Nghiên cứu quy trình tinh sạch hoạt chất ACARBOSE từ chủng ACTINOPLANES SP, KCTC 9161 và đánh giá độc tính cấp của ACARBOSE trên chuột thực nghiệm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA ACARBOSE TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM Giáo viên hướng dẫn:TS Đỗ Thị Tuyên Sinh viên thực hiện: Trần Ngọc Bích Hà Nội - 2015 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA ACARBOSE TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM Giáo viên hướng dẫn : TS Đỗ Thị Tuyên Sinh viên thực : Trần Ngọc Bích Lớp :11-01 YTMT Luận văn thực Phòng CNSH Enzyme, Viện CNSH Hà Nội - 2015 LỜI CÁM ƠN Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện tốt hóa chất, trang thiết bị thí nghiệm tận tình bảo hướng dẫn động viên em sửa luận để làm tốt khóa luận Và em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Lê Thanh Hoàng tập thể cán phòng CNSH Enzyme hướng dẫn giúp đỡ bảo ban em nhiều suốt trình làm luận văn Trong thời gian theo học Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, thầy cô tận tình dạy dỗ, truyền đạt cho em bạn sinh viên kiến thức quý báu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình, người bạn bè thân thiết bên em động viên em suốt thời gian học tập đặc biệt bố mẹ luôn bên cạnh hỗ trợ em lúc khó khăn Dù có nhiều cố gắng, song luận văn có thiếu sót Kính mong nhận chia sẻ đóng góp quý báu thầy cô giáo Em xin trân trọng cảm ơn gửi lời chúc sức khỏe công tác tốt đến quý thầy cô! Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Trần Ngọc Bích i MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC HÌNH VẼ vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh đái tháo đường 1.2 Giới thiệu chung acarbose 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cấu trúc 1.2.3 Nguồn gốc 1.2.4 Cơ chế hoạt động 1.3 Tác dụng acarbose 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp Acarbose 1.4.1 Đại cương chi Actinoplanes 1.4.2 Đặc điểm xạ khuẩnActinoplanes sp 10 1.5 Ứng dụng acarbose việc điều trị bệnh ĐTĐ type 12 1.6 Tình hình nghiên cứu acarbose Thế Giới 13 1.7 Tình hình nghiên cứu acarbose Việt Nam 16 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Chủng giống 18 2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 18 ii 2.2.1 Dụng cụ, thiết bị 18 2.3 Hóa chất 18 2.4 Môi trường nuôi cấy 19 2.5 Đệm dung dịch 19 2.6 Phương pháp 20 2.6.1 Nuôi cấy vi sinh vật 20 2.6.2 Tách chiết tinh sơ 20 2.6.3 Sắc ký mỏng TLC 21 2.6.4 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase 21 2.6.5 Tinh acarbose từ than hoạt tính 22 2.6.6 Kết tinh sản phẩm 22 2.6.7 Đánh giá độ bền sản phẩm sau điều kiện bảo quản 23 2.6.8 Đánh giá độc tính cấp hoạt chất acarbose chuột thực nghiệm 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Lên men sinh tổng hợp acarbose 24 3.2 Tinh qua cột than hoạt tính 25 3.2.1 Tinh qua cột than lần 25 3.2.2 Tinh qua cột than lần 26 3.3 Cô đặc, kết tinh sản phẩm đường acarbose 27 3.4 Đánh giá độ bền sản phẩm acarbose 29 3.5 Đánh giá độc tính cấp hoạt chất acarbose chuột nhắt trắng 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iii BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT A Actinoplanes ĐTĐ Đái tháo đường NTP N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine pNPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside Rf Độ di động TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) et al Cộng (cs) WHO World Health Organization (tổ chức y tế giới) RT Room temperature iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách thiết bị sử dụng thí nghiệm 18 Bảng 2.2 Danh sách hóa chất sử dụng thí nghiệm 19 Bảng 2.3 Các loại môi trường thí nghiệm 19 Bảng 2.4 Danh sách dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 19 Bảng 3.1 Độ bền hoạt tính cảm quan sản phẩm acarbose sau tháng 29 Bảng 3.2.Kết nghiên cứu độc tính cấp theo liều bột nguyên liệu acarbose 31 v DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1.Công thức cấu tạo acarbose Hình 1.2 Cấu trúc phân tử acarbose Hình 1.3 Xạ khuẩn chi Actinoplanessp Hình 1.4 Acarbose ức chế cạnh tranh trình thủy phân tetrasaccharide α-glucosidase ruột non Hình 1.5 Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường thạch 11 Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường lỏng 11 Hình 3.1 Hình thái chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC 9161 24 Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes KCTC 9161 25 Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 qua cột than hoạt tính 26 Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính 27 Hình 3.5 Quá trình cô đặc kết tính sản phẩm đường acarbose 27 Hình 3.6 TLC kiểm tra sản phẩm acarbose tinh 28 Hình 3.7 Quy trình lên men tinh acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 28 Hình 3.8 Sản phẩm acarbose sau tháng bảo quản 30 vi Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học MỞ ĐẦU Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh phổ biến Nó ảnh hưởng đến hàng triệu người nam nữ, lứa tuổi, tầng lớp xã hội Gánh nặng bệnh tật ĐTĐ tăng lên toàn cầu, đặc biệt nước phát triển, có Việt Nam – nơi trình đô thị hóa làm thay đổi tập quán ăn uống, giảm hoạt động thể lực tăng cân Theo thống kê Tổ chức y tế Thế giới (WHO), ngày có 3600 bệnh nhân ĐTĐ chẩn đoán Theo thông tin nhận (báo sức khỏe đời sống sau ngày 29/5/2015) giới có khoảng 382 triệu người bệnh ĐTĐ, số người mắc ĐTĐ type chiếm khoảng 90% Ước tính đến năm 2035, số tăng lên tới 592 triệu Tỷ lệ người mắc bệnh tăng nhanh nước phát triển 42% nước phát triển 170% Việt Nam nước có tốc độ tăng nhanh giới Trong 10 năm qua, số người mắc bệnh ĐTĐ tăng 211% lên đến 5,1 triệu người tử vong 2013 Và số 80 % người bị bệnh ĐTĐ sống nơi thu nhập thấp trung bình, 11% tổng chi tiêu y tế giới cho chi phí liên quan đến bệnh đái tháo đường ĐTĐ bệnh nguy hiểm biến chứng Tại Việt Namcó khoảng50%bệnh nhân mắc bệnh phát bệnh bệnh nặng với nhiều biến chứng tim mạch, thận, mắt, thần kinh ngoại…Triệu chứng ĐTĐ diễn âm thầm khiến người bệnh khó phát đến xảy biến chứng chữa trị gây khó khăn tốn cho người bệnh,gia đình xã hội Hiện nay,thuốc điều trị ĐTĐ đa dạng.Có hướng điều trị tăng khả sử dụng insulin củatế bào, giảm khả phân giải đường thành glucose ruột non Tuy nhiên, hướng điều trị trên,hướng điều trị giảm khả phân giải đường thành glucose giải pháp tốt nay.Chất ưu tiên acarbose - hợp chất hữu giả đường có nguồn gốc từvi sinh vật Đặc biệt xạ khuẩn Actinoplanes sp Xạ khuẩn sinh trưởng nhanh hiệu cao sử dụng nguyên liệu dễ kiếm nên giá thành thấp hơn.Xuất phát từlí trên,chúng thực đề tài: “Nghiên cứu quy trình tinh hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp đánh giá độc tính cấp acarbose Khóa luận tốt nghiệp – 20151 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học chuột thực nghiệm” khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệđiều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đường” TS.Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm vớimục tiêu: (1) xây dựng quy trình tinh hoạt chất acarbose (2) nghiên cứu độ bền sản phẩm (3) đánh giá độc tính cấp sản phẩm acarbose Khóa luận tốt nghiệp – 20152 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học 2.6.3 Sắc ký mỏng TLC Nguyên lý: Phương pháp sắc ký lớp mỏng kĩ thuật sắc ký dùng để tách chất hỗn hợp Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh lớp mỏng chất hấp phụ phủ mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích hòa tan dung môi thích hợp hút lên sắc kí Do chất có độ phân cực khác nên tách vị trí khác Tiến hành: Dịch lên men sau ly tâm loại cặn, tủa cồn thu dịch tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng để kiểm tra hoạt chất acarbose tạo thành Bản sắc ký silica gel Merck 60 F254, dày 0,25 mm sấy khô phút, µl dịch lên men loại bỏ protein chấm lên giếng, giếng cm Tra chuẩn µl sắc kí Hệ dung môi gồm 94% dung dịch A (1 methanol: etylacetat) 6% dung dịch B ( nước: acidformic) sử dụng để chạy sắc ký Khi vạch dung môi cách cạnh silica gel cm dừng trình chạy, sấy khô sắc ký sau màu xông acid (10% H2SO4 ethanol) màu 115°C phút 2.6.4 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase Nguyên lý: α-glucosidase enzyme cắt liên kết α-1,4 Cơ chất sử dụng làpnitrophenyl-α-D-glucopyranoside (Lee, et al., 1997), chất bị α-glucosidase thủy phân sinh p-nitrophenyl có màu vàng hấp thu bước sóng 415 nm αglucosidase bị ức chế phần lượng p-nitrophenyl sinh so với mặt acarbose Tiến hành (lặp lại lần): Sử dụng giếng 12x8 cm Hút vào giếng theo thứ tự lần lượt: 20 µl mẫu dịch loại cặn môi trường; 50 µl dung dịch chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside; 50 µl dung dịch α-glucosidase; 120 µl đệm potassium phosphate 0,5 M, pH 6,7, mẫu đối chứng thay dịch đệm potassium phosphate pH 6,7 Hỗn hợp ủ 37°C 45 phút, lắc 300 vòng/phút; sau dừng phản ứng 50 µl Na2CO3 Đo khả hấp thụ ánh sáng bước sóng 415 nm Khóa luận tốt nghiệp – 201521 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ ngh Sinh học Phần trăm ức chếế α-glucosidase tính công thức: % ức chế =( )x100 (%) Trong đó: - ĐC giá g trị OD mẫu đối chứng - TN giá trị tr OD mẫu thí nghiệm 2.6.5 Tinh ch acarbose từ t than hoạt tính Dựa khả ăng hấp h phụ than hoạt tính với chấtt màu hay lo loại đường ng khác Các chất ch hấp phụ yếu bị loại trước vớii nnồng độ dung môi thấp ngược lạii ch chất hấp phụ mạnh đẩyy sau nnồng độ dung môi cao ho tính đun cách thủy trư trước nhồi cột Tiến hành: 2,5 g than hoạt để đuổi hết bọtt khí có hạt h than, 50 ml dịch ch lên men ly tâm 4000 vòng/phút g/phút 20 phút để đ loại sinh khối tế bào, sau hấp phụ vào than ho hoạt tính điều kiện pH 2-3, 3, khuấy khu nhẹ để 4oC 12 H Hỗn hợp rửa với 200 ml nước cấtt đến lần Dịch than có chứa acarbose đư nhồi lên cột giải hấp phụ acarbose bbằng ethanol theo gradient nồng độ từ 0% đđến 20% rửa ng 20 ml ethanol 5%, 50 ml ethanol 10 %, 100 ml ethanol 15% 50 ml ethanol 20% Các phân đoạn thu TLC để kiểm tra sảnn ph phẩm tinh acarbose 2.6.6 Kết tinh sản phẩm ẩm Sản phẩm acarbose bose ddạng dịch kết tinh lầnn methanol thu acarbose tinh Cách tiến hành: Dịch D tinh đem em cô quay chân không lại chấtt keo màu suốt, su sau bổ sung methanol để kếtt tinh đường thành dạng kết tủa màu trắng ng Tách T riêng phần chất rắn để 4°C qua đêm sau tiếp tục bổ sung methanol lầnn 2, tiến ti hành hút chân không thu đượcc acarbose dạng kết tinh Sau lần tinh sạạch acarbose tiến hành TLC kiểm m tra xác đđịnh hoạt tính α-glucosidase sảnn phẩm ph Khóa luận tốt nghiệp – 201522 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học 2.6.7 Đánh giá độ bền sản phẩm sau điều kiện bảo quản Acarbose tinh thu có dạng bột màu trắng Sản phẩm đem bảo quản nhiệt độ khác 4°C nhiệt độ phòng Sau bảo quản tiến hành TLC đo hoạt tính kiểm tra mẫu Xem tính chất màu sắc cảm quan mẫu tinh sau thời gian bảo quản khác điều kiện bảo quản khác 2.6.8 Đánh giá độc tính cấp hoạt chất acarbose chuột thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu Chuột thực nghiệm chuột nhắt chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh trọng lượng trung bình 18 – 22g Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột nuôi điều kiện phòng thí nghiệm ngày trước tiến hành nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp xác định LD50 bột nguyên liệu acarbose chuột nhắt trắng theo đường uống [1], [2], [3], [4] Trước tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Chuột chia thành lô khác nhau, lô 10 Cho chuột uống bột nguyên liệu acarbose với liều tăng dần thể tích để xác định liều thấp gây chết 100% chuột liều cao không gây chết chuột (gây chết 0% chuột) Theo dõi tình trạng chung chuột, trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, co giật, kích động, tiết…) số lượng chuột chết vòng 72 sau uống thuốc Tất chuột chết mổ để đánh giá tổn thương đại thể Từ xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 thuốc thử Sau tiếp tục theo dõi tình trạng chuột đến hết ngày thứ sau uống thuốc Khóa luận tốt nghiệp – 201523 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lên men sinh tổng hợp acarbose Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 từ tủ lạnh sâu hoạt hóa đĩa thạch môi trường Slant, ủ 28°C, thời gian ngày Bào tử nuôi nhân giống bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường CPC, nuôi lắc 200 vòng/phút 28°C 96 Trên môi trường thạch Slant, khuẩn lạc có dạng tròn,bề mặt nhẵn,có tâm phồng lên,phát triển chậm Khuẩn lạc có màu cam đường kính 1-2 mm Sau 7-10 ngày bề mặt nhăn lan rộng Trên môi trường lỏng,chủng phát triển tốt,tạo thành hạt pellet tròn,không tan lắc lên,màu vàng cam,một số sắc tố cam tiết môi trường tạo môi trường có màu cam A B C Hình 3.1 Hình thái chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trường thạch (A), môi trường lỏng (B) kính hiển vi độ phóng đại 400 lần (C) Sau 48 nuôi cấy môi trường CPC lỏngtiếp chuyển sang bình tam giác 1000 ml chứa 250 ml môi trường nuôi cấy lên men theo môi trường MT1 tối ưu (Nguyễn Thị Nương, et al., 2013),nuôi lắc 200 vòng/phút 28°C, sau 168 thu dịch lên men Khóa luận tốt nghiệp – 201524 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ ngh Sinh học C LM Hình 3.2 Sắcc ký đồ TLC mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes KCTC 9161 9161 (LM: mẫu dịch lên men, C: chuẩn acarbose) Dịch ch lên men sau thu hhồi đem ly tâm lọc loại bỏ sinh khốii ttế bào, sau tinh sơ tiếnn hành chạy ch TLC để kiểm tra hoạt chấtt acarbose tạo thành Kết dịịch lên men có băng đậm vạch ch ngang vvới chuẩn acarbose (Hình 3.2), đồng ng thời th hoạt tính ức chế α-glucosidase đo đư 54%, dịch ch lên men từ t chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có sinh ttổng hợp acarbose Dịch đư bảo quản tiến hành bước tinh tiếpp theo 3.2 Tinh qua cột ột than hoạt ho tính 3.2.1 Tinh qua cột ột than lần l Dịch lên men chủng ng Actinoplanes sp KCTC-9161 hấp phhụ vào than hoạt tính, sau giải hấp phụ ụ ethanol theo gradient nồng độ từ đđến 20% để thu acarbose LC 10% C Khóa luận tốt nghiệp – 201525 10 11 12 13 14 15 16 17 18 C Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 qua cột than hoạt tính (LC: dịch lên men; 1-28: phân đoạn; C: chuẩn acarbose; 10%: phân đoạn giải hấp phụ cồn 10%) 19 20 21 22 23 24 25 C 26 27 28 Kết TLC (Hình 3.3) cho thấy đẩy ethanol 10% sắc ký đồ thu tiếp băng, vạch cuối ngang với chuẩn acarbose, điều chứng tỏ acarbose bắt đầu đẩy nhóm này, nhiên hàm lượng thấp vạch tương ứng mờ; tiếp tục rửa với ethanol 15% thu băng đậm băng cao chuẩn băng ngang chuẩn (làn đến 13), sau thu acarbose tinh có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ (làn 15-28), cuối rửa cột với ethanol 20% ta thu nhiều tạp chất có băng acarbose mờ nhiều băng thấp chuẩn acarbose 3.2.2 Tinh qua cột than lần Tập hợp phân đoạn có vạch thu qua cột than hoạt tính 1, cô đặc thể tích lần thiết bị cô quay chân không Dịch cô đặc tiếp tục tinh cột than hoạt tính 2, mẫu đưa lên cột rửa 50 ml ethanol 10%, sau rửa 50 ml ethanol 15% Kết thu phân đoạn ta thu tạp chất vạch cao chuẩn acarbose (làn đến 6); tiếp ta thu băng bao gồm vạch acarbose tạp chất (làn đến 9); cuối ta thu hoạt chất acarbose có băng ngang với chuẩn (làn 10 đến 22) (Hình 3.4) LC C Khóa luận tốt nghiệp – 201526 C 10 11 12 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính (LC: dịch lên cột; 1-22: phân đoạn; C: chuẩn acarbose) 13 14 15 16 17 C 18 19 20 21 22 Như qua lần sử dụng cột than hoạt tính, bước đầu tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 3.3 Cô đặc, kết tinh sản phẩm đường acarbose Tập hợp tất phân đoạn sau TLC kiểm tra có băng acarbose ngang chuẩn; đem hút điều kiện chân không, 60°C nước dung môi cạn hết; thu chất keo có màu suốt Sau bổ sung thêm 100 ml cồn 100% thu chất kết tủa màu keo trắng Tách riêng phần chất rắn để tủ lạnh 4°C qua đêm, sau tiếp tục rửa lại 50 ml cồn 100% hút chân không hết dung môi nước Kết thu acarbose dạng tinh thể màu trắng (5g) B C A Hình 3.5 Quá trình cô đặc kết tính sản phẩm đường acarbose (A): Kết tủa với cồn tuyệt đối lần 1; (B) (C): hút chân không kết tinh với cồn tuyệt đối lần Tiến hành pha loãng chất bột với nước TLC để kiểm tra thu băng ngang chuẩn acarbose, sản xuất kết tinh thành công sản phẩm acarbose tinh Khóa luận tốt nghiệp – 201527 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ ngh Sinh học C Hình 3.6 TLC kiểm tra sản phẩm acarbose tinh (1: sản ản phẩm phẩ acarbose tinh sạch; C: chuẩn acarbose Sigma) Từ kết đãã thu được, em bước đầu đưa quy trình ình lên men tinh hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC-9161: Hoạt hóa chủng Môi trường thạch Slant 28˚C/120 Nuôi nhân giống Môi trường CPC lỏng 28˚C/200 rpm, 48 Nuôi cấy lên men Môi trường MT1 28˚C/ ˚C/ 200 rpm, 168 Ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút Loại bỏ cặn sinh khốii ttế bào Dịch lên men Hấp phụ than hoạtt tính pH 3, khu khuấy rửa nhồi lên cộtt than ho hoạt tính Sắc ký cột than hoạt tính (giải hấp phụ ethanol từ 5% đến 20%) Tập hợp phân đoạnn có ho hoạt chất acarbose, cô đặcc 50% Sắc ký cột than hoạt tính (Giải hấp phụ ethanol từ 5% đến 15%) Tập hợp phân đoạnn TLC acarbose ngang chuẩn Dịch acarbose tinh Kết tinh tạo sản phẩm Sản phẩm Acarbose Hình 3.7 Quy trình lên men tinh s acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 KCTC Khóa luận tốt nghiệp – 201528 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học 3.4 Đánh giá độ bền sản phẩm acarbose Sản phẩm acarbose dạng bột mịn màu trắng chia ống bảo quản hai điều kiện nhiệt độ là: 4°C nhiệt độ phòng Hàng tháng mẫu lấy kiểm tra màu sắc cảm quan, đo hoạt tính ức chế α-glucosidase Bảng 3.1 Độ bền hoạt tính cảm quan sản phẩm acarbose sau tháng Thời gian Hoạt tính ức chế Độ bền (%) Chất lượng cảm quan 4°C RT 4°C RT 69,02 ± 0,80 69,02 ± 0,80 100 100 Bột khô, màu Bột khô, màu trắng ngà trắng ngà Sau tháng 68,75 ±0,80 67,49 ± 0,57 99,61 97,78 Bột khô, màu Bột khô, màu trắng ngà trắng ngà Sau tháng 66,89 ± 0,42 64,48 ± 0,39 96,91 93,41 Bột khô, màu Bột vón cục trắng ngà nhỏ, trắng ngà Sau tháng 65,14 ± 0,78 63,58 ± 0,51 94,37 92,08 Bột khô, màu Bột vón cục trắng ngà lớn, trắng ngà Sau tháng 65,04 ± 0,85 63,39 ± 01,03 94,23 91,83 Bột khô, màu Bột ẩm, trắng ngà màu ngà sẫm Sau tháng 65,08 ± 0,49 62,62 ± 01,42 94,28 90,07 Bột khô, màu Bột ẩm, trắng ngà màu ngà sẫm Sau tháng 63,53 ± 1,19 62,25 ± 2,01 92,04 90,19 Bột khô, màu Bột ẩm, trắng ngà màu ngà sẫm Ban đầu 4°C RT *RT: Nhiệt độ phòng Kết độ bền sản phẩm acarbose bảo quản nhiệt độ 4°C nhiệt độ phòng (RT) thể bảng 3.1 Với điều kiện lạnh 4°C hoạt tính ức chế α-glucosidase sản phẩm acarbose bền sau tháng đầu tiên, hoạt tính tương đối giảm lần 99,61% 96,91% Sau hoạt tính giảm nhẹ sau tháng tiếp đến tháng thứ sản phẩm vẫng giữ hoạt tính tương đối bền 92,04% Còn điều kiện nhiệt độ phòng, hoạt tính ức chế sản phẩm có giảm mạnh so với điều kiện lạnh 4°C chút, hoạt tính ức chế đến tháng thứ bền, đạt 90,19% Như vậy, hoạt tính ức chế sản phẩm acarbose bền bảo quản hai điều kiện nhiệt độ, màu sắc cảm quan điều kiện nhiệt độ phòng chế phẩm bị vón cục nhẹ sau 2,3 tháng đầu tiên, đến tháng thứ có dấu hiệu bị ẩm sản phẩm chuyển sang màu ngà vàng (Hình 3.8) Mặc dù hoạt tính ức chế tương đối bền so với việc bảo quản lạnh, xong sản phẩm bảo quản điều kiện thường lại nhanh chóng thay đổi cảm quan chất lượng màu sắc, Khóa luận tốt nghiệp – 201529 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học điều lí giải sản phẩm dễ bị hút ẩm ảnh hưởng việc lấy mẫu kiểm tra hàng tháng điều kiện ẩm môi trường Vì vậy, muốn bảo quản sản phẩm nhiệt độ thường cần hướng tới biện pháp chống ẩm cho sản phẩm Hình 3.8 Sản phẩm acarbose sau tháng bảo quản 4°C: bảo quản tủ lạnh RT: bảo quản nhiệt độ phòng 3.5 Đánh giá độc tính cấp hoạt chất acarbose chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng uống bột nguyên liệu acarbose từ liều thấp đến liều cao lần Lô chuột uống đến liều 15,625 g/kg thể chuột tương đương 0,25 ml/10 g thể trọng dung dịch đậm đặc Theo dõi chuột chết, không xuất triệu chứng bất thường 72 sau uống thuốc suốt ngày Liều 15,625 g/kg liều tối đa dùng Khóa luận tốt nghiệp – 201530 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học đường uống để đánh giá độc tính cấp bột nguyên liệu acarbose (nồng độ đặc nhất, thể tích uống tối đa cho lần uống nhất) Bảng 3.2.Kết nghiên cứu độc tính cấp theo liều bột nguyên liệu acarbose Lô chuột n Liều (g/kg thể trọng) Tỷ lệ chết (%) Dấu hiệu bất thường khác Lô 10 3,1250 Không Lô 10 4,6875 Không Lô 10 6,250 Không Lô 10 7,8125 Không Lô 10 9,3950 Không Lô 10 10,9375 Không Lô 10 12,5000 Không Lô 10 14,0625 Không Lô 10 15,6250 Không Bột nguyên liệu acarbose liều 15,625 g/kg, cao gấp 217 lần liều dùng cho người quy đổi theo hệ số 12 biểu độc tính cấp.Chưa xác định LD50 chuột nhắt trắng bột nguyên liệu acarbose đường uống Khóa luận tốt nghiệp – 201531 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã bước đầu xây dựng quy trình tinh hoạt chất acarbose từ chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC-9161 sử dụng cột than hoạt tính Dịch tinh sau bổ sung methanol kết tinh điều kiện 60°C, hút chân không thu g sản phẩm dạng bột Sản phẩm acarbose tương đối bền bảo quản hai điều kiện nhiệt độ 4°C nhiệt độ phòng sau tháng, hoạt tính tương đối lại 92,04% 90,19% Tuy nhiên sản phẩm bị ẩm chuyển màu bảo quản điều kiện nhiệt độ thường Với liều lượng acarbose 15,625 g/kg thể trọng, sau ngày thử nhiệm chuột nhắt trắng khỏe mạnh, không gây chết, chứng tỏ chế phẩm acarbose an toàn Kiến nghị Tiếp tục hoàn thiện quy trình tách chiết tinh hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC-9161 Lên men lượng lớn sản xuất chế phẩm acarbose thử nghiệm sản phẩm mô hình chuột đái tháo đường type Khóa luận tốt nghiệp – 201532 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 Choi BT, Shin CS (2003) Reduced formation of byproduct component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp CKD485-16 Biotechnol Prog 19(6):1677-1682 Couch JN (1950) "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales" Journal of the Elisha Michell Scientific Society Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011) Sàng lọc tuyển chọn số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp acarbose, chất ức chế alpha-glucosidase Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4A):1-5 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975) "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors" United States Patent:US 3876766 Goeke K, Drepper A, Pape H (1996) Formation of acarbose phosphate by a cell-free extract from the acarbose producer Actinoplanes sp J.Antibiot (Tokyo) 49:661-663 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013) "Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 biến thể" Tạp chí Y học Việt Nam:7175 Hanefeld M, Schaper F, Koehler C (2008) Effect of Acarbose on Vascular Disease in Patients with Abnormal Glucose Tolerance Cardiovasc Drugs Ther 22:225-231 Hayashim T et al (2008) The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type diabetes Clin Chim Acta 390(1-2):110-114 Hemker M et al (2001) Identification, cloning, expression, and characterization of the extracellular acarbosemodifying glycosyltransferase, AcbD, from Actinoplanes sp strain SE50 J.Bacteriol 183:4484-4492 Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003) "Process for preparing acarbose with high purity" United States Patent:US 6649755B6649751 Keri V, Deak L (2002) "Method for purification of acarbose" United States Patent:US 20020183262A20020183261 Klein A et al (2013) "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp SE50/110 as plasmid for genetic transformation of related Actinobacteria" International Publication Number:WO 2013/083566 A083561 Lange PM, Rauenbusch E (1987) "Polymers for the purification of acarbose" United States Patent:US 4666776 Lechevalier H, Lechevalier M (1970) "In the Actinomycetales" Veb G Fisher:393-405 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997) Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit J Antibiot (Tokyo) 50 Khóa luận tốt nghiệp – 201533 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học 16 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007) "Purification process for manufacturing a high pure acarbose" United States Patent:US 7253278 B7253272 17 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005) "Purification process for manufacturing a high pure acarbose" United States Patent:US 20050118686A20050118681 18 Mori Y, Shiozaki M, Matsuura K, Tanaka T, Yokoyama J, Utsunomiya K (2011) Evaluation of efficacy of acarbose on glucose fluctuation and postprandial glucose using continuous glucose monitoring in type diabetes mellitus Diabetes Technol Ther 13(4) 19 Nguyễn Lân Dũng (2006) "Phân loại xạ khuẩn" Thư viện Học liệu mở Việt Nam:1-11 20 Nguyễn Thị Nương, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Hà Thị Tâm Tiến, Quyền Đình Thi (2013) Nghiên cứu thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose Actinoplanes sp KCTC-9161 Hội nghị CNSH Toàn quốc:403406 21 Piñol C, Roze S, Valentine W, Evers T (2007) Cost-effectiveness of the addition of acarbose to the treatment of patients with type-2 diabetes in Spain Gac Sanit., discussion 105 Review Spanish 21(2):97-104 22 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012) "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779" Tạp chí Hóa học 50:113-116 23 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011) Tuyển chọn chủng Bacillus spp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase dùng để điều trị bệnh tiểu đường type Tạp chí Công nghệ sinh học 9:729-735 24 Rauenbush E (1990) "Highly pure acarbose" United States Patent:US 4904769 25 Rodriguez JF, Antonio DL, Manuel C, Fatima C (2008) "Application of ion exchange to purify acarbose from fermemtation broths" Biochemical Engineering 40:130-137 26 Schmidet DD et al (1997) "Alpha-glucosidase inhibitors new complex oligosaccharides of microbial origin" Die Naturwissenschaften 64:535-536 27 Schwientek P (2012) "Genomics and Transcriptomics of the inductrial Acarbose producer Actinoplanes sp SE50/110" Bielefeld University, Germany:155 pages 28 Wang Y, Yu L, Zheng YG, Wang YH, Shen YC (2013) "Acarbose isolation with gel type strong acid cation exchange resin: Equilibrium, Kinetic and Thermodynamic studies" Chin.J.Chem.Eng 21:1106-1113 29 Wang YJ, Dong F, Yu L, Zheng YG (2012a) "Study on acarbose adsorption performance of cation exchanger SAC 001x7" Chin.J.Chem.Eng:493-498 30 Wang YJ, Liu LL, Wang YS, Xue YP, Zheng YG, Shen YC (2012b) Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production Bioresour Technol 103(1):337342 Khóa luận tốt nghiệp – 201534 Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ Sinh học 31 Wehmeier UF, Piepersberg W (2004) Biotechnology and molecular biology of the alfa-glucosidase inhibitor acarbose Appl Microbiol.Biotechnol 63:613625 32 Wei SJ, Cheng X, Huang L, Li KT (2010) Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp A56 using the response surface methodology African Journal of Biotechnology 9(13):1949-1954 33 Whistler RL, Durso DF (1949) "Chromatographic Separation of Sugar on Charcoal" Purdue University 72:667-679 34 Xue YP, Qin JW, Wang YJ, Wang YS, Zheng YG (2013) "Enhanced production of acarbose and concurrently reduced formation of impurity C by addition of validaminein fermentation of Actinoplanes utahensis ZJB-08196" BioMed Research International:9 pages Khóa luận tốt nghiệp – 201535 [...]... 2014, Phạm Quang Trung và cs đã tiến hành quá trình tinh sạch hoạt chất acarbose và đánh giá khả năng α-glucosidase từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 (Cung cấp bởi Bộ sưu tập chủng giống của Hàn Quốc) trong môi trường Wang và Basal Sau 168 giờ lên men hoạt chất acarbose được sinh tổng hợp từ dịch lên mencủa chủng Actinoplanessp KCTC 9161 và được tinh sạch sơ bộ bằng cột thanhoạt tính và cột sắc kí trao... và điều kiện bảo quản khác nhau 2.6.8 Đánh giá độc tính cấp của hoạt chất acarbose trên chuột thực nghiệm Đối tượng nghiên cứu Chuột thực nghiệm là chuột nhắt chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh trọng lượng trung bình 18 – 22g do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm 7 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu độc tính cấp. .. ra song song cùng với quá trình tối ưu môi trường sinh tổng hợp acarbose từ chủng xạ khuẩn chủ yếu Actinoplanes sp Hà Thị Tâm Tiến và cs (2013) đã khảo sát các phương pháp tinh sạch acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 và kết quả cho thấy acarbose tinh sạch qua cột than hoạt tính rồi cho qua cột trao đổi ion và cuối cùng là HPLC thu được hoạt chất acarbose có độ tinh sạch đạt 98% (Hà Thị Tâm... ch lên men từ t chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có sinh ttổng hợp ra acarbose Dịch này sẽ được đư bảo quản và tiến hành bước tinh sạch tiếpp theo 3.2 Tinh sạch qua cột ột than hoạt ho tính 3.2.1 Tinh sạch qua cột ột than lần l 1 Dịch lên men chủng ng Actinoplanes sp KCTC- 9161 được hấp phhụ vào than hoạt tính, sau đó giải hấp phụ ụ bằng ethanol theo gradient nồng độ từ 0 đđến 20% để thu acarbose 1 2... phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2 (LC: dịch lên cột; 1-22: các phân đoạn; C: chuẩn acarbose) 13 14 15 16 17 C 18 19 20 21 22 Như vậy qua 2 lần sử dụng cột than hoạt tính, đã bước đầu tinh sạch được hoạt chất acarbose từ dịch lên men của chủng Actinoplanes sp KCTC- 9161 3.3 Cô đặc, kết tinh sản phẩm đường acarbose Tập hợp tất cả các phân đoạn sau khi TLC kiểm tra có 1 băng acarbose. .. Trần Ngọc Bích Khoa Công nghệ ngh Sinh học 1 C Hình 3.6 TLC kiểm tra sản phẩm acarbose tinh sạch (1: sản ản phẩm phẩ acarbose tinh sạch; C: chuẩn acarbose Sigma) Từ các kết quả đãã thu được, em đã bước đầu đưa ra quy trình ình lên men và tinh sạch hoạt chất acarbose từ ừ chủng Actinoplanes sp KCTC- 9161: Hoạt hóa chủng Môi trường thạch Slant 28˚C/120 giờ Nuôi nhân giống Môi trường CPC lỏng 28˚C/200... chi Actinoplanes sp thì ngoài chứa thành phần acarbose ra nó còn chứa các loại đường khác và tạp chất nên khi ta loại được hết các loại đường và tạp chất trong dịch lên men sẽ thu được acarbose có độ tinh sạch cao Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về phương pháp tinh sạch acarbose hiện nay.Vào năm 1949,Whistler và Durso đã dùng than hoạt tính để tách glucose,maltose,rafinose ra khỏi hỗn hợp.Than hoạt. .. α-glucosidase được tính bởi công thức: % ức chế =( )x100 (%) Trong đó: - ĐC là giá g trị OD của mẫu đối chứng - TN là giá trị tr OD của mẫu thí nghiệm 2.6.5 Tinh sạch ch acarbose từ t than hoạt tính Dựa trên khả năng ăng hấp h phụ của than hoạt tính với các chấtt màu hay các lo loại đường ng khác nhau Các chất ch hấp phụ yếu hơn sẽ bị loại ra trước vớii nnồng độ dung môi thấp và ngược lạii các ch chất hấp phụ... bỏ cặn và sinh khốii ttế bào Dịch lên men Hấp phụ than hoạtt tính pH 3, khu khuấy rửa và nhồi lên cộtt than ho hoạt tính Sắc ký cột than hoạt tính 1 (giải hấp phụ bằng ethanol từ 5% đến 20%) Tập hợp các phân đoạnn có ho hoạt chất acarbose, cô đặcc 50% Sắc ký cột than hoạt tính 2 (Giải hấp phụ bằng ethanol từ 5% đến 15%) Tập hợp các phân đoạnn TLC acarbose ngang chuẩn Dịch acarbose tinh sạch Kết tinh. .. bây giờ để tạo ra sản phẩm acarbose tốt nhất 1.7 Tình hình nghiên cứu acarbose ở Việt Nam Như đã đề cập ở trên, các sản phẩm thảo dược phụ thuộc nhiều vào thời vụ nên có nhiều đề tài tập trung hướng nghiên cứu hoạt chất từ VSV.Nhưng những nghiên cứu về acarbose tại Việt Nam cũng khá ít Năm 2011,Đỗ Thị Tuyên và cs đã nghiên cứu sàng lọc 1 số chủng Actinoplnes sp được cung cấp bởi bảo tàng giống chuẩn