Sau khi tìm đƣợc môi trƣờng và các điều kiện nuôi cấy tối ƣu sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161, chúng tôi tiến hành tách chiết và
tinh sạch acarbose từ dịch lên men nhằm thu đƣợc hoạt chất acarbose có độ tinh sạch cao.
3.4.1. Chọn lựa các phương pháp tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
3.4.1.1. Tinh sạch bằng sắc ký hấp thụ silica gel
Dịch lên men chứa acarbose đƣợc đƣa lên cột silica gel và rửa giải bằng dung môi ethanol thu 20 phân đoạn mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả thu đƣợc 6 phân đoạn có chứa acarbose (từ phân đoạn 4 đến 9). Tuy nhiên các phân đoạn này vẫn lẫn nhiều tạp chất trong dịch lên men (Hình 3.16). Nhƣ vậy, sử dụng cột silica gel vẫn chƣa thu đƣợc hoạt chất acarbose tinh sạch.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 49
LC 4 5 6 7 C 8 9 11
Hình 3.16. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột silica gel
LC: dịch lên men; 4-11: các phân đoạn; C: chuẩn acarbose
3.4.1.2. Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel sephadex G100
Dịch lên men chứa acarbose đƣợc đƣa lên cột sephadex G100. Cột đƣợc đẩy bằng đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5, thu 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Kết quả thu đƣợc 12 phân đoạn có chứa acarbose, từ phân đoạn 9 đến phân đoạn 20. Tuy nhiên, ngoài băng acarbose các phân đoạn này còn có rất nhiều băng khác giống nhƣ dịch lên men. Các phân đoạn còn lại không xuất hiện băng hoặc có băng mờ cao hơn chuẩn (Hình 3.17). Nhƣ vậy, Sử dụng cột sephadex G100 vẫn chƣa thu đƣợc acarbose tinh sạch.
LC 5 7 9 11 C 13 15 17 19
Hình 3.17. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột sephadex G100 LC: dịch lên men; 5-19: các phân đoạn; C: chuẩn acarbose
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 50
3.4.1.3. Tinh sạch bằng cột than hoạt tính 1
Dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc hấp thụ vào than hoạt
tính, sau đó giải hấp thụ bằng ethanol theo gradien nồng độ từ 0 đến 20% để thu acarbose.
C 1 2 3 4 C 5 6 7 8 9 10 11 LC 12 13 14 15 16 C 17 18 19 20
LC 21 22 23 24 C 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 C 35 36 37 38 39
Hình 3.18. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 khi qua cột than hoạt tính 1 LC: dịch lên men; 1-39: các phân đoạn; C: chuẩn acarbose
Kết quả TLC (Hình 3.18) cho thấy dịch qua cột thu đƣợc 6 nhóm: nhóm 1 (600 ml) hỗn hợp dịch than đƣợc rửa bằng nƣớc cất chứa glucose và maltose; nhóm 2 (20 ml) cột đƣợc rửa bằng ethanol 5% có maltose và một chất khác có băng thấp hơn băng của maltose trên sắc ký đồ TLC; nhóm 3 (48 ml) cột đƣợc rửa bằng ethanol 10-15% thu đƣợc 3 băng, acarbose đã đƣợc đẩy ra trong nhóm này, tuy nhiên băng acarbose rất mờ chứng tỏ hàm lƣợng acarbose rất thấp; nhóm 4 (46 ml) cột đƣợc rửa bằng ethanol 15% thu đƣợc 2 băng rất đậm trong đó có một băng cao hơn chuẩn acarbose và một bằng ngang chuẩn acarbose, acarbose đã đƣợc đẩy ra một phần trong nhóm này; nhóm 5 (40 ml) cột đƣợc rửa bằng ethanol 15% đã thu đƣợc acarbose tinh sạch có một băng đậm ngang chuẩn duy nhất trên sắc ký đồ TLC; nhóm 6 (26 ml) cột đƣợc rửa bằng ethanol 15-20% chứa nhiều tạp chất có băng
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 51
acarbose mờ và nhiều băng thấp hơn chuẩn acarbose. Nhƣ vậy từ 50 ml dịch lên men khi cho qua cột than hoạt tính đã thu đƣợc 86 ml dịch chứa acarbose.
3.4.2. Chọn lựa các phương pháp tinh sạch acarbose từ dịch qua cột than 1
Tập trung các phân đoạn có chứa acarbose của cột than hoạt tính 1 cô đặc 90% rồi đƣa lên cột sắc ký lần 2 để tinh sạch thu hoạt chất acarbose.
3.4.2.1. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400
Đƣa dịch cô đặc lên cột và rửa cột bằng hệ dung môi methanol : nƣớc = 4:1 (v/v) để thu hoạt chất acarbose. Kết quả acarbose đƣợc đẩy ra từ phân đoạn 8 đến 15 cùng với tạp chất khác (Hình 3.19). Dịch qua cột giống với dịch lên cột chứng tỏ vẫn chƣa thu đƣợc hoạt chất acarbose.
C 10 11 12 13 14 15
Hình 3.19. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi
anion amberlite IRA400.
10-15: các phân đoạn; C: chuẩn acarbose
3.4.2.2. Tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose
Đƣa dịch cô đặc lên cột và rửa cột bằng đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 6,9, sau đó thu hoạt chất acarbose bằng dung dịch NaCl trong đệm sodium phosphate 0,05 M. Kết quả tƣơng tự nhƣ tinh sạch bằng cột amberlite IRA400 acarbose đƣợc đẩy ra từ phân đoạn 6 đến 11 cùng với tạp chất khác. Dịch qua cột giống với dịch lên cột chứng tỏ vẫn chƣa thu đƣợc hoạt chất acarbose (Hình 3.20). Kết quả của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu trƣớc đó (Lin, et al., 2007). Việc sử dụng
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 52
các chất trao đổi ion để tinh sạch hoạt chất acarbose thì khó đạt đƣợc acarbose có đủ độ tinh sạch.
C 6 7 8 9 10 11
Hình 3.20. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột sắc ký trao đổi
anion DEAE-sepharose
6-11: các phân đoạn; C: chuẩn acarbose
3.4.3. Tinh sạch và thu nhận acarbose
Dịch cô đặc tiếp tục đƣợc tinh sạch bằng cột than hoạt tính 2, mẫu đƣa lên cột và rửa bằng 50 ml ethanol 5%, sau đó rửa bằng 50 ml ethanol 15%. Kết quả dịch tinh sạch gồm 3 nhóm chính: 20 ml đầu tiên không có chất nào đƣợc đẩy ra, 30 ml tiếp theo tạp chất đƣợc đẩy ra, có một băng cao hơn chuẩn, 10 ml sau đó acarbose đã đƣợc đẩy ra cùng với tạp chất (2 băng), 40 ml cuối cùng đã thu đƣợc hoạt chất acarbose có một băng ngang với chuẩn (Hình 3.21).
LC 20 C 21 22 23 24 25 26 27 C 28 29 30 31 32 33 34 35 36 C 37 38 39 40 41
Hình 3.21. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 53
Phân đoạn có chứa acarbose đƣợc cô đặc 90% để loại hết dung môi ethanol sau đó đƣa lên cột trao đổi cation dạng acid mạnh amberlite XAD 1600T. Cột đƣợc rửa bằng nƣớc và sau đó rửa giải bằng hỗn hợp dung môi nƣớc : acetone = 9:1 (v/v). Các phân đoạn chính có chứa acarbose lại đƣợc chạy qua cột trao đổi anion dạng base yếu amberlite IRA67 và rửa giải bằng nƣớc để trung hòa dịch có chứa acarbose. Cô cạn phân đoạn chứa acarbose thu đƣợc chất keo không màu. Chất keo này đƣợc kết tủa trong methanol tuyệt đối cho chất bột màu trắng.
Hàm lƣợng acarbose trong dịch lên men và dịch tinh sạch đƣợc xác định bằng hệ thống HPLC ghép khối phổ (Tại Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lƣờng chất lƣợng). Kết quả sắc ký đồ HPLC (Hình 3.22, 3.23 và 3.24) cho thấy, ở cả 3 mẫu: acarbose chuẩn, dịch lên men và dịch acarbose tinh sạch đều xuất hiện 1 peak tại thời gian lƣu 0,666 phút, khối lƣợng phân tử 645,6 là peak của hoạt chất acarbose. Hàm lƣợng acarbose trong dịch lên men đạt 10,48 mg/ml, trong dịch tinh sạch đạt 191,5 mg/ml cao gấp 18,3 lần so với dịch lên men. Hoạt chất acarbose thu đƣợc có độ tinh sạch đạt 98%.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 54
Hình 3.23. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161.
Hình 3.24. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 55
Nhƣ vậy chúng tôi đã tinh sạch đƣợc hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 với kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Từ 500 ml dịch
lên men với hàm lƣợng 10,48 mg/ml acarbose, qua các bƣớc tinh sạch thu đƣợc 20 ml dịch acarbose tinh sạch cô đặc có hàm lƣợng 191,5 mg/ml acarbose. Nhƣ vậy, hiệu suất thu hồi sau quá trình tinh sạch đạt 73,1% acarbose.
Bảng 3.1. Khối lƣợng chế phẩm qua các bƣớc tinh sạch acarbose
Các bƣớc tinh sạch Lên cột (ml) Dịch rửa (ml) Dịch acarbose (ml) Dịch acarbose cô đặc (ml) Hàm lƣợng acarbose (g/l) Khối lƣợng acarbose (g) Dịch lên men 500 - - - 10,48 5,240 Cột than 1 500 6740 1240 100 - - Cột than 2 100 500 440 50 - - XAD 1600T 50 100 70 50 - - IRA67 50 100 60 20 191,5 3,830 3.4.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase
Các phân đoạn chứa acarbose khi qua sắc ký cột đƣợc tập trung lại và kiểm tra hoạt tính ức chế α-glucosidase.
Hình 3.25. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes
sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch DLM: dịch lên men, DTS: dịch tinh sạch.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 56
Kết quả hình 3.25 cho thấy, hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose tinh sạch đạt 68,7%, tăng 1,6 lần so với dịch lên men (42,9%) và tăng 4,2 lần so với dịch qua cột than 1 (16,5%). Dịch tinh sạch qua cột amberlite IRA400 và DEAE-sepharose có hoạt tính đạt 20,3% và 30,29%, cao hơn dịch qua cột than 1 và thấp hơn dịch acarbose tinh sạch. Dịch qua cột than 2 có hoạt tính đạt 58,0% cao hơn dịch lên men và thấp hơn dịch tinh sạch khi qua hai cột amberlite XAD 1600T và amberlite IRA67.
3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose
Cấu trúc hóa học của hợp chất acarbose tinh sạch đƣợc xác định bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Hợp chất acarbose thu đƣợc có đặc điểm nhƣ sau: chất bột màu trắng, khối lƣợng phân tử 645,6, có tỷ lệ phần trăm thành phần 46,5% C; 6,7% H; 2,2% N và 44,6% O. Sắc ký lớp mỏng cho một vệt duy nhất có hệ số Rf = 0,28 trong hệ dung môi 94% (ethyl acetate : methanol = 1:1) và 6% (nƣớc : acid fomic = 5:2).
Hình 3.26. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 57
Phổ 13C-NMR (Hình 3.25) và DEPT cho tín hiệu của 31 cacbon trong đó có một nhóm methyl (17,4 ppm), 4 nhóm CH2O, 1 CH (123,7 ppm), 1 C bậc 4 (139,1 ppm) và còn lại là các nhóm CH-O có độ dịch chuyển hóa học đặc trƣng của các nhóm CH-OH trong vòng carbohydrate (65-77,4 ppm).
Phổ 1H-NMR (Hình 3.26) cho tín hiệu của một nhóm methyl (1,30 ppm), 1 nhóm CH (5,85 ppm), 4 nhóm CH đặc trƣng của CH-1 của vòng đƣờng trong đó có 3 nhóm α (5,34; 5,25; và 5,18 ppm) và 1 nhóm β (4,60 ppm). Ngoài ra còn có một tín hiệu đặc trƣng của 1 nhóm CH2O có độ dịch chuyển hóa học dịch về phía trƣờng thấp (4,0-4,19 ppm). Các tín hiệu proton khác nằm trong vùng từ 3,49-4,00 ppm đặc trƣng cho proton của đƣờng.
Hình 3.27. Phổ proton 1H-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161.
Các dữ liệu trên cho phép gợi ý đến một hỗn hợp pseudotetrasaccharide (25C) kết hợp với dữ liệu của phổ COSY, HSQC VÀ HMBC (Phụ lục hình P2, P3 và P4)
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 58
cho phép dự đoán cấu trúc của hợp chất tinh sạch đƣợc là acarbose. Khi so sánh dữ liệu phổ này với dữ liệu phổ acarbose đã công bố (Bock, Pedersen, 1984) cho phép khẳng định hợp chất tinh sạch đƣợc chính là acarbose có công thức phân tử C25H43NO18 và có cấu trúc nhƣ hình 3.28 O H OH N O H OH O 6 O H OH O O OH O H OH O O OH OH O H OH H 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Hình 3.28. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 59
3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose
Từ các dữ liệu nghiên cứu trên, chúng tôi xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
quy mô phòng thí nghiệm.
Dịch lên men (8 ngày)
(1) Hòa vào than hoạt tính tại pH 3, khuấy 1 giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa 3 đến 5 lần bằng nƣớc cất.
Hỗn hợp than hoạt tính và dịch lên men
(2) Nhồi lên cột
Sắc ký cột than hoạt tính 1 (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 20%)
(3) Tập trung các phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90%
Sắc ký cột than hoạt tính 2 (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 15%)
(4) Tập trung các phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90%
Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%)
(5) Tập trung các phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 20%
Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa bằng nƣớc) (6)
Dịch acarbose tinh sạch
(7) Cô cạn và kết tủa trong methanol
Hình 3.29. Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Môi trƣờng và điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 gồm các thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose,
15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 trong điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút và thời gian 192 giờ, cho năng suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trƣớc tối ƣu.
2. Khả năng ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose sinh ra từ Actinoplanes
sp. KCTC 9161 trong môi trƣờng tối ƣu tăng 5,4% so với môi trƣờng trƣớc tối ƣu, đạt 54,2%.
3. Đã tạo ra đƣợc dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao, cho năng suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên và cho hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng.
4. Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 bằng sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính,
sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T và sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67. Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1%.
5. Hoạt chất acarbose thu đƣợc có một băng đậm ngang chuẩn trên sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh sạch 98%. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch acarbose tinh sạch đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men.
Kiến nghị
1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 quy mô pilot.
2. Thử nghiệm, đánh giá chất lƣợng của chế phẩm acarbose tạo ra, định hƣớng trong sản xuất thuốc điều trị đái tháo đƣờng type 2.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Bộ Y tế (2012), "Dƣợc thƣ quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr. 8-12. 2. Lê Văn Chi (2004), "Tăng đƣờng huyết sau ăn", Tạp chí Thông tin Tim mạch
học, 8, tr. 37-42.
3. Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đƣờng huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12.
4. Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr. 1-11.
5. Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dƣợc liệu có tác dụng hạ đƣờng huyết và trị tiểu đƣờng", Tạp chí Dược học, (353), tr. 7-9.
6. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục