Thiết kế, biểu hiện đoạn gen VP1 của virus lở mồm long móng type o trong e coli và tinh sạch

Do đó việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus LMLM hiện nay là thực sự cần thiết không những cho nghiên cứu chẩn đoán chính xác bệnh cũng như nghiên cứu sản xuất các l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SỸ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN VP1 CỦA VIRUS

LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI

VÀ TINH SẠCH

NGUYỄN MINH THÀNH

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SỸ

THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN VP1 CỦA VIRUS

LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hoàng Dương, NCS Nguyễn Phương Hoa - Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô – Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian qua

để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn chân thành tới các cô chú, anh chị Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu và các thầy cô khoa Sau Đại học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt cho chúng tôi trong suốt hai năm qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và toàn thể bạn bè,

đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và tiến hành luận văn

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Minh Thành

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của thầy, cô hướng dẫn

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả luận văn

( ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Minh Thành

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh 3

1.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới và Việt Nam 5

1.1.3 Đặc điểm dịch tễ học 8

1.2 VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG 12

1.2.1 Tổng quan về virus Lở mồm long móng 12

1.2.2 Cấu trúc hệ gen của virus Lở mồm long móng 16

1.2.3 Cấu trúc gen virus LMLM 19

1.3 HỆ BIỂU HIỆN E COLI 20

1.3.1 Đại cương về E.coli 20

1.3.2 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) 21

1.3.3 Vector biểu hiện pET-SUMO 22

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 VẬT LIỆU 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Phương pháp điện di trên gel agarose 25

2.2.2 Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR (Polymerase Chain Reaction) 25

2.2.3 Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR TM 4-TOPO 26 2.2.4 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli 27

2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 28

2.2.6 Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzym giới hạn 28

2.2.7 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose 29

2.2.8 Xác định trình tự gene bằng máy tự động 30

2.2.9 Cắt vector pET-SUMO bằng enzym giới hạn 30

2.2.10 Phương pháp thôi gel (Cắt và thu nhận băng AND từ gel agarose ) 31

2.2.11 Phương pháp tạo vector tái tổ hợp 31

2.2.12 Biểu hiện protein VP1 tái tổ hợp trong chủng E Coli BL21(DE3) 32

2.2.13 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 33

2.2.14 Phương pháp Western Blot 35

2.2.15 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp 37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 39

3.1 TÁCH DÕNG ĐOẠN GEN VP1 VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 39

3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET- SUMO MANG GEN VP1 43

3.3 BIỂU HIỆN VECTOR PET-SUMO-VP1 TRONG TẾ BÀO E.COLI BL21 (DE3) 47

3.4 TINH SẠCH PROTEIN VP1 BẰNG ĐUÔI HIS-TAG 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp : Ampicillin

BP( bp) : Cặp Bazơ

DNA maker : Thang DNA chuẩn

DNA : Axit Deoxyribonucleic

E.Coli : Escherichia Coli

EDTA : Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

EtBt : Ethidium Bromide

EtBt : Ethidium Bromide

LB : Môi trường Lauria Betani

LMLM : Bệnh lở mồm long móng

OD : Optical Density (mật độ quang học)

OIE : Office International Epidemiology (Tổ chức dịch tễ thế giới) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RT-PCR : Reverse transcriptase-PCR (Kỹ thuật phối hợp khuyếch

đại trình tự các RNA) SAT : South Africa Territories

SDS : Sodium dodecyl sulphate

TAE : Tris – Acetate – EDTA

Taq polymerase : Polymerase Thermus aquaticus

v/ph : vòng / phút

WHO : Who Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

IRES : International Ribosome Entry Site

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH

Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004 8

Hình 1.1: Friedrich Loeffler 4

Hình 1.2: Các đợt dịch LMLM năm 2003 5

Hình 1.3: Bản đồ phân bố các type LMLM trên thế giới 6

Hình 1.4 : Triệu chứng bệnh LMLM 12

Hình 1.5:Hình ảnh virus Lở mồm long móng 13

Hình 1.6: Hình thái virus LMLM 17

Hình 1.7: Cấu trúc vỏ ngoài cuả virus LMLM 18

Hình 1.8: Hệ gen mã hóa VP1 19

Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm PCR gen VP1 bằng cặp mồi VP1-F/R 40

Hình 3.2: Đĩa cấy tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp chứa gen VP1 41

Hình 3.3: Điện di đồ kiểm tra plasmid mang gen VP1 41

Hình 3.4: Cắt kiểm tra ADN plasmid tái tổ hợp mang gen VP1 bằng EcoRI 42

Hình 3.5:Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa VP1 của virus gây bệnh LMLM ở Việt Nam và trên thế giới bằng chương trình Blast 43

Hình 3.6: Sản phẩm cắt và thôi gel vector pET- SUMO 43

Hình 3.7:Kết quả PCR đoạn gen VP1 tạo ra đầu so le 44

Hình 3.8: Kiểm tra các dòng khuẩn lạc bằng phản ứng PCR 45

Hình 3.9: Sản phẩm tách và tinh sạch plasmid của khuẩn lạc số 1,2,3 46

Hình 3.10 : Biểu hiện gen VP1 ở 18oC và thu mẫu sau 3h,6h, 9h cảm ứng 47

Hình 3.11 : Kết quả kiểm tra lượng protein VP1 tạo ra khi biểu hiện ở 48

18 oC, 20 oC và 25 oC 48

Hình 3.12: Điện di đồ protein VP1 sau khi tinh sạch 49

MỞ ĐẦU

Những năm gần đây, chăn nuôi luôn đóng vai trò quan trọng duy trì tốc độ tăng trưởng trong lĩnh vực nông nghiệp với tốc độ 5-7%/năm so với 2-2,5% /năm của ngành trồng trọt Chăn nuôi, một trong những ngành quan trọng để chuyển đổi

cơ cấu và thúc đẩy tăng trưởng nông nghiệp, riêng ngành chăn nuôi chiếm khoảng

¼ GDP trong sản xuất nông nghiệp Theo Tổng Cục Thống Kê tính đến 7/2013 giá trị sản xuất ngành chăn nuôi (theo giá so sánh 2010) tăng 4,1% so với cùng kỳ năm

2012, tuy nhiên tổng số đàn trâu của cả nước lại giảm 2,5%, đàn bò giảm 3%, đàn lợn giảm 1,5%, gia cầm giảm 2% so với cùng kỳ năm 2012 mà nguyên nhân chính

là do sự đe dọa của dịch bệnh ngày càng tăng, đặc biệt là bệnh lở mồm long móng (LMLM )

Việc phòng chống bệnh LMLM ở nhiều nước đã trở thành vấn đề trọng điểm quốc gia, nhất là trong nền kinh tế thị trường, việc có hay không có bệnh LMLM trong sản xuất, chăn nuôi là một tiêu chí trong quan hệ buôn bán quốc tế và mọi quốc gia sử dụng nó như là một vũ khí trong thương mại Thời gian gần đây, tình hình diễn biến của dịch bệnh LMLM xảy ra ở các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng trở nên phức tạp và khó kiểm soát Ở Việt Nam, những mục tiêu quan trọng nhất mà ngành thú y phấn đấu thực hiện là: khống chế một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc, mà đặc biệt là bệnh LMLM Thế kỷ XXI là thế kỷ của công nghệ sinh học cùng với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật sinh học phân tử đã mở ra những triển vọng nghiên cứu vô cùng to lớn và đã có những thành tựu đáng kể trong việc phát hiện cấu trúc phân tử của virus LMLM Do

đó việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus LMLM hiện nay là thực sự cần thiết không những cho nghiên cứu chẩn đoán chính xác bệnh cũng như nghiên cứu sản xuất các loại vắc-xin thế hệ mới phù hợp với virus LMLM đang lưu hành tại Việt Nam mà còn cho phép xác định mức độ tiến hóa của virus đương nhiễm với các chủng trước đó tại Việt Nam và trên thế giới

Có 7 type virus gây bệnh LMLM: O, A, C, Asia1, SAT1,SAT2 và SAT3 với

trên 70 subtype Ở Việt Nam, đã phát hiện type O; type A và Asia 1 nhưng thường gặp là type O Các type lở mồm long móng này lại chia thành nhiều biến chủng (subtype) khác nhau; ví dụ type A có A1, A2, A3, type O có O1, O2, O3 Do có nhiều type và các type không gây miễn dịch chéo cho nhau nên trong một vụ dịch trâu bò có thể mắc bệnh nhiều lần với các subtype khác nhau Vỏ capsid có 60 đơn

vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chính tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM

Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Thiết kế, biểu hiện

đoạn gen VP1 của virus Lở mồm long móng Type O trong E.coli và tinh sạch.”

với hi vọng kết quả thu được sẽ bước đầu cung cấp những cơ sở khoa học cho đề

tài“Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp dạng giả virus (VLP) để sản xuất vắc

xin lở mồm long móng (LMLM) type O”

Quá trình và mục đích đề tài nghiên cứu của chúng tôi như sau:

+/ Tách dòng gen mã hóa protein vỏ VP1 của virus LMLM type O ở Việt Nam

+/ Biểu hiện và tinh sạch gen VP1 mã hóa protein vỏ virus LMLM type O ở Việt Nam để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp dạng giả virus để sản xuất vắc xin lở mồm long móng type O ở Việt Nam

Đề tài này được thực hiện tại Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung

Vì vậy bệnh thường phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi, ảnh hưởng lâu dài lên năng suất vật nuôi và đến kinh tế xã hội nhiều nước thuộc nhiều châu lục trên thế giới Do bệnh không lây lan sang người nên đôi khi công tác phòng chống dịch bệnh không nhận được sự hưởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng Bệnh thường gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản như bò sữa, bò thịt, lợn hướng nạc Gia súc mắc bệnh thường giảm tăng trọng, giảm sản lượng sữa

và là động vật mang trùng, vì vậy các nước có nền chăn nuôi, kinh tế phát triển rất quan tâm Mặc dù xuất hiện như một loại bệnh nhẹ, có tỷ lệ tử vong thấp ngoại trừ những con vật non, từ 2-5% đối với gia súc trưởng thành và 20-50% ở đàn gia súc như bê, nghé, lợn con Ở gia súc sinh sản, bệnh LMLM làm sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, sản lượng sữa giảm 50% do viêm vú và lượng sữa thu được phải trải qua nhiều khâu khử trùng phức tạp mới sử dụng được Điều này cho thấy sự thiệt hại về kinh tế do bệnh LMLM gây ra là rất trầm trọng Khi dịch bệnh xảy ra gây hậu quả nghiêm trọng cho nền kinh tế - xã hội cũng như các vấn đề về môi trường ở khu vực có dịch vì thế bệnh LMLM được đặt ở vị trí số 2 bảng A trong danh mục các bệnh truyền nhiễm của gia súc

Mô tả đầu tiên bằng văn bản về dịch có lẽ vào năm 1514, khi Fracastorius

mô tả một căn bệnh tương tự trên gia súc tại Italy Gần 400 năm sau, vào năm 1897 Friedrich Loeffler và Frosch đã chứng minh được tác nhân gây nên bệnh lở mồm long móng có thể qua lọc

1997: Đài Loan (Taiwan)

2001: Anh (United Kingdom)

Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 và 1981 Dịch bệnh lở mồm long móng đã xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ

Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001 Hàng triệu gia súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia này nói chung Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tại Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan Đến cuối năm 2003, dịch xảy ra ở vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Myanma, Philippines và Việt Nam) Một năm sau, dịch lan tới Trung Quốc, Nga, Mông Cổ và tiếp tục ở Myanma

Hình 1.2: Các đợt dịch LMLM năm 2003

Trong 2 năm 2005 và 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ ở các quốc gia như Brasil, Argentina và Paraquay cũng như ở châu Phi (Nam Phi)

1.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới và Việt Nam

1.1.2.1 Phân bố bệnh trên thế giới

Các type huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới Type huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi Type huyết thanh Asia 1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á Riêng type huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippines Theo tài liệu của Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt Nam thuộc type O, gần đây có xuất hiện virus type A ở miền Trung và virus type Asia 1 ở các tỉnh

miền núi phía bắc

Hình 1.3: Bản đồ phân bố các type LMLM trên thế giới

1.1.2.2 Phân bố bệnh tại Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang (1898) Trước đây, bệnh thường thấy ở các tỉnh miền Trung và miền Nam, giáp biên giới Campuchia và Lào Ở miền Bắc, bệnh được ghi nhận trong thời gian dài từ những năm 1921-1963 Bệnh không xảy ra ở khu vực các tỉnh phía Bắc từ 1963-1992 Năm 1993, dịch bệnh xuất hiện ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên- Huế Năm 1995, bệnh xảy ra ở 107 huyện thuộc 26 tỉnh làm nhiều trâu, bò, lợn bị chết Diễn biến bệnh LMLM ngày càng trở nên phức tạp, hàng năm bệnh xảy

ra ở diện rộng với số lượng lớn gia súc mắc bệnh

Theo số liệu của Cục thú y: Năm 1999, trong khi vẫn chưa chấm dứt các đợt dịch từ các tỉnh miền Trung và miền Nam thì ở miền Bắc đợt dịch mới từ Trung Quốc tràn sang tấn công hàng loạt các tỉnh giáp biên Cao Bằng là điểm đầu tiên, từ

đó dịch lan sang các tỉnh khác

Năm 2001, bệnh xảy ra ở 16 tỉnh, thành với 3.976 trâu bò mắc bệnh

Năm 2002, bệnh xảy ra ở 26 tỉnh, thành, gây bệnh cho 10.287 trâu, bò

Năm 2003, 38 tỉnh, thành có dịch, trong đó, 28 tỉnh có dịch ở trâu, bò và 28 tỉnh có dịch ở lợn, với tổng số 20.303 trâu, bò; 1.178 dê và 3.533 lợn mắc bệnh, chủ yếu ở các tỉnh: Quảng Trị, Phú Yên, Đăk Lăk, Khánh Hòa, Gia Lai, Hà Giang

Theo Tô Long Thành và cộng sự thì tình hình dịch bệnh LMLM trong mấy năm gần đây diễn biến hết sức phức tạp và có chiều hướng gia tăng:

Năm 2004: Số tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh, trong đó có 9 tỉnh do virus LMLM serotype A (phát hiện lần đầu tiên tại Ninh Thuận và Bình Định vào tháng 8/2004), 12 tỉnh do virus LMLM serotype O và 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A Nguyên nhân của việc xuất hiện virus LMLM type A có thể là do việc nhập lậu bò từ Campuchia

Năm 2005: Số tỉnh có dịch LMLM là 37 tỉnh với 28.241 trâu bò, 3.976 lợn

và 81 dê mắc bệnh, trong đó có 3 tỉnh do virus LMLM serotype A, 13 tỉnh do virus LMLM serotype O, 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A, 2 tỉnh do virus LMLM serotype Asia1 (phát hiện tại Lào Cai và Khánh Hoà vào tháng 10/2005)

Từ đầu năm 2006 đến nay, số tỉnh có dịch LMLM là 27, trong đó 26 tỉnh là type O và Hà Giang là type Asia 1 (phát hiện tháng 5 năm 2006 bằng kit 3ABC và giám định) với tổng số 9.271 trâu bò và 12.461 lợn bị bệnh

Trong gần trọn một thế kỷ, bệnh này đó tồn tại và phát triển trên địa bàn 107 trong tổng số 229 huyện thuộc 26 tỉnh, gây nên hàng trăm ổ dịch, làm cho hàng chục vạn trâu, bò và lợn bị bệnh

Từ năm 1996-2011, bệnh LMLM đó xảy ra tại 2.873 (26% trong tổng số 11.020) xã, làm tổng số là 5.630 lượt xã có dịch thuộc 463 (66,7% trong tổng số 694) huyện thị, thành phố của tất cả 63 tỉnh, thành phố Tổng số có 238.669 trâu, bò

và lợn bị bệnh trong giai đoạn này

Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004

1.1.3 Đặc điểm dịch tễ học

1.1.3.1 Động vật cảm nhiễm

Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu, các loài dã thú như hươu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt và người ít nhạy cảm với bệnh, loài một móng như ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh Ở người, theo tài liệu của Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đông Đài Loan, thì người ăn thịt bò mắc bệnh đã nấu chín, công nhân giết mổ gia súc mắc bệnh lở mồm long móng đều không mắc bệnh Tuy nhiên, theo tài liệu của BS Nguyễn Vĩnh Phước, người chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng có thể mắc bệnh do virus xâm nhập qua vết thương ở da, đường tiêu hoá, hoặc hô hấp, thời gian nung bệnh khoảng 4-8 ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng: sốt, mụn nước mọc ở đầu ngón tay, bàn chân, cánh tay và các nơi khác Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đôi khi mụn có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày, sau đó sẽ hết bệnh

Chất chứa virus: - Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là

mụn nước sơ phát mới hình thành - Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài

tiết như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi cũng chưá nhiều virus

Số lượng virus trong chất thải này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong ngày đầu và giảm dần Sau 2 tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài tiết Trung bình 1 con heo mắc bệnh sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò) - Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng

1.1.3.2 Đường xâm nhập và cách truyền bệnh

Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ thể Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:

+ Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh

+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh

+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km

1.1.3.3 Cơ chế gây bệnh

- Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày

- Đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể Virus sẽ nhân lên tại các vị trí xâm nhập ở lớp thượng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá,

da, tạo nên mụn nước sơ cấp, thường các mụn nước này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn sinh hoạt bình thường, do đó dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện được Sau 1-2 ngày virus từ mụn nước sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt cao Tuy nhiên, máu và phủ tạng không phải là nơi thích hợp cho sự phát triển, do

đó virus quay ngược trở về các vị trí trên cơ thể có vùng thượng bì non như môi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo các mụn nước thứ cấp Đặc

điểm mụn nước chỉ mọc ở phần thượng bì, không ăn sâu vào lớp trung bì và hạ bì,

do đó sau khi mụn nước vở sẽ rất mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng thành mụn mủ nếu được chăm sóc tốt

- Mụn mọc ở miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức làm thú không nuốt được, nước bọt bị kích thích chảy ra đầy ở miệng Heo con, bê nghé bỏ bú do đó sẽ chết sau vài ngày mắc bệnh

- Mụn nước ở móng chân thường bị nhiễm trùng do thú đi đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ tấn công sâu vào các lớp bên dưới gây hư hại nặng tổ

- Virus có thể tạo các mụn nước ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ

tim kéo theo sự phụ nhiễm của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ

tim, thoái hoá cơ tim làm gia súc chết ngộp

- Ở miệng: lưỡi có mụn to ở đầu lưỡi gốc lưỡi ở hai bên lưỡi, xoang trong miệng trong má, lỗ chân răng, môi có mụn lấm tấm bằng hạt ké, hạt bắp Sau đó mụn vỡ và tạo thành các vết loét đáy nhỏ và phủ màu xám Nước dãi chảy nhiều như bọt xà phòng

- Ở mũi: niêm mạc có mụn nước, đặt biệt là vành mũi có mụn loét, nước mũi lúc đầu trong sau đục dần

- Ở chân, kẽ móng có mụn nước từ trước ra sau, mụn vỡ làm long móng

- Ngoài da: xuất hiện các mụn loét ở vùng da mỏng như bụng, bẹn, vú, ở đầu núm vú…

- Sau khi hàng loạt mụn nước vỡ dần sẽ dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú sốt cao, suy nhược dần rồi chết

- Đối với heo con: sốt cao 40 - 41,5oC, trong những ngày đầu thấy toàn thân

đỏ ửng cả da và niêm mạc Chảy nước mắt và nước dãi, sau 3-4 ngày thấy da nhăn nheo nứt thành từng vết từ trên xuống và có nước chảy ra Nhiều con miệng viêm loét không bú được và nhiễm trùng máu rồi chết Tốc độ lây nhiễm trong đàn heo con là rất nhanh Bệnh tích thường gặp ở bốn chân, mụn loét ở miệng và gây hiện

tượng long móng, sau 7-10 ngày thì lây lan sang toàn đàn

- Đối với heo nái: bệnh biểu hiện nhẹ hơn, thấy mụn nước ở vú, kẽ móng chân, có con nhiễm trùng thì sưng móng viêm có mủ, đi cà nhắc, có con long móng

Chảy nước dãi ở bò Viêm loét miệng bò

Loét kẽ móng chân bò Tụt móng chân ở lợn

Viêm loét lưỡi ở lợn Nổi mụn nước trên mũi lợn

Hình 1.4 : Triệu chứng bệnh LMLM

1.2 VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG

1.2.1 Tổng quan về virus Lở mồm long móng

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

Virus gây bệnh LMLM là loại virus nhỏ nhất thuộc họ Picornavirideae nhóm Aphthovirus, có kích thước 20-30 nm, có cấu trúc đa diện 30 mặt đều, hạt

virus chứa 30% acid nucleic, là một đoạn RNA.Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chính tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM

+ Trong thịt ướp lạnh virus tồn tại khá lâu

+ Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày

+ Nước tiểu virus tồn tại 39 ngày

+ Virus FMDV không có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao đối với các dung môi hữu cơ ( cồn, ete…)

+ Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, …

+ Virus bền vững trong khoảng pH = 7 – 7,7 Nhanh chóng bị vô hoạt ở độ

pH cao hoặc thấp (pH <2 và pH>11) Ở pH = 6, virus mất khả năng gây nhiễm

1.2.1.2 Phân loại

Virus LMLM được hai nhà khoa học Đức là Loefler và Frosch phân lập lầu đầu tiên vào năm 1987 Cho đến năm 1902, hai nhà khoa học Pháp Vallée và Carée lần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò được gọi là type O (phân lập được tại vùng Oisée- Pháp) và type A (phân lập được tại vùng Ardène- Pháp) có trong đàn bò nhập từ Đức Năm 1926 hai nhà khoa học Đức

là Waldmann và Trautwein đã phân lập được 3 type virus LMLM và đặt tên là A, B,

C Nhưng sau đó các nhà khoa học thấy rằng hai type A và B có đặc tính giống với

2 type O và A mà hai nhà khoa học Pháp đã phân lập được trước đó Cho đến năm

1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất gọi các type là O, A, C

Type Asia 1 do Brooksby và Rogere (1957) tìm thấy ở Pakistan, đây là type hay gây bệnh phổ biến ở lục địa Châu Á (cận Đông, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan, Trung Quốc, Lào, Hồng Kông…)

Type SAT1, SAT2, SAT3 (Southern African Teritoties) tìm thấy ở Nam Phi

và được giám định tại viện Pirbright (Anh) trên các bệnh phẩm bò ở miền Nam và Bắc Rhodesia Các type này chủ yếu có trên lục địa Châu Phi (Nam, Trung và Đông Phi, Saudan, Ai cập…) phổ biến nhất là các type SAT1, mới đây cũng thấy type SAT1 tại vùng Trung Cận Đông

Như vậy virus LMLM có 7 type là type A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1các type khác nhau có độc lực khác nhau Những virus này thường biến hóa không ngừng thành những chủng phụ mới có khác biệt về tính kháng nguyên, tồn tại bền vững, đã có hơn 70 phân8 type được xác định vì vậy phải thường xuyên chuẩn đoán định chủng virus chính xác qua xét nghiệm tại phòng thí nghiệm thì mới chọn được loại vaccine thích hợp để phòng cho từng vùng và từng thời kỳ

Các type virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhưng không có miễn dịch bảo hộ chéo với nhau Đây chính là một khó khăn về kỹ thuật

và gây tốn phí lớn về kinh tế trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh thích hợp cho từng khu vực dịch

Phương pháp phân loại virus chủ yếu dựa trên kháng nguyên Cho đến nay chưa phát hiện thêm type nào mới nhưng các chủng virus LMLM do có genome là RNA nên liên tục có sự biến đổi tạo ra các subtype mới Trước đây các subtype thường được ký hiệu bằng số mũ như O1, A32…thì nay người ta thống nhất ký hiệu

là O1, A32…

1.2.1.3 Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên

Theo Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh (1975), Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Merchant I.A và BRNAer R.O, Swam H (1978) và nhiều tác giả khác thì sức đề kháng của virus LMLM đối với ngoại cảnh là tương đối mạnh Tuy có sự biến đổi giữa vài dạng virus về tính kháng nhiệt hay chịu đựng sốc do phản ứng gây ra

Virus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của virus là một lớp lipid do vậy virus có tính đề kháng cao với các dung môi hữu cơ (cồn, ete…) Tuy nhiên virus LMLM lại khá mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, formol, acid, kiềm Như với dung dịch NaOH 0,5-1% tiêu diệt virus một cách nhanh chóng 5 phút

Ở phân, nước tiểu, máu, những chỗ loét hay với nước bọt trâu, bò, virus có thể tồn tại từ 5-10 ngày sau khi nhiễm ở 18ºC Nhiệt độ lạnh là một nhân tố bảo tồn virus LMLM một cách khá tốt Trong tủ lạnh, virus cũng hoạt lực sau 425 ngày Thịt ướp đông lạnh xong sấy khô có thể giữ virus tồn tại trong 52 tháng

Gia súc khỏi bệnh trở thành vật mang trùng lâu dài, đặc biệt là trâu, bò Chính những con mang trùng này là nguyên nhân tái phát ổ dịch cũ và phát sinh ổ dịch mới ở nơi chúng được đưa đến Theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới gia súc tại các ổ dịch cũ, trong khi thực hiện công tác giám sát dịch tễ, nếu phát hiện có dương tính với bệnh LMLM phải giết hủy hoặc đánh dấu không cho vận chuyển

1.2.2 Cấu trúc hệ gen của virus Lở mồm long móng

1.2.2.1 Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM

Cấu trúc của virus LMLM là cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, gồm 1 sợi RNA mạch đơn chứa 8500 nucleotide được đóng gói trong một vỏ protein được tạo thành

từ 60 capsome, không vỏ bọc Mỗi capsomer gồm 4 loại polypeptide VP (virus protein) ký hiệu VP1(1D), VP2 (1C), VP3 (1B), VP4 (1A) 4 loại VP này đều có nguồn gốc từ VP0, VP1 ở lớp ngoài cùng, là yếu tố cấu trúc, tham gia quá trình cố định virus trên màng tế bào, có tính sinh miễn dịch chủ yếu Người ta đã ứng dụng phát hiện này để điều chế vaccine cho hiệu quả cao với VP1 (dẫn liệu của Lê Anh Phụng, 1996; Trần Thanh Phong, 1996) Do có đặc điểm của các virus sợi đơn (+) RNA, virus có tính biến dị và truyền nhiễm mạnh

Bộ gene gồm vùng không giải mã (UTR: untranslated region) dài 1200 base

ở đầu 5’ (5’UTR) (có vai trò quan trọng trong việc giải mã, độc lực, hình thành capsid), vùng này chứa một cấu trúc thứ cấp có thể xoay (clover-leaf secondary structure), và được biết như là vị trí để tiến vào bên trong ribosome (IRES: international ribosome entry site) và đầu 3’ (3’UTR) Phần giải mã protein cấu trúc (1ABCD) và phần giải mã protein không cấu trúc (2ABC và 3ABCD) Chỉ thị phần

tử sử dụng nhiều nhất trong định type và nghiên cứu phả hệ virus lở mồm long móng là 5’UTR và VP1 Cả hai đầu của bộ gene có thể được thay đổi, đầu 5’ tận cùng bởi VPg (genome-linked protein) (khoảng 23 acid amin), đầu 3’ bởi chuổi dài adenyl (King, 2000)

Hình 1.6: Hình thái virus LMLM

Toàn bộ genome của virus LMLM mã hóa cho một protein đơn Sau khi dịch

mã, protein này phân cắt thành 4 sản phẩm sơ cấp: Amino terminal L protease, phân cắt ở đầu cuối carboxyl , P1-2A, tiền chất của protein vỏ, sẽ trải qua giai đoạn polyprotein sau dịch mã với sự tham gia của các protease virus để tạo thành 1 protomer Hạt virus hình thành từ từng đơn vị protomer (hay đơn vị capsid) Từ đơn

vị căn bản này, 5 protomer hợp thành 1pentamer, 12 pentamer liên kết nhau theo cấu trúc khối đối xứng gồm 3 trục để hình thành 1 sợi RNA, đó là 1 virus

Hình 1.7: Cấu trúc vỏ ngoài cuả virus LMLM

Vỏ protein ngoài của virus đƣợc tạo thành từ 60 bản copy của mỗi loại protein 1A (VP4), 1B (VP2), 1C (VP3), và 1D (VP1) 4 loại protein này lắp ráp thành một đơn vị thay thế protein (protein sub-unit) hay một protomer 5 protomer kết hợp thành 1 pentamer 12 pentamer đóng gói vào sợi RNA và tạo thành hạt virus

1.2.3 Cấu trúc gen virus LMLM

Hình 1.8: Hệ gen mã hóa VP1

Hệ gen của virus LMLM có chiều dài khoảng 8.2kb bao gồm 3 vùng gen:

vùng P1 (VP1, VP2, VP3, VP4), vùng P2 ( 2A, 2B, 2C) và vùng P3 ( 3A, 3B, 3C,

3D) Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng mức độ biến đổi của 3 vùng gen này là khác

nhau giữa các type virus LMLM đang lưu hành trên thế giới Vùng gen P1 có mức

độ sai khác nhiều nhất (80.5-85.5%) sau đó vùng gen P2 (89.1-92%) và vùng gen

P3 (89.3-91.7%)

Trong vùng gen P1 chứa gen VP1 có chiều dài khoảng 800bp mã hóa cho

protein VP1 rất khác nhau giữa các type virus LMLM

VP1 đóng vai trò chính trong việc virus LMLM tấn công và xâm nhập vào

trong cơ thể vật chủ, kích thích hệ thống miễn dịch sản sinh ra kháng thể bảo vệ Sự

sai khác nhau trong gene cấu trúc giữa các type virus LMLM là cơ sở để lập ra cây

phân loại so sánh sự khác nhau trong cùng phân type nhưng lưu hành ở các khu vực

địa lý khác nhau Đã có rất nhiều các nghiên cứu về mô tả cấu trúc gene mã hóa

VP1 về tính đa dạng và sự biến đổi gene di truyền của phân type A, Asia1 và O của

virus LMLM lưu hành tại Việt Nam Việc ứng dụng protein tái tổ hợp trong chuẩn

đoán virus LMLM đang được tiến hành tại nhiêu trung tâm chuẩn đoán Việc sử

dụng vaccine tái tổ hợp trong việc phòng bệnh LMLM đang được tiến hành trên toàn bộ các tỉnh có dịch LMLM đang lưu hành

1.3 HỆ BIỂU HIỆN E COLI

1.3.1 Đại cương về E.coli

E coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2 μm, đường kính khoảng

0.25-1 μm E coli hiếu khí, kị khí tùy tiện, thường gặp trong đường ruột, phát triển

dễ dàng trong các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ tối ưu là 37o

C

E coli có 1 nhiễm sắc thể nằm trong thể nhân, là một chuỗi DNA trần với khoảng

4106 căp base

E coli có quá trình biểu hiện gen gồm quá trình phiên mã, dịch mã xảy ra

đồng thời Sau khi mARN tổng hợp được sẽ sử dụng ngay để dịch mã mà không

quá trình sửa đổi sau phiên mã vì E coli không có các intron Do sự đơn giản và tiện lợi đó mà E coli là loại tế bào biểu hiện gen rộng rãi nhất hiện nay thông qua

quá trình sử dụng các plasmid đặc thù cho các loại sản phẩm (protein ngoại lai) mà

ta cần quan tâm Đặc điểm các loại protein được biểu hiện ở E coli là: Không quá

lớn (< 500 amino acid) và không quá nhỏ (>80 amino acid), không quá kị nước;

không chứa quá nhiều gốc disulfur do môi trường bên trong tế bào E coli có tính

khử cao; các đoạn protein hay peptid nhỏ không bền vững trong tế bào, nên nếu muốn biểu hiện tốt nên gắn vào đoạn protein khác

E coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực biểu hiện gen do có nhiều ưu

điểm:

Dễ nuôi: môi trường nuôi cấy, thiết bị, dụng cụ đơn giản, rẻ tiền - góp phần

hạ giá thành sản phẩm Trong ứng dụng là dòng E coli đã được xử lý nên dễ dàng

tiếp nhận plasmid tái tổ hợp cũng như quá trình nhân lên và biểu hiện của đoạn gen

đó E coli dễ dàng biểu hiện rất nhiều gen có nguồn gốc cả Prokaryota và Eukaryota E coli có một số promoter mạnh, có khả năng biểu hiện tốt E coli có

tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả

năng tạo sản phẩm cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l Cấu trúc bộ gen của E coli và đặc

điểm di truyền đã được nghiên cứu khá đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá

trình nghiên cứu và sản xuất khi sử dụng E coli Dòng tế bào E coli được sử dụng

trong sản xuất tương đối an toàn, không có hoạt tính gây bệnh, ít gây hại ở người và động vật

Các sản phẩm protein được tạo ra thường hay kém tan hoặc nằm trong các thể không tan(thể vùi_inclusion bodies) Để khắc phục điều này, bạn có thể hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy khi cảm ứng xuống tới 16°C, thay thế các amino acid, biểu hiện đồng thời với các chaperone, sử dụng đoạn amino acid kèm có tính ưa nước cao, bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy sorbitol, glycyl betain, sucrose, hoặc raffinose, thay đổi pH của môi trường nuôi cấy và sau cùng có thể đổi chủng vi khuẩn khác Tuy nhiên, bạn có thể chọn cách khác là hòa tan trở lại và tái tạo cấu trúc của protein trong thể không tan để thu được protein có hoạt tính Việc giảm nồng độ chất cảm ứng thi thoảng cũng có hiệu quả

1.3.2 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3)

Chủng biểu hiện E coli BL21 là chủng khỏe có thể sinh trưởng trong môi

trường tối thiểu, được làm suy thoái hai protease chìa khóa là lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào) Vì vậy, chủng có ưu điểm

là hạn chế được sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định hơn trong tế bào sau khi được tổng hợp

Ngoài những đặc điểm trên, DNA hệ gen của E coli BL21 có chứa gen mã

hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7 Gen này được đưa

vào hệ gen E coli BL21 và đặt dưới sự điều khiển của promoter lac T7 RNA

polymerase là enzym hoạt động mạnh, có khả năng sao chép hoàn toàn bất kỳ một trình tự DNA nào đặt dưới sự kiểm soát của T7 promoter Chính nhờ những cải biến

này mà E coli BL21 đã trở thành vật chủ hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen được đưa vào hệ vector pET Chủng E coli BL21 là một

vật chủ biểu hiện thông thường được sử dụng với hầu hết các hệ thống promoter như: lac, trc, tac, và araD Nên đây là một chủng rất tốt để làm vật chủ biểu hiện

1.3.3 Vector biểu hiện pET-SUMO

Cấu trúc chung của một hệ biểu hiện cần có đặc điểm nhƣ chứa đựng promoter mạnh, phù hợp với tế bào biểu hiện, chứa đựng trình tự khởi đầu và trình

tự kết thúc của phiên mã, chứa vùng đa nối với vị trí cắt duy nhất trong vector đối với từng enzyme hạn chế, chứa một đoạn peptid tín hiệu để làm dấu hiệu cho sự tiết của protein tái tổ hợp ra ngoài tế bào chất và mang một vài dấu chuẩn chọn lọc để phục vụ cho mục đích sàng lọc thể biến nạp

Vector biểu hiện pET-SUMO có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản nhƣ một plasmid nhƣ sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế

hệ tế bào Ngoài ra, hệ vector pET_SUMO còn có nhiều đặc điểm quan trọng, phù hợp cho việc biểu hiện gen nhƣ: Vector đƣợc dùng để biểu hiện gen VP1 có mang đoạn gen SUMO nhằm tăng khả năng biểu hiện của gen đích, và tăng tính tan cho protein ngoại lai đƣợc biểu hiện, đồng thời vector còn chứa đoạn Smt3 là trình tự nhận biết của enzym SUMO protease, đƣợc thiết kế ngay đầu của đoạn gen cần biểu hiện Protein tái tổ hợp cũng dễ dàng đƣợc tinh sạch nhờ 6-His-Tag đƣợc thiết kế trong vector Vector đƣợc gắn chỉ thị chọn lọc là Kanamicine

CHƯƠNG II:

VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu

- cDNA được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm virus gây bệnh LMLM được

cung cấp bởi Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên

Cứu Khoa học Miền Trung

- Chủng Escherichia coli DH5α

- Chủng Escherichia coli BL21 (DE3)

- Bộ sinh phẩm Super SciptTMOneStep RT- PCR with Platinium Taq

(Invitrogen) để thực hiện phản ứng RT- PCR

- Bộ sinh phẩm pCRTM4-TOPOcloning Kit (Invitrogen) để tách dòng gene

-Bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit (Invitrogen) dùng tinh sạch DNA

plamid

-Bộ sinh phẩm BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (AppliedBiosystems) dùng để giải trình tự gen

- Vector pET-SUMO

- Các loại enzym giới hạn: XhoI, SfoI

- Kit tách plasmid (Invitrogen)

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Invitrogen)

- Enzym nối mạch DNA, T4-DNA ligase

- Enzym khếch đại DNA đầu bằng Vent

- Cặp primer đặc hiệu cho đoạn gen VP1

Forward 5’ ggcatg ACCACCTCCACAGGTGAG 3’ VP1-SUMO-F

Reverse 5’ g CAAAAGCTGTTTCACAGGTGC 3’ VP1-SUMO-R1

Reverse 5’ tcgag CAAAAGCTGTTTCACAGGTGC 3’ VP1-SUMO-R2