Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của l ASPARAGINASE tái tổ hợp ở PICHIA PASTORIS x33

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP Ở PICHIA PASTORIS X33 Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Tuyên Sinh viên thực : Vũ Văn Vạn Lớp Hà Nội - 2015 : 11-01 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP Ở PICHIA PASTORIS X33 Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Tuyên Sinh viên thực : Vũ Văn Vạn Lớp : 11-01 Đề tài thực phòng Công nghệ sinh học enzyme Hà Nội - 2015 Khóa Luận Tốt Nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn cố PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian giúp đỡ hoàn thiện đề tài Tôi xin cảm ơn Ths Nguyễn Thị Hiền Trang trực tiếp hướng dẫn trình hoàn thành luận văn Tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tận tình suốt trình làm khóa luận, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện thận lợi cho suốt trình học tập hoàn thiện luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày 19, tháng 5, năm 2015 Vũ Văn Vạn i Khóa Luận Tốt Nghiệp BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APS Ammonium persulfate asn, ASN L-asparaginase Bp Base pairs Cs Cộng cDNA Complement DNA DNA Deoxyribonocleic acid dNTP 2' Deoxynucleoside 5' triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide Kb Kilo base kDa Kilo dalton M Marker (thang chuẩn) OD Optical density PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) rASN L-asparaginase tái tổ hợp RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease Rpm Reolutions per minute (vòng quay/ phút) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Sodium dodecyl electrophoresis Taq Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine v/v Volume/ volume YNB Yeast nitrogen base WHO World Health Organization Vũ Văn Vạn sulfate polyacrylamide gel ii Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Thành phần loại đệm dung dịch 20 Bảng 2 Danh sách môi trường sử dụng thí nghiệm 21 Bảng Các thiết bị thí nghiệm 22 Bảng Thành phần phản ứng cắt plasmid với enzyme SacI 23 Bảng Trình tự mồi sử dụng 25 Bảng Thành phần PCR 25 Bảng Thành phần gel cô gel tách 28 Bảng Sàng lọc hoạt tính dòng biến nạp 33 Vũ Văn Vạn iii Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng xúc tác thủy phân L-asparagine L-asparaginase Hình Cấu trúc phân tử L-asparaginase 10 Hình Cơ chế phản ứng chung xúc tác L-asparaginase 11 Hình Sơ đồ vector pPICZαA 18 Hình Sơ đồ tích hợp gene ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 19 Hình Đường chuẩn BSA (bovine serum albumin) 29 Hình 2 Đường chuẩn NH3 30 Hình Điện di đồ sản phẩm cắt pPAsn/SacI 31 Hình Điện di đồ sản phẩm tách DNA nấm men 32 Hình 3 Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA nấm men với mồi gene asn (A) mồi AOX1 (B) 32 Hình Điện di đồ SDS-PAGE protein ngoại bào dòng nấm men biểu L-asparaginase tái tổ hợp 34 Hình Ảnh hưởng môi trường tới biểu L-asparaginase tái tổ hợp 35 Hình Đánh giá mức độ biểu rASN Dolphin 1D 35 Hình Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp 36 Hình Điện di đồ sản phẩm tinh L-asparaginase tái tổ hợp 37 Hình Đánh giá độ rASN Dolphn 1D 37 Hình 10 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính rASN 39 Hình 11 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính rASN 40 Vũ Văn Vạn iv Khóa Luận Tốt Nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH UNG THƯ MÁU 1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ L-ASPARAGINASE 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Phân loại 1.2.4 Cấu trúc phân tử L-asparaginase 10 1.3 TÁC DỤNG CỦA L-ASPARAGINASE VỚI TẾ BÀO UNG THƯ 10 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP 12 1.5 HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS X33 15 1.5.1.Vector biểu hiên pPICZαA 17 1.5.2 Chuyển gene ngoại lai vào genome nấm men 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1 VẬT LIỆU 20 2.1.1.Các chủng vi sinh vật plasmid 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3.Các dung dịch đệm 20 2.1.4 Môi trường 21 2.1.4 Thiết bị 22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 23 2.2.2 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men phương pháp xung điện 23 2.2.3 Tách chiết DNA tổng số nấm men 24 2.2.4 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 25 2.2.5 Điện di gel agarose 26 Vũ Văn Vạn Khóa Luận Tốt Nghiệp 2.2.6 Khảo sát điều kiện nuôi biểu L-asparaginase 26 2.2.7 Tinh L-asparaginase tái tổ hợp 26 2.2.8 Điện di biến tính protein (SDS-PAGE) 27 2.2.9 Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme 28 2.2.10 Ảnh hưởng số yếu tố lý hóa lên hoạt độ rASN 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 BIỂU HIỆN L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TRONG P PASTORIS X33 31 3.1.1 Cắt mở vòng vector tái tổ hợp pPAsn SacI 31 3.1.2 Xây dựng hệ thống biểu P pastoris X33/ pPAsn 31 3.1.3 Sàng lọc dòng P pastoris X33/ pPAsn tái tổ hợp 33 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN P PASTORIS X33 34 3.2.1 Khảo sát thành phần môi trường biểu 34 3.2.1 Khảo sát thời gian biểu 36 3.3 TINH SẠCH L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP 36 3.4 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP 38 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính rASN 38 3.4.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính rASN 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Vũ Văn Vạn Khóa Luận Tốt Nghiệp MỞ ĐẦU Ung thư máu dạng ung thư ác tính không tạo u, có tỷ lệ tử vong cao Mỗi năm giới có khoảng 300 nghìn ca mắc bệnh ung thư máu (chiếm 2,8% số tất bệnh ung thư) 220 nghìn người chết bệnh ung thư máu Bệnh ung thư máu độ tuổi 15 chiếm 21,7% 15 tuổi chiếm 78,2% Các tế bào bạch cầu bị bệnh thường xâm nhập vào máu nhanh chóng sau chúng lây lan đến phận khác thể bao gồm hạch bạch huyết, gan, lách, hệ thống thần kinh trung ương (não tủy sống) tinh hoàn Mục đích điều trị bệnh ung thư máu dòng lympho cấp tính để tiêu diệt tế bào bạch cầu ác tính để có khả phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường Y học có nhiều phương pháp điều trị khác bệnh ung thư máu như: hóa trị liệu, điều trị đích, điều trị sinh học, xạ trị, ghép tế bào gốc Các loại thuốc chống ung thư hoạt động dựa khác tế bào thường tế bào ung thư Tuy nhiên có khác biệt hóa sinh học tế bào thường tế bào ung thư L-asparaginase chứng minh có hiệu điều trị ung thư người, hiệu điều trị ung thư bạch cầu cấp tính L-asparaginase khai thác nhu cầu asparagine cao bất thường tế bào ung thư đặc biệt ung thư máu Nguồn asparagine từ chế độ ăn từ thân thể người cung cấp asparagine cho tế bào ung thư, tế bào bình thường không phụ thuộc vào nguồn asparagine từ bên ngoài, tế bào thường tự tổng hợp đủ cho trình trao đổi chất nhờ enzyme tổng hợp asparagine Sự có mặt enzyme L-asparaginase làm thủy phân L-asparagine, lấy yếu tố sinh trưởng quan trọng tế bào ung thư làm cho tế bào ung thư không sống sót Vì vậy, việc tìm kiếm L-asparaginase từ sinh vật giúp bệnh nhân nhận phác đồ điều trị hiệu L-asparaginase tái tổ hợp ngày quan tâm biết rõ đặc tính sinh học gây tác dụng phụ, lực cao với chất độc tính thấp Vũ Văn Vạn Khóa Luận Tốt Nghiệp Do tiến hành đề tài “Biểu hiện, tinh đánh giá tính chất lý hóa L-asparaginase tái tổ hợp Pichia pastoris X33” với mục tiêu: Biểu tinh L-asparaginase tái tổ hợp Đánh giá tính chất lý hóa L-asparaginae tái tổ hợp Vũ Văn Vạn Khóa Luận Tốt Nghiệp kDa M 66→ 45→ 35→ 25→ Hình Ảnh hưởng môi trường tới biểu L-asparaginase tái tổ hợp (M: marker, 1: MT5, 2: MT4, 3: MT2, 4: MT1, 5: YP) Để đánh giá ảnh hưởng thành phần môi trường tới mức độ biểu L-asparaginase tái tổ hợp nuôi biểu P pastoris/pPAsn X11 tái tổ hợp môi trường khác nhau: (MT1, MT2, MT4, MT5, YP) Điện di đồ cho thấy dịch protein ngoại bào môi trường MT4 YP có băng đậm vị trí 45 kDa Đồng thời kiểm tra mức độ biểu rASN phần mềm Dolphin 1D cho thấy mức độ biểu rASN môi trường MT5 (giếng 1) đạt 5,82%, MT4 (giếng 2) đạt 17,22%, MT3 (giếng 3) đạt 12,96%, MT1 (giếng 4): không biểu hiện, YP (giếng 5) đạt 33,21% (Hình 3.6) Do vậy, môi trường YP lựa chọn sử dụng cho nghiên cứu Hình Đánh giá mức độ biểu rASN Dolphin 1D Vũ Văn Vạn 35 Khóa Luận Tốt Nghiệp 3.2.2 Khảo sát thời gian biểu Chủng P pastoris/pPAsn X11 tái tổ hợp nuôi biểu môi trường YP có cảm ứng 1% (v/v) methanol thu mẫu sau 24 để đánh giá hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp Hình Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp Kết đồ thị cho thấy, hoạt tính rASN tăng dần đạt cực đại 72 đạt 4,067 U/mg protein (100%) Hoạt tính bắt đầu giảm từ 96 trở đạt 0,678 U/mg protein 120 (Hình 3.7) Từ số liệu thu cho thấy hủng tái tổ hợp P pastoris/pPASN X33 sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp cao môi trường YP sau 72 cảm ứng methanol 1% 3.3 TINH SẠCH L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP Dịch nuôi biểu bước đầu tinh tủa muối amonium sulfate 60% [57] L-asparaginase tái tổ hợp thiết kế đuôi gồm gốc Histidine, phục vụ cho việc tinh enzyme dễ dàng hiệu Protein tinh qua cột resin hãng Invitrogen cho hệ thống tinh ProbondTM Độ Vũ Văn Vạn 36 Khóa Luận Tốt Nghiệp L-asparaginase tái tổ hợp kiểm tra gel polyacrylamide 12,5%, nhuộm bạc quan sát kết ánh sáng trắng (Hình 3.8) kDa 66→ 45→ 35→ 25→ 18→ Hình Điện di đồ sản phẩm tinh L-asparaginase tái tổ hợp (1: dịch lên cột, 2: dịch qua cột, 3-8 phân đoạn 1-6) Kết điện di đồ cho thấy, dịch tinh từ P pastoris/pPAsn phân đoạn cho băng đậm với kích thước khoảng 45 kDa, với kích thước băng biểu Kích thước cao so với tính toán lý thuyết, trình cải biến hậu dịch mã nấm men, protein biểu bị glycosyl hóa nên gắn thêm gốc đường vào vị trí nhận biết Asn- Xaa- Ser/Ther Hoạt tính rASN tinh đạt 5,37 U/mg protein, độ đạt 80,75% theo đánh giá phần mềm Dolphin 1D (Hình 3.9) Hình Đánh giá độ rASN Dolphn 1D Theo kết Nguyễn Tiến Cường cs 2014, tiến hành biểu hiện, tinh đánh giá hoạt tính rASN nấm men P pastoris, sau tinh kiểm tra SDS-PAGE cho băng có kích thước xấp xỉ 45 kDa, hoạt tính Vũ Văn Vạn 37 Khóa Luận Tốt Nghiệp đạt 6,25 U/mg Kích thước cao lý thuyết nguyên nhân giải thích trình glycosyl hóa [54] 3.4 ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính rASN Enyme bị biến tính nhiều ảnh hưởng tới hoạt tính tác động nhiệt độ Nhiệt độ làm cho số liên kết hydro mạng lưới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc enzyme bị đứt gãy Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nhiệt độ cao hay thấp thời gian ủ Dịch enzyme ủ nhiệt độ khác 25, 37, 45 50 oC Kết hình 3.10 cho thấy hoạt tính enzyme có thay đổi rõ rệt Khi nhiệt độ tăng từ 25- 45°C hoạt tính enzyme tăng dần, nhiệt độ tăng lên đến 50°C hoạt tính enzyme bắt đầu giảm Hoạt tính enzyme đạt cao 45°C đạt 6,157 U/mg (100%) Theo kết nghiên cứu Girao cs (2013) cho biết hoạt tính enzyme rASN biểu P pastoris đạt cao 46ºC, hoạt tính 37ºC 92% so với 46oC [62] Nghiên cứu Pokrovskaya nhân dòng biểu asnB E coli BL21, enzyme có nhiệt độ tối ưu 60ºC [63] Hong cs nhân dòng biểu L-asparaginase từ Thermococcus kodakarensis KOD1 E coli BLR (DE3) có nhiệt độ tối ưu cao 90ºC pH 8,0 [64] Như vậy, so với kết trên, rASN nghiên cứu có nhiệt độ hoạt động tối ưu 450C tương đồng với kết Girao cs (2013) [62] Vũ Văn Vạn 38 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hình 10 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính rASN 3.4.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính rASN Enzyme nhạy cảm với pH môi trường, pH có tác dụng lớn tới vận tốc phản ứng enzyme Mỗi enzyme có trị số pH thích hợp cho hoạt động pH môi trường ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa gốc hydrocacbon acid amin phân tử enzyme, ion hóa nhóm chức trung tâm hoạt động, ion hóa chất, ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Vũ Văn Vạn 39 Khóa Luận Tốt Nghiệp Hình 11 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính rASN Kết cho thấy enzyme có hoạt tính cao giá trị pH (phosphate) pH (Tris-HCl) đạt 11,825 U/mg (100%) (Hình 3.11).Theo kết nghiên cứu Kumar cs rASN Pectobacterium carotovorum MTCC 1428 có dải pH tối từ 8-10 [65] Theo nghiên cứu Pokrovskaya cs (2012) rASN biểu E coli BL21 có hoạt tính cao pH [63] So sánh với kết nghiên cứu Girao cs (2013), rASN P pastoris có hai giá trị pH tối ưu 7,2 Như vậy, rASN theo nghiên cứu hoạt động khoảng pH tương đồng với kết Girao cs [62] Vũ Văn Vạn 40 Khóa Luận Tốt Nghiệp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Biểu thành công L-asparaginase tái tổ hợp P pastoris X33 Chọn dòng tái tổ hợp P pastoris/pPASN-X11có mức độ biểu L-asparaginase cao L-asparaginase biểu tốt môi trường YP, sau 72 h cảm ứng 1% methanol L-asparaginase tái tổ hợp tinh qua cột Probond Ni 2+ cho băng tương đối có kích thước 45 kDa, hoạt tính 5,37 U/mg protein L-asparaginase tái tổ hợp hoạt động tốt 45oC, pH (đệm phosphate) pH (đệm Tris-HCl) Kiến nghị Tối ưu trình nuôi biểu quy trình tinh để nâng cao hoạt tính L-asparginase tái tổ hợp P pastoris Đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng số dòng tế bào ung thư máu rASN Vũ Văn Vạn 41 Khóa Luận Tốt Nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 Keating, M.J., et al., Long-term follow-up of patients with chronic lymphocytic leukemia treated with fludarabine as a single agent Blood, 1993 81(11): p 2878-84 Appel, I.M., et al., Pharmacokinetic, pharmacodynamic and intracellular effects of PEG-asparaginase in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia: results from a single agent window study Leukemia, 2008 22(9): p 1665-79 Sahu, M.K., et al., Studies on L-asparaginase enzyme of actinomycetes isolated from estuarine fishes J Environ Biol, 2007 28(2 Suppl): p 465-74 Marlborough, D.I., D.S Miller, and K.A Cammack, Comparative study on conformational stability and subunit interactions of two bacterial asparaginases Biochim Biophys Acta, 1975 386(2): p 57689 Wriston, J.C., Jr and T.O Yellin, L-asparaginase: a review Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 1973 39: p 185-248 Jackson, R.C and R.E Handschumacher, Escherichia coli Lasparaginase Catalytic activity and subunit nature Biochemistry, 1970 9(18): p 3585-90 Wikman, L.E., et al., Crystallization and preliminary crystallographic analysis of L-asparaginase from Erwinia carotovora Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2005 61(Pt 4): p 407-9 Tosa, T., et al., L-Asparaginase from Proteus vulgaris Subunit and amino acid composition Biochemistry, 1973 12(6): p 1075-9 Jones, G.E and R.K Mortimer, Biochemical properties of yeast Lasparaginase Biochem Genet, 1973 9(2): p 131-46 Whelan, H.A and J.C Wriston, Jr., Purification and properties of Lasparaginase from Serratia marcescens Biochim Biophys Acta, 1974 365(1): p 212-22 Soru, E., et al., L-Asparaginase from the BCG strain of Mycobacterium bovis I Purification and in vitro immunosuppressive properties Can J Biochem, 1972 50(11): p 1149-57 DeJong, P.J., L-Asparaginase production by Streptomyces griseus Appl Microbiol, 1972 23(6): p 1163-4 Holcenberg, J.S., et al., Physical properties of Acinetobacter glutaminase-asparaginase with antitumor activity J Biol Chem, 1972 247(23): p 7750-8 Vũ Văn Vạn 42 Khóa Luận Tốt Nghiệp 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Matthews, W.S and H.D Brown, Isolation of two L-asparaginases from guinea pig liver Enzyme, 1974 17(5): p 276-86 Sieciechowicz, K.A and R.J Ireland, Isolation and properties of an asparaginase from leaves of Pisum sativum Phytochemistry, 1989 28(9): p 2275-2279 Foda, M.S., H.H Zedan, and S.A Hashem, Characterization of a novel L-asparaginase produced by Rhodotorula rubra Rev Latinoam Microbiol, 1980 22(2): p 87-95 Ramakrishnan, S and S.E Hitchcock-DeGregori, Structural and functional significance of aspartic acid 89 of the troponin C central helix in Ca2+ signaling Biochemistry, 1996 35(48): p 15515-21 Gunasekaran, M and C Palaniappan, Purification and properties of glutamine synthetase from Nocardia asteroides Curr Microbiol, 1995 31(3): p 193-8 Abdel-Fattah, M.M and O.G Yassine, Non-Hodgkin's lymphomas in Alexandria, Egypt; incidence rates and trend study (1995-2004) Eur J Cancer Prev, 2007 16(5): p 479-85 Devey, M.E., et al., Detection and verification of quantitative trait loci for resistance to Dothistroma needle blight in Pinus radiata Theor Appl Genet, 2004 108(6): p 1056-63 Mardashev, S.R., et al., [Purification of microbial asparaginases by the aid of affinity chromatography] Biokhimiia, 1975 40(1): p 78-82 Pritsa, A.A and D.A Kyriakidis, L-asparaginase of Thermus thermophilus: purification, properties and identification of essential amino acids for its catalytic activity Mol Cell Biochem, 2001 216(12): p 93-101 Broome, J.D., Antilymphoma activity of L-asparaginase in vivo: clearance rates of enzyme preparations from guinea pig serum and yeast in relation to their effect on tumor growth J Natl Cancer Inst, 1965 35(6): p 967-74 Cedar, H and J.H Schwartz, Production of L-asparaginase II by Escherichia coli J Bacteriol, 1968 96(6): p 2043-8 Behar, C., et al., Mitoxantrone-containing regimen for treatment of childhood acute leukemia (AML) and analysis of prognostic factors: results of the EORTC Children Leukemia Cooperative Study 58872 Med Pediatr Oncol, 1996 26(3): p 173-9 Axarli, I., et al., Investigation of the role of conserved residues Ser13, Asn48 and Pro49 in the catalytic mechanism of the tau class glutathione transferase from Glycine max Biochim Biophys Acta, 2010 1804(4): p 662-7 Vũ Văn Vạn 43 Khóa Luận Tốt Nghiệp 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 Kannan, J.A and T.G Epstein, Immunotherapy safety: what have we learned from surveillance surveys? Curr Allergy Asthma Rep, 2013 13(4): p 381-8 Bonthron, D.T., L-asparaginase II of Escherichia coli K-12: cloning, mapping and sequencing of the ansB gene Gene, 1990 91(1): p 101-5 Lough, T.J., et al., The isolation and characterisation of a cDNA clone encoding L-asparaginase from developing seeds of lupin (Lupinus arboreus) Plant Mol Biol, 1992 19(3): p 391-9 Dickson, J.M., et al., Molecular cloning of the gene encoding developing seed L-asparaginase from Lupinus angustifolius Plant Mol Biol, 1992 20(2): p 333-6 Jennings, M.P., S.P Scott, and I.R Beacham, Regulation of the ansB gene of Salmonella enterica Mol Microbiol, 1993 9(1): p 165-72 Wang, Y., et al., Cloning and expression of L-asparaginase gene in Escherichia coli Appl Biochem Biotechnol, 2001 95(2): p 93-101 Guo, Q.L., M.S Wu, and Z Chen, Comparison of antitumor effect of recombinant L-asparaginase with wild type one in vitro and in vivo Acta Pharmacol Sin, 2002 23(10): p 946-51 Zhao, Y., et al., [Construction of a set of secreting expression vectors for Saccharomyces cerevisiea] Wei Sheng Wu Xue Bao, 2002 42(4): p 431-5 Borisova, A.A., et al., [Purification and properties of recombinant Erwinia carotovora L-asparaginase expressed in E.coli cells] Biomed Khim, 2003 49(5): p 502-7 Kotzia, G.A and N.E Labrou, Cloning, expression and characterisation of Erwinia carotovora L-asparaginase J Biotechnol, 2005 119(4): p 309-23 Ferrara M.A, S.N., Martin AS, Oliveira EMM, Asparaginase production by a recombinant strain Pichia pastoris habouring Saccharomyces cerrevisae ASP3 elsevier.com, 2006 Verma, N., et al., L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent Crit Rev Biotechnol, 2007 27(1): p 45-62 Magdy, M., et al., Pharmacokinetic, pharmacodynamic and intracellular effects of PEG-asparaginase in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia: results from a single agent window study Leukemia, 2008 22(9): p 1665-79 Gladilina, et al., Cerebrospinal fluid changes in the excitatory amino acids concentration caused by the standard treatment of acute lymphoblastic leukaemia in children not correlate with their later cognitive functioning Neuropediatrics, 2009 40(6): p 295-7 Ferrara M.A, S.N., Valente RH, Perales J, Bon EPS, High-yield extraction of periplasmic asparaginase produced by recombinant Vũ Văn Vạn 44 Khóa Luận Tốt Nghiệp 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Pichia pastoris harbouring the Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene2010 Thenmozhi, C., et al., L-asparaginase production by mangrove derived Bacillus cereus MAB5: Optimization by response surface methodology Asian Pac J Trop Med, 2011 4(6): p 486-91 Vidya, J and A Pandey, Recombinant expression and characterization of L-asparaginase II from a moderately thermotolerant bacterial isolate Appl Biochem Biotechnol, 2012 167(5): p 973-80 Jia, M., et al., Cloning, expression, and characterization of Lasparaginase from a newly isolated Bacillus subtilis B11-06 J Agric Food Chem, 2013 61(39): p 9428-34 Chen, S.H., Asparaginase Therapy in Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia: A Focus on the Mode of Drug Resistance: Pediatr Neonatol 2014 Dec 23 pii: S1875-9572(14)00198-3 doi: 10.1016/j.pedneo.2014.10.006 Kawedia, J.D and M.E Rytting, Asparaginase in acute lymphoblastic leukemia Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2014 14(7): p 017 Yao, G., et al., [A clinical observation of treatment of peripheral T-cell lymphoma with L-asparaginase-containing combination chemotherapy] Zhonghua Nei Ke Za Zhi, 2015 54(2): p 111-7 Yong, W., Clinical study of l-asparaginase in the treatment of extranodal NK/T-cell lymphoma, nasal type Hematol Oncol, 2015 21(10) Ngô Kế Sương, V.K.T., Dương Đức Hiếu, Nghiên cứu L-asparaginase Hội nghị Khoa học Công nghệ 2007, 2007: p 23-27 Thi, Q.Đ., Nghiên cứu qui trình sản xuất L-asparaginase tái tổ hợp thử nghiệm diệt dòng tế bào ung thư định hướng dùng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư máu 2014 Nguyễn Thị Hiền Trang, Đ.T.T., Quyền Đình Thi, Biểu tinh L-asparaginase tái tổ hợp E coll thử nghiệm độc tính cấp dòng tế bào ung thư máu Tạp chí y học Việt Nam, 2014 421: p 13-17 Do Thi Tuyen, N.T.C.N.T.H.T., Quyen Dinh Thi, Cloning expression and purification of gene encoding L- asparaginac in Pichia pastoris GS115 The 3rd Academic Conference on Natural Science for Master and PhD Students From Asean countries 11-15, November 2013, Phnom penh, Cambodia, 2013: p 279-289 Nguyen Thi Hien Trang, D.T.T., Quyen Dinh Thi, Expression of Asparaginase gene in E coli The 3rd Academic Conference on Natural Science for Master and PhD Students From Asean countries, 2013: p 307- 316 Tien Cuong Nguyen, T.T.D., Thi Hien Trang Nguyen, Dinh Thi Quyen Expression, purification and evaluation of recombinant L- Vũ Văn Vạn 45 Khóa Luận Tốt Nghiệp 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 asparaginase in mehthylotrophic yeast Pichia pastoris J Viet Env, 2014 6(1-3): p 288-292 Li, P., et al., Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris Appl Biochem Biotechnol, 2007 142(2): p 105-24 Jakoby, W.B., Crystallization as a purification technique, Enzyme Purification and Related Techniques, in Methods in Enzymology Academic Press, 1971 22 El-Bessoumy, A.A., M Sarhan, and J Mansour, Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation J Biochem Mol Biol, 2004 37(4): p 387-93 Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature, 1970 227(5259): p 680-5 Bassam, B.J., G Caetano-Anolles, and P.M Gresshoff, Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels Anal Biochem, 1991 196(1): p 80-3 Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem, 1976 72: p 248-54 Mashburn, L.T and J.C Wriston, Jr., Tumor Inhibitory Effect of LAsparaginase from Escherichia Coli Arch Biochem Biophys, 1964 105: p 450-2 Girao L F, S.L.G.d.R., Ricardo Sobral Teixeira, and J.P Maria Antonieta Ferrara, Elba Pinto da Silva Bon, Purification and characterization of asparaginase II from Saccharomyces cerevisiae cloned in Pichia pastoris: a study on a possible antileukemic drug 2013 Pokrovskaya, M.V., et al., Cloning, expression and characterization of the recombinant Yersinia pseudotuberculosis L-asparaginase Protein Expr Purif, 2012 82(1): p 150-4 Hong, S.J., et al., Cloning, expression, and characterization of thermophilic L-asparaginase from Thermococcus kodakarensis KOD1 J Basic Microbiol, 2014 54(6): p 500-8 Kumar, S., V Venkata Dasu, and K Pakshirajan, Purification and characterization of glutaminase-free L-asparaginase from Pectobacterium carotovorum MTCC 1428 Bioresour Technol, 2011 102(2): p 2077-82 Vũ Văn Vạn 46 PHỤ LỤC Bảng P Xây dựng đường chuẩn NH3 Nồng độ NH3 (µmol) OD 480 nm OD 480 nm OD 480 nm OD trung bình 0,717 0,75 0,773 0,747 0,5 0,392 0,361 0,398 0,384 0,25 0,174 0,179 0,185 0,179 0,125 0,066 0,074 0,071 0,070 0,0625 0,036 0,039 0,03 0,035 Bảng P Sàng lọc hoạt tính dòng biến nạp Dòng Hàm lượng protein Hoạt tính Hoạt tính riêng (mg/ml) (U/ml) (U/mg) X33 0144 ± 0,003 0 X1 0,073 ± 0.001 0,364 5,012 ± 0,188 X2 0,089 ± 0.001 0,439 4,923 ± 0,172 X3 0,079 ± 0.002 0,221 2,783 ± 0,177 X4 0,205 ± 0.001 0 X5 0,222 ± 0.001 0 X6 0,165 ± 0.000 0,189 1,139 ± 0.193 X7 0,153 ± 0.001 0 X8 0,212 ± 0.000 0 X9 0,177 ± 0.002 0 X10 0,166 ± 0.003 0 X11 0,090 ± 0.002 0,633 7,018 ± 0,122 X12 0,075 ± 0.00 0,518 6,869 ± 243 Bảng P Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính rASN Thời gian (giờ) Hàm lượng protein Hoạt tính Hoạt tính riêng (mg/ml) (U/ml) (U/mg) 24 0,0914 ± 0,003 0,1957 2,142 ± 0,164 48 0,1234 ± 0,002 0,4143 3,357 ± 0,154 72 0,1133 ± 0,003 0,4609 4,067 ± 0,098 96 0,1621 ± 0,015 0,3175 1,959 ± 0,121 120 0,2039 ± 0,011 0,3183 0,678 ± 0,162 Bảng P Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính rASN Nhiệt độ Hoạt tính (U/ml) o ( C) Hoạt tính riêng (U/mg) Hoạt tính tương đối(%) 25 0 37 0,131 1,687± 0,033 27,395 45 0,478 6,157± 0,022 100 50 0 Bảng P Ảnh hưởng pH lên hoạt tính rASN pH Hoạt tính (U/ml) Hoạt tính Hoạt tính riêng (U/mg) Đện tương đối (%) 4,5 0 5,0 0,489 6,295 ± 0,061 53,234 5,5 0 6,0 0,084 1,087 ± 0,076 9,197 6,0 0 6,5 0 7,0 0,919 11,825 ± 0,020 100 7,5 0,399 5,142 ± 0,015 43,492 8,0 0,493 6,341 ± 0,015 53,624 8,0 0,919 11,825 ± 0,020 100 8,5 0 8,6 0 9,0 0,306 3,945 ± 0,015 33,359 acetate phosphate Tris-HCl Bảng P.5 Đánh giá mưc độ biểu hiên rASN môi trường khác nhau( SDSPAGE hình 3.5) Môi trường Băng Rf OD AmplOD IntOD Mức độ biểu (%) MT5 0,242 0,134 0,056 1,088 0,061 MT5 0,236 0,12 0,043 1,088 0,047 MT5 0,288 0,086 0,008 0,217 0,002 MT5 0,486 0,101 0,023 0,294 0,007 MT4 0,253 0,25 1,731 0,305 0,176 5,819 MT4 0,282 0,086 0,012 0,247 0,003 MT4 0,338 0,086 0,012 0,128 0,002 MT4 0,485 0,143 0,072 0,893 0,064 MT2 0,249 0,168 0,096 1,263 0,121 MT2 0,288 0,088 0,016 0,106 0,002 MT2 0,48 0,101 0,029 0,631 0,018 YP 0,249 0,165 0,099 1,38 0,137 YP 0,35 0,08 0,018 0,204 0,004 YP 0,478 0,12 0,064 1,095 0,070 17,217 12,956 33,312 [...]... vào vector biểu hiện PBV 220 tạo plasmid tái tổ hợp pASN biểu hiện trong E coli Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp cao hơn enzyme tự nhiên [32] Guo và cộng sự (2002) nghiên cứu tiềm năng chống ung thư của L- asparaginase tái tổ hợp và so sánh tác dụng chống ung thư của L- asparaginase tái Vũ Văn Vạn 12 Khóa Luận Tốt Nghiệp tổ hợp với enzyme tự nhiên trong in vitro và in vivo [33] Cùng năm 2002, gene L- asparaginase. .. chủ nhiệm đã biểu hiện thành công gene mã hóa L- asparagianse II từ Erw chrysanthermy trong E coli và trong P pastoris Bước đầu đã đánh giá được một số tính chất l hóa cũng như khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư của L- asparaginase tái tổ hợp biểu hiện trong E coli [50-53] Năm 2014, Nguyễn Tiến Cường và cs đã biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của rASN trong P pastoris, hoạt tính đạt 6,251... bằng L- asparaginase và kết hợp với hóa trị để kiểm tra tính hiệu quả và tác dụng phụ của L- asparaginase [47], Yong và cộng sự đã nghiên cứu l m sàng về L- asparaginase trong điều trị extranodal NK lymphoma/T-cell ,nghiên cứu tập trung vào dược tính của L- asparaginase, hiệu quả của một loạt các phác đồ Vũ Văn Vạn 14 Khóa Luận Tốt Nghiệp L- asparaginase chứa trong điều trị ENKTL và hướng nghiên cứu l m... trong liệu pháp kết hợp để điều trị bạch cầu cấp tính dòng lympho ở trẻ em [3] Khối l ợng phân tử của L- asparaginase từ vi khuẩn E coli l 133 - 144 kDa và tính chất của L- asparaginase từ E coli đã được nghiên cứu khá kỹ: được cấu tạo từ 4 hợp phần [4], hằng số Michaclis-Menten Km = 1,25 X 10-5 điểm đẳng điện ở pH 4,9 [5], L- asparaginase tinh sạch luôn có khoảng 2-4% hoạt tính glutaminase và 5% hoạt tính. .. môi trường thích hợp cho biểu hiện Lasparaginase, chủng P pastoris tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong 5 môi trường khác nhau: MT1, MT2, MT4, MT5 và YP (Bảng 2.2) Sau 72 giờ cảm ứng methanol 1% các mẫu nuôi biểu hiện được điện di để xác định mức độ biểu hiện Lasparaginase tái tổ hợp 2.2.7 Tinh sạch L- asparaginase tái tổ hợp Tinh sạch rASN bằng tủa muối amonium sulfate Nhiều loại muối đã được sử dụng... hoạt tính L- asparaginase Trong thực vật: L- asparaginase đã được sản xuất từ cây thuộc họ đậu Lupin araboreus và Lupin artgustiplius Hoạt tính của L- asparaginase cũng đã được tìm thấy ở trong đất, rễ của cây thông Pinus pinaster và Pinus radiata bởi Bell và Adams (2004) [20] Trong vi khuẩn: L- asparaginase từ vi khuẩn l vấn đề được quan tâm l n trong y tế Sản xuất L- asparaginase trong Pseudomonas flourescens... được tinh sạch bằng sắc ký ái l c gắn niken Protein tinh sạch cho thấy hoạt tính tối ưu ở 37oC và pH 6-7 Enzyme ổn định ở 50oC và duy trì 33% và 28% hoạt tính sau 45 và 60 phút Các thông số động học của enzyme: Km và Vmax tương ứng l 0,89 mM và 0,18 U/mg [43] Năm 2013, Jia đã nhân dòng, biểu hiện và mô tả đặc tính của các gene mã hóa L- asparaginase (asnZ) từ chủng vi khuẩn B subtilis B11-06 Enzyme tái. .. protein tái tổ hợp khỏi cột, ta thu protein ở các phân đoạn khác nhau Enzyme tinh sạch được thẩm tích loại imidazol để sử dụng cho các nghiên cứu sau 2.2.8 Điện di biến tính protein (SDS-PAGE) Khối l ợng phân tử tương đối của enzyme được tách chiết và độ tinh sạch của các dịch enzyme được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli [58] Nguyên l của phương pháp l các phân... dụng l m chủng biểu hiện Plasmid tái tổ hợp pPAsn mang gene asn mã hóa cho L- asparaginase được chèn vào vector biểu hiện pPICZαA do phòng Công nghệ sinh học enzyme cung cấp 2.1.2 Hóa chất Hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu có nguồn gốc từ các hãng uy tín, có độ tinh khiết và phù hợp với các thí nghiệm: Acrylamide, ammonium persulfate, bis-acrylamide, chloroform, isoamylalcohol, Dglucose,... sepharose CL-6B Enzyme cố định giữ l i hầu hết hoạt tính của nó (60%) và có tính ổn định cao ở 4oC [38] Năm 2008, Magdy và cộng sự đã nhân dòng được gene L- asparaginase II từ E coli W3110 bằng vector DNA Pgex-2T Enzyme này được biểu hiện mạnh trong E coli BL21 (DE3) và được tinh sạch qua cột DEAE-Sepharose, enzyme tinh sạch có trọng l ợng 40 kDa khi điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE [39] Năm 2009, L- asparaginase