,” Applied Microbiology and Biotechnology, vol 38, no 1, pp 23–27, 1992 30 Michael R Bedford Reduction of intestinal viscosity through manipulation of dietary rye and pentosanase concentration is effected through changes in the carbohydrate composition of the intestinal aqueous phase and results in improved growth rate and food conversion efficiency of broiler chicks 1992, 122: 560-569 31 Michielse CB, Hookaas PJJ, van den Hondel CAMJJ, Ran AFJ Agrobacteirum-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi Curr Genet 2005, 48:1–17 32 Nelson M, Humphrey W, Kufrin R, Gursoy A, Dalke A, Kale L, et al MDScope- a visual computing environment for structural biology, 1995, 91(1–3): 111–133 33 Oksanen T, Pere J, Buchert J, Viikari L The effect of Trichoderma reesei cellulases and hemicellulases on the paper technical properties of neverdried bleached kraft pulp, 1997, 4(4): 329–339 34 Polizeli MLTM, Rizzatti ACS, Monti R, Terenzi HF, Jorge JA, Amorim DS Xylanases from fungi: properties and industrial applications Appl Microbiol Biotechnol 2005 Jun, 67(5):577–591 35 Ratto M, Poutanen K, Viikari L Production of xylanolytic enzymes by an alkalitolerant Bacillus circulans strain, 1992, 37: 470-473 36 Roncero MB, Torres AL, Colom JF, Vidal T Effect of xylanase on ozone bleaching kinetics and properties of Eucalyptus kraft pulp, 2003, 78(10): 1023–1031 37 Rouau X, El-Hayek M-L, Moreau D Effect of an enzyme preparation containing pentosanases on the bread-making quality of flours in relation to changes in pentosan properties, 1994, 19(3):259–272 Hoàng Thị Hương 35 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 38 Sunna A., and Antranikian, G., 1997, Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria Crit Rev Biotechnol 17: 39-67 39 Viikari L, Kantelinen A, Sundquist J, Linko M Xylanases in bleaching: From an idea to the industry, 1994, 13(2–3):335–350 40 Wong KK, Tan LU, Saddler JN Multiplicity of beta-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications Microbiol Rev 1988 Sep, 52(3):305-317 41 Wong, K.K.Y., Tan, L.U.L and Saddler, J.N (1988) Multiplicity of β-1,4xylanase in microorganisms: functions and applications Microbiol Rev 52: 305–307 Internet 42 www.sciencedirect.com Hoàng Thị Hương 36 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các môi trường dung dịch Môi trường dung dịch sử dụng biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli * Môi trường: - Môi trường LB: Cao nấm men (0.5%), Bacto trypton (1%), NaCl (0.1%) - Môi trường chọn lọc LB + Amp lỏng: Thành phần gồm môi trường LB, bổ sung Amp để đạt nồng độ cuối 100 µg/ml - Môi trường LB đặc: thành phần môi trường LB bổ sung thêm 1.5% agar - Môi trường chọn lọc LB + Amp đặc: thành phần môi trường LB đặc có bổ sung Amp đến nồng độ cuối 100 µg/ml * Dung dịch CaCl2 0.1M Các dung dịch sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli: - Sol I: Glucose: 50 mM; Tris Cl (pH 8,0):25 mM; EDTA (pH 8,0):10 mM - Sol II: NaOH:0,2 N; SDS: 1% - Sol III: Kali acetate: 3M; acetic acid: M - Dung dịch đệm TE: Tris HCl (pH 8,0): 10mM; EDTA (pH 8,0): 1mM - Dung dịch Cloroform/ Izoamylalcohol (24:1): gồm 24 lần thể tích Chloroform lần Izoamylalcohol Các dung dịch dùng điện di gel agarose: - Dung dịch đệm TAE đặc 50X (100 ml): Tris - kiềm: 24,2%; Axit axetic: 5,71 ml; EDTA 0,5% (pH 8,0):10ml Hoàng Thị Hương 37 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Đệm tra mẫu (6X) (loading dye): Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyanol FF: 0,25% Glycerol: 30% - Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide – SDS: - Bis – Acrylamide 30%: Cân 30g acryamide 0,8g bis – acryamide hòa tan 100 ml nước cất vô trùng Bảo quản 4oC - Đệm tris pH = 8,8: Tris: 0,75 M; SDS: 0,2% dùng HCl để chỉnh pH đến 8,8 - Đệm tris pH = 6,8: Tris: 0,25 M; SDS: 0,2% dùng HCl để điều chỉnh pH đến 6,8 - SDS 10% - Đệm chạy điện di: Tris: 0,05 M; Glyceine: 0,192 M; SDS: 0,1% - Dung dịch nhuộm gel (Cosmasie brilliant blue): Comasie brilliant blue: 0,025 g; Methanol: 40 ml; Axit acetic: 10 ml - Dung dịch rửa gel: Methanol: ml; Axit acetic: 7,5 ml làm đầy đến 100 ml nước - APS 10%: cân 10 mg ammonium pẻ sunphate hòa vào 900 mg H2O - TEMED: sử dụng dung dịch đậm dặc mua từ công ty - Đệm xử lý mẫu: (Treatment buffer 6X) Tris HCl 1M (Ph 6,8): ml; Glcerol 100%: ml; SDS: g ; 2-Mecapto: 0,6 ml; Bromophenol: 1,2 mg - Đệm tra mẫu điện di DNA (5X) Bromo phenol blue: 0,25%; Xylen cyanol FF: 0,25% Hoàng Thị Hương 38 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Glycerol: 30% - Gel polyacryamide cho gel: Hóa chất Gel cô (5%) Gel tách (14%) H2O 300 µl 650 µl Tris HCl pH 8,8 1,125 ml - Tris HCl pH 6,8 - 250 µl Glycerol 50% 0,9 ml - Acryamide 30% 2,1 ml 175 µl SDS 10% 45 µl µl APS 10% 30 µl 10 µl TEMED 3µl µl PHỤ LỤC 2: Quy trình phương pháp nghiên cứu Quy trình khuếch đại invitro DNA phản ứng trùng hợp polymerase (PCR) PCR dựa sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA có chiều dài từ 200-3000 bp * Thành phần phản ứng: Hoàng Thị Hương 39 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Tổng 100 (µl) H2O 53 Đệm PCR 10x 10 dNTP mM MgCl2 25 mM Mồi xuôi 10 pmol 10 Mồi ngược 10 pmol 10 Plasmid pha loãng 100x Taq (10 µ/µl) * Thực phản ứng chạy PCR: Hỗn hợp ta đem spin xuống trước chạy Chương trình chạy: Bước 1: 94oC phút : tách mạch, giãn xoắn Bước 2: 94oC 30 giây : bắt đầu chu kì Bước 3: 54oC phút : gắn mồi Bước 4: 72oC phút 30 giây : bắt mồi tổng hợp quy định tính đặc hiệu Lặp lại 30 lần từ bước đến Bước 5: 72oC phút : tạo sợi DNA hoàn chỉnh Bước 6: 4oC 10 : bảo quản Quy trình nối gen ngoại lai vào plasmid Hoàng Thị Hương 40 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Thành phần Thể tích (µl) H2O Buffer T4 DNA ligase 10X (Fermentas) Gen 3,5 Vector pET 32a(+) 1,5 T4 DNA ligase Tổng 10 Hỗn hợp ủ 16oC thời gian thích hợp Quy trình xử lý DNA plasmide enzyme cắt hạn chế Một phản ứng cắt enzyme cắt hạn chế thường tiến hành tổng thể tích 10 µl gồm thành phần sau: - Nước khử ion vô trùng : 5,5 µl - DNA plasmide µl : - Đệm 10X enzyme : µl - Enzyme cắt hạn chế + XhoI +XbaI Hoàng Thị Hương : : 0,25 µl 0,25 µl 41 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Hỗn hợp phản ứng trộn đều, ủ nhiệt độ 37oC 70phút Sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra cách điện di gel agarose 0,8% Quy trình điện di DNA gel agarose * Chuẩn bị gel agarose: - Cân agarose hòa tan vào đệm TAE 1X cho nồng độ 0,8% - Đun sôi tan hết, để dịch agarose nguội đến khoảng 50oC đổ gel vào khuôn có cài sẵn lược - Chờ gel đông ổn định hoàn toàn vòng 30 phút - Rút lược khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào tới ngập mặt gel * Tra mẫu DNA vào giếng: - Tùy thuộc vào mục đích điện di khác mà ta sử dụng nồng độ DNA cao thấp - Tra mẫu sau đổ đệm TAE 1X vào khuôn điện di cho ngập gel Mẫu trộn với loading dye 6X có tác dụng làm tăng trọng lượng riêng acid nucleic, kéo phân tử acid nucleic lắng xuống đáy giếng - Chạy điện di dòng điện 100V khoảng 30 phút từ cực âm sang cực dương - Trong trình chạy, cần quan sát dịch chuyển vạch màu bromophenol để biết lúc cần dừng điện di * Nhuộm DNA EtBr: Sauk hi điện di xong ta lấy nhẹ gel khỏi khuôn ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml khoảng 15 phút rửa lại nước Hoàng Thị Hương 42 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học * Quan sát chụp ảnh: Bản gel sau nhuộm EtBr quan sát ánh sang tử ngoại ߣ=302 nm Ta dùng hệ thống phân tích lưu trữ hình ảnh DNA để chụp ảnh gel với ánh sang tử ngoại Quy trình gel tinh DNA từ gel agarose: - Cắt gel cho vào tube eppendorf cân Cho vào tube lần thể tích buffer - Ủ 50oC 5-7 phút, làm tan mix lên - Chuyển hỗn hợp gel sang cột QIA quick column đặt vào ống thu mẫu - Ly tâm 6000 vòng /30 giây, loại bỏ dịch ống - Thêm 500 µl wash buffer (PE chứa 70% ethanol), ly tâm 6000 vòng/30 giây để loại bỏ dịch Ly tâm tiếp 6000 vòng/phút cho hết cồn - Chuển sang eppendorf bổ sung 40 µl H2O, đợi phút Ly tâm 13000 vòng/phút thu DNA tinh Quy trình sốc nhiệt để biến nạp DNA plasmide vào tế bào E coli * Tạo tế bào khả biến: - Cấy chuyển khuẩn lạc E.coli DH 10b vào ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút - Chuyển 0,5 ml dịch tế bào sang 50 ml môi trường LB, tiếp tục cấy lắc 200 vòng/phút 37oC OD600 đạt 0,4- 0,6 Sau đó, lấy mẫu đặt lên đá khoảng 1h Từ bước này, tất thao tác tiến hành 4oC - Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút Hòa tế bào thu 50 ml CaCl2 100 mM (vô trùng) Ủ mẫu 15 phút ly tâm thu tế bào 3500 vòng/phút 10 phút Hoàng Thị Hương 43 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Hòa tủa 25 ml CaCl2 100 mM , ủ mẫu 60 phút đá - Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút 4oC - Hòa tế bào 0,5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glyxerol - Hút 0,1 ml dịch tế bào vào ống EP bảo quản -75oC * Biến nạp: - Tế bào khả biến lấy từ tủ -80oC làm tan đá khoảng 30 phút - Lấy µl mẫu (DNA+T4 ligase+vector), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố dịch tế bào khả biến Sau đó, để mẫu đá khoảng 30 phút - Sốc nhiệt cách đưa mẫu chuyển sang bể ổn nhiệt với nhiệt độ 42oC ủ phút 30 giây - Lấy mẫu đặt đá phút - Cho khoảng 500- 600 µl LB lỏng, lắc 37oC 45- 50 phút - Hút 100 µl dịch tế bào cấy trải đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Ampcilline 100 µl/ml, có thêm mM IPTG 40 µg/ml X-Gal, ủ đĩa 37oC qua đêm Quy trình tách chiết DNA plasmide từ tế bào E.coli - Cấy chuyển khuẩn lạc tế bào E coli vào ống nghiệm chứa ml môi trường LB có bổ sung µl Amp (100 µg/ml), nuôi lắc qua đêm 37oC, 200 vòng/phút - Rót 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf (EP) 1,5 ml, ly tâm 6000 vòng/phút phút Thu tủa tế bào - Bổ sung 100µl Sol I, vortex sau đặt nhiệt độ phòng 10 phút Hoàng Thị Hương 44 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Bổ sung 200 µl Sol II, mix nhẹ (không vortex) đặt đá 10 phút - Tiếp tục cho vào tube EP 600 µl hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol (24:1) - Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Thu 400 µl dịch cho vào tube EP có chứa 1000µl cồn 100% (hoặc cho cồn 2,5 lần thể tích dịch) để dung dịch kết tủa 20 phút -20oC - Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Phần kết tủa rửa với cồn 70% thu lại cách ly tâm 13000 vòng/phút - Làm khô kết tủa máy speed- vac 10 phút - Hòa tan DNA plasmid vào 30- 40 µl dung dịch TE nước cất - DNA plasmid tách kiểm tra cách chạy điện di gel agarose 0,8% Quy trình điện di protein gel polyacrylamid – SDS: - Xử lý mẫu protein: sau nuôi cấy điều kiện cảm ứng IPTG,các tế bào thu lại nhờ ly tâm phá đệm xử lý mẫu sample buffer 6X ủ 100oC 10 phút để phá tế bào, tích điện âm cho protein - Lắp gel, tra mẫu vào giếng chạy với cường độ dòng cố định từ 20-30 mA khoảng 45 phút - Gỡ gel đem nhuộm Cosmasie brilliant blue Quy trình cảm ứng biều protein ngoại lai: - Cấy lắc qua đêm khuẩn lạc 3ml LB lỏng có bổ sung Amp đến nồng độ cuối 100 µg/ml (LBA) Lắc 37oC, 200 vòng/phút - Cấy chuyển,sang 10 mL môi trường LBA để biểu protein Lắc tiếp 1-2 37oC đến đạt OD600≈ 0,8 lấy tiến hành cảm ứng IPTG với nồng độ cuối 1mM Hoàng Thị Hương 45 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học - Tiếp tục cấy lắc mẫu cảm ứng nhiệt độ thời gian tùy chọn - Thu mẫu vào EP ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút để thu cặn tế bào - Hòa cặn tế bào nước deion để OD600 mẫu 10 Vortex giữ 20oC - Lấy mẫu để nhiệt độ phòng cho tan hết Phá tế bào siêu âm nhanh đến dịch tế bào không nhớt - Bổ sung Sample buffer 6X, biến tính protein 100oC 10 phút - Điện di gel polyacrylamide, nhuộm gel coomassie blue rửa lại dung dịch rửa cho đên qua sát băng điện di protein Hoàng Thị Hương 46 [...]... rãi từ hai nhóm này[6,38] .Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase [42].Nhóm họ 10 bao gồm các enzyme thủy phân cellobiose (dẫn xuất của cellulose) (exocellulase) và endo-β-1,3 -xylanase so với xylanase (endo-β-1,4 -xylanase) trong khi họ 11 là đơn tính chất, bao gồm các xylanase duy nhất .Xylanase thuộc hệ GH11 thuộc nhóm alkaline xylanase [42] Một số lượng nhỏ các xylanase gần đây đã được xác định... sẵn sàng lai ghép gen để tạoo vector tái ttổ hợp pET32xbx 3.1.3 Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET 32a(+) Phản ứng gắn đọ ọan gen xbx vào vector pET 32a(+) đã được đư xử lý bằng enzyme NcoI và XhoI được đư thực hiện nhờ T4 DNA ligase đã nêu ở mục 2, phụ lục 2 Dưới tác dụng củủa enzyme nối đoạn gen xbx dễ dàng đượcc ggắn vào vector pET 32a(+) để tạo ra vector tái tổ t hợp pET 32-xbx Hoàng Thị... loại xylanase mới có đặc tính tốt vẫn rất cần thiết Với mục đích trên, chúng tôi đã ngiên cứu và biểu hiện xylanase trong vi khuẩn E coli BL21 Và để thực hiện điều này chúng tôi đã tiến hành những công việc chính sau: - Thiết kế vector biểu hiện pET32xbx + Khuếch đại gen xbxsbằng PCR + Cắt sản phẩm PCR, pET 32a(+) bằngNcoI + XhoI + Gắn gen xbxs vào vector pET 32a(+) + Cắt kiểm trapET32-xbx bằng enzyme... promoter Hoàng Thị Hương 15 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 1.2.3 Vector biểu hiện pET 32a(+) Để biểu hiện gene trong E coli vector biểu hiện có thể dùng là các plasmid, phage, cosmid Vector biểu hiện là một plasmid được thiết kế nhằm mục đích sản xuất protein với lượng lớn khi được kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc IPTG) Cấu trúc của vector pET32a(+) được biểu hiện trên hình 6 Vector. .. quá trình đưa đoạn gen ngoại lai vào vector biểu hiện trở nên dễ dàng Hầu hết các trình tự của enzyme hạn chế đều được đặt theo khung đọc và nằm sau đoạn peptid tín hiệu 1.2.2 Chủng biểu hiện E coli BL21 Trong nghiên cứu biểu hiện đã sử dụng chủng chủ là E coliBL21(DE3), đây là chủng chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào) Vì vậy, E coliBL21có ưu điểm... làmchủngbiểuhiện gen * Plasmid - Plasmid pET -32a(+) đượcsửdụnglàm vector biểuhiện gen 2.1.2 Hóachấtvàenzyme * Hóachất SDS, Tris- HCl, EDTA, ethanol, chloroform, isoamylalcohol, EtBr, glycerol,IPTG, agar, d-NTP, ampicillin, agarose, MgSO4, D-glucose, caonấm men * Enzyme Các enzyme cắthạnchế: NcoI,XhoIvàHindIII (BioLab, Mỹ), Taq polymerase, T4-DNA ligase 2.1.3 Máymócvàthiếtbị Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy... plasmid trong một tế bào Và tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa các đoạn vào vector biểu hiện theo đúng chiều của promoter, trên vector luôn phải chứa vùng đa nối mang các trình tự của enzyme hạn chế * Promter: Vùng khởi đầu phiên mã là vùng có trình tự DNA đặc biệt, nhận biết bởi RNA polymerase Có nhiều loại promoter khác nhau được sử dụng biểu hiện gen ở E. coli Nhìn chung, để biểu hiện gen cao, promoter... hạn chế sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân hủy và ổn định hơn sau khi tổng hợp Ngoài ra, DNA hệ gen của E coli BL21(DE3) có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7 Gen này được đưa vào hệ gen của chủng E coli BL21(DE3) và đặt dưới sự điều khiển của promoter lac T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khả năng... khác một số protein có nguồn gốc từ Eucaryote không thể biểu hiện tốt trong E. coli Vector dùng để biểu hiện gen ở E. coli được thiết kế đầy đủ, bao gồm các nhân tố di truyền được sắp xếp hợp lý nhằm điều khiển tối ưu cả quá trình phiên mã, dịch mã và tổng hợp nên protein từ gen ngoại lai Ngoài ra vector còn chứa gen mã hóa cho protein vốn có chức năng là dấu hiệu chọn lọc thường là gen kháng chất kháng... không xuất hiện sự tương tự phù hợp đối với họ 10 và 11 Thay vào đó, những xylanase này có những tương đồng đối với các enzyme thuộc họ cácenzyme thủy phân glycoside, họ 5, 7, 8 và 43 Theo đó, nhóm các họ chứa các xylanase nên được mở rộng để bao gồm những enzyme mới này [12] 1.1.2 Cấu trúc của xylanase Hình 2.Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ S lividans Cấu trúc bậc 3 của endo -xylanase chủ yếu được