Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes SP KCTC 9161

MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH VẼ viii BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Khái quát về acarbose 3 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose 3 1.3. Vai trò của acarbose 5 1.3.1. Vai trò của acarbose đối với bệnh đái tháo đƣờng 5 1.3.2. Nghiên cứu về các tác dụng khác của acarbose 8 1.4. Vai trò Actinoplanes trong sinh tổng hợp acarbose 9 1.4.1. Đại cƣơng về Actinoplanes 9 1.4.2. Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 10 1.4.3. Ứng dụng Actinoplanes trong sản xuất acarbose 11 1.5. Nghiên cứu hoạt chất acarbose trên thế giới 12 1.5.1. Nghiên cứu về sản xuất acarbose 12 1.5.2. Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật 16 1.5.3. Các phƣơng pháp tinh sạch và thu nhận acarbose 17 1.5.4. Nghiên cứu sản xuất acarbose trong nƣớc 20 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1. Vật liệu và hóa chất 23 2.1.1. Chủng giống 23 2.1.2. Hóa chất 23 2.1.3. Môi trƣờng 23 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 25 2.2.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 25 2.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy 26 2.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy 26 2.2.5. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy 26 2.3. Gây đột biến bằng NTG 26 2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC 27 2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose 27 2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose 28 2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ 28 2.6.2. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột 29 2.7. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 31 2.8. Sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 2.9. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hƣởng từ hạt nhân 31 2.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 33 3.2. Tối ƣu các thành phần môi trƣờng và các điều kiện nuôi cấy 35 3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian 35 3.2.2. Ảnh hƣởng của nguồn maltose 37 3.2.3. Ảnh hƣởng của nguồn glucose 38 3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn bột ngô 40 3.2.5. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng 41 3.2.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy 42 3.2.7. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc 43 3.2.8. Môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tối ƣu 44 3.2.9. Xác định hàm lƣợng acarbose bằng HPLC 45 3.3. Gây đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 46 3.4. Tinh sạch acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase 48 3.4.1. Chọn lựa các phƣơng pháp tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 48 3.4.1.1. Tinh sạch bằng sắc ký hấp thụ silica gel 48 3.4.1.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sephadex G100 49 3.4.1.3. Tinh sạch bằng cột than hoạt tính 1 50 3.4.2. Chọn lựa các phƣơng pháp tinh sạch acarbose từ dịch qua cột than 1 51 3.4.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 51 3.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 51 3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose 52 3.4.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase 55 3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose 56 3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận 60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 68 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 23 Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng 24 Bảng 2.3. Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu 25 Bảng 3.1. Khối lƣợng chế phẩm qua các bƣớc tinh sạch acarbose 55 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của acarbose 3 Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của acarbose trong ruột non 4 Hình 1.3. Khuẩn lạc chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 11 Hình 3.1. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong các môi trƣờng lên men 33 Hình 3.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase trong các môi trƣờng lên men 34 Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian 35 Hình 3.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian. 36 Hình 3.5. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng độ maltose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 37 Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng độ glucose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 39 Hình 3.7. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng độ bột ngô đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 40 Hình 3.8. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 41 Hình 3.9. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 43 Hình 3.10. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 43 Hình 3.11. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong môi trƣờng trƣớc và sau tối ƣu 44 Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 916 trong môi trƣờng tối ƣu 45 Hình 3.13. Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các dòng đột biến của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 47 Hình 3.14. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các dòng đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 47 Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột biến từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 48 Hình 3.16. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột silica gel 49 Hình 3.17. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột sephadex G100 49 Hình 3.18. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột than hoạt tính 1 50 Hình 3.19. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400. 51 Hình 3.20. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 52 Hình 3.21. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2 52 Hình 3.22. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của chuẩn acarbose 53 Hình 3.23. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. 54 Hình 3.24. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 54 Hình 3.25. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch 55 Hình 3.26. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 56 Hình 3.27. Phổ proton 1 H-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. 57 Hình 3.28. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. 58 Hình 3.29. Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 59 BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT 13 C-NMR Carbon-13, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13) 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) cs Cộng sự ĐTĐ Đái tháo đƣờng NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) NTG N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine pNPG p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside R f Độ di động TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 1 MỞ ĐẦU Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) hiện nay là một vấn đề sức khỏe mang tính chất toàn cầu, ảnh hƣởng đến nhiều ngƣời, nhất là trong độ tuổi lao động trên toàn thế giới. Theo thông báo của tổ chức y tế thế giới (WHO) ƣớc tính mỗi năm trên thế giới có 3,4 triệu ngƣời chết do đái tháo đƣờng, trong đó 80% các ca tử vong xảy ra ở những nƣớc đang phát triển. Hiện nay trên thế giới có 347 triệu ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng, có 90% số ca mắc đái tháo đƣờng type 2. Chi phí về y tế dành cho căn bệnh này đã tăng lên 465 tỷ USD (Dehghan, Gagari, 2013). Ở Việt Nam, theo tổng hội Y học Việt Nam, năm 2012 có 5,7% dân số mắc ĐTĐ và 12,8% số ngƣời mắc rối loạn dung nạp đƣờng. Với tỷ lệ bệnh nhân tăng 8- 10% mỗi năm, Việt Nam trở thành nƣớc có tỷ lệ gia tăng bệnh ĐTĐ nhanh nhất thế giới. Chi phí điều trị ĐTĐ chiếm 6% ngân sách của ngành Y tế và hầu hết đều tập trung cho biến chứng của ĐTĐ nhƣ: bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, mù lòa, hoại tử chi, suy thận gây ra (Công Sơn, Thế Ân, 2013). Các thuốc điều trị ĐTĐ type 2 chủ yếu tập trung vào nhóm chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase nhƣ: acarbose, miglitol, voglibose, 1-deoxynojimycine. Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đƣờng pseudo-oligosaccharide có tác dụng kìm hãm hoạt động của α-glucosidase, là enzyme chuyển hóa các oligosaccharide thành glucose và monosaccharide trong ruột non, với ƣu điểm làm giảm đƣờng huyết sau ăn, không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ HbA1c, triglyceride và giảm các biến chứng do tiểu đƣờng. Do đó, acarbose đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2, tạo cho bệnh nhân khả năng kiểm soát hàm lƣợng đƣờng trong máu tốt hơn sau khi ăn thức ăn chứa tinh bột. Acarbose đƣợc sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật khác nhau nhƣ Streptomyces, đặc biệt là chủng Actinoplanes. Hiện nay, ở Việt Nam nhu cầu sử dụng dƣợc phẩm để sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc ngoài với giá thành cao, hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc nhƣ quả mƣớp đắng xanh có chứa hoạt chất charantin, Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 2 glycosid steroid có tác dụng hạ đƣờng máu, làm tăng khả năng dung nạp glucose của ngƣời bệnh; dây thìa canh chứa gymnemic acid làm tăng tiết insulin của tuyến tụy; bạch truật có hoạt chất achactan A, B và C có tác dụng hạ đƣờng máu; cam thảo đất có hoạt chất amellin có thể làm giảm đƣờng máu và các triệu chứng của bệnh ĐTĐ type 2 Tuy nhiên sử dụng nguồn nguyên liệu từ thảo dƣợc phụ thuộc nhiều vào thời vụ, với hàm lƣợng hoạt chất thấp, số nguyên liệu sử dụng phải rất nhiều, một số thảo dƣợc quý hiếm ngày càng khan hiếm. Do đó, việc sản xuất các hoạt chất bằng sử dụng nguồn vi sinh vật đang là một hƣớng nghiên cứu mới và cấp thiết. Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn Actinoplanes sẽ mang lại hiệu quả kinh tế, sản xuất nhanh, chủ động, giá thành thấp do sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161” trong khuân khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đƣờng” do TS. Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm với các mục tiêu: (1) Tối ƣu đƣợc môi trƣờng lên men thu nhận hoạt chất acarbose từ Actinoplanes sp. KCTC 9161 đạt năng xuất cao; (2) Nâng cao khả năng sản xuất hoạt chất acarbose bằng phƣơng pháp gây đột biến; (3) Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch acarbose. [...]... vi sinh vật Để nâng cao tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật, nhiều phƣơng pháp gây đột biến đã đƣợc sử dụng nhằm tác động vào vật chất di truyền làm thay đổi các đặc tính sinh học của vi sinh vật, đặc biệt là gây đột biến trên Actinoplanes để nâng cao khả năng sinh tổng hợp acarbose Lee và cs (2008) đã nghiên cứu 3 cụm gene Tre X-Y-Z, TpS1 và TreS sinh tổng hợp trehalose từ chủng. .. Vi sinh vật Việt Nam (VTCC), nhằm lựa chọn đƣợc chủng cho khả năng sinh tổng hợp acarbose Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 20 Đại học Khoa học tự nhiên Hà Thị Tâm Tiến cao Kết quả từ 12 chủng Actinoplanes sp nghiên cứu đã lựa chọn đƣợc 6 chủng sinh tổng hợp acarbose cao dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế αglucosidase Môi trƣờng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. .. nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 và các biến thể Kết quả cho thấy, nhiệt độ bảo quản ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và hiệu suất sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 và 2 dòng đột biến A242, A313 Các chủng dòng Actinoplanes sp sinh trƣởng tốt nhất và ổn định nhất khi bảo quản ở -80C Sinh tổng hợp acarbose đều ổn định sau... 1 K2HPO4 và 2,5 CaCO3, pH 7,2 Chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp acarbose cao nhất sau 144 giờ nuôi cấy, ở 28C Chủng Actinoplanes sp VTCC-A1094 và VTCC-A1779 có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất lần lƣợt là 92% và 81% (Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011) Quyền Đình Thi và cs (2011) đã tiến hành nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ các dòng đột biến Actinoplanes sp VTCC-A1779 Kết quả cho thấy, từ 60 dòng... thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp KCTC 9161, nguồn cacbon và nitơ sẽ đƣợc bổ sung vào môi trƣờng theo nồng độ khác nhau để chọn đƣợc nồng độ tối ƣu 2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 đƣợc nuôi trong môi trƣờng lên men thích hợp đã chọn đƣợc ở mục 2.2.2 trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút để khảo sát khả năng sinh tổng hợp acarbose. .. đều ổn định sau khi bảo quản ở 4C, -20C, với hoạt tính ức chế α-glucosidase ổn định so với chủng gốc (Hà Thị Tâm Tiến, et al., 2013) Nguyễn Thị Nƣơng và cs (2013) khi tối ƣu thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 cho thấy: Môi trƣờng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 bao gồm (g/l): 30 maltose, 30 glucose,... 28oC Năng suất sinh tổng hợp acarbose đạt 1043 mg/l tăng 24,61% so với trƣớc khi tối ƣu (Wei, et al., 2010) Wang và cs (2011) đã tối ƣu môi trƣờng sinh tổng hợp acarbose của chủng A utahensis ZJB-08196 (là một dòng đột biến từ chủng Actinoplanes sp ZJB005) Kết quả tối ƣu cho thấy, maltose, glycerol và monosodium glutamate trong môi trƣờng làm tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose Bột ngô có vai trò cao. .. dòng đột biến có tốc độ sinh trƣởng và sinh tổng hợp lutein cao Kết quả thu đƣợc dòng đột biến MR-16 sinh tổng hợp lutein đạt 42 mg/l cao gấp 2 lần so với chủng ban đầu (Cordero, et al., 2011) Beenken và cs (2012) sử dụng phƣơng pháp gây đột biến bằng sinh học phân tử để nâng cao khả năng sinh tổng hợp alginate oligosaccharide (AO) từ glucose trong điều kiện nitrogen hạn chế trên chủng Pseudomonas mendocina... năng suất sinh tổng hợp acarbose, nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu bổ sung thêm các chất cảm ứng để tăng khả năng sinh tổng hợp sinh acarbose trong quá trình lên men Sun và cs (2012) công bố mô hình lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng A utahensis ZJB-08196 với năng suất 6113 mg/l acarbose thông qua quá trình tối ƣu nguồn glucose, maltose có bổ sung thêm S-adenosylmethionine (SAM) SAM có chức năng nhƣ... men cho chủng Actinoplanes sp A56 sinh tổng hợp acarbose Thực hiện phƣơng pháp tối ƣu toán học để nghiên cứu ảnh hƣởng của glucose, maltose, dịch chiết ngô, bột đậu tƣơng và monosodium glutamate đến sinh tổng hợp acarbose Kết quả cho thấy maltose và dịch chiết ngô ảnh hƣởng đến năng suất sinh tổng hợp acarbose Hàm lƣợng acarbose tăng từ 837 đến 1043 mg/l khi tăng từ 30 g/l lên 61,25 g/l maltose và 10 . liệu dễ kiếm. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 trong khuân khổ. acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 54 Hình 3.25. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh. acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. 57 Hình 3.28. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. 58 Hình 3.29. Qui trình tinh