Sắc ký lọc gel sephadex G100
Cột sephadex G100 là cột phân tách hỗn hợp theo nguyên tắc lọc gel, các chất có kích thƣớc khác nhau có thời gian đi qua hệ thống gel khác nhau. Gel sephadex G100 đƣợc ngâm với nƣớc trƣớc khi nhồi 24 giờ. Cột đƣợc cân bằng với đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5 trong 6 giờ. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa chiết bằng đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5 thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký cột hấp thụ silica gel
Hạt silica gel đƣợc ngâm trong ethanol trƣớc khi nhồi 24 giờ. Cột đƣợc cân bằng với dung môi ethanol trong 1 giờ, sau đó cho 10 ml mẫu dịch lên men lên cột và rửa chiết bằng dung môi ethanol thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi anion giữa các ion trong mẫu với nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl liên kết với polysaccharide polymer tích điện dƣơng) của chất giá. Khi mẫu qua cột các ion tích điện âm sẽ gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.
Gel DEAE-sepharose đƣợc nhồi lên cột và rửa với nƣớc 4-6 giờ để loại hết cồn trong dịch bảo quản. Cột đƣợc cân bằng với đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 6,9 trong 6 giờ. Đƣa 10 ml mẫu lên cột và thu mẫu bằng dung dịch NaCl 0,1 M pha trong đệm sodium phosphate 0,05 M, thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400
Dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa các ion trong mẫu với nhóm trao đổi ion polystyrene divinylbenzene của chất giá. Hạt amberlite IRA400 đƣợc ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trƣớc khi nhồi lên cột, sau đó rửa cột bằng nƣớc đến
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 30
khi pH trong cột đạt 2. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa bằng hỗn hợp dung môi methanol: nƣớc = 4:1 (v/v) thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67
Amberlite IRA67 là chất trao đổi anion dạng base yếu dựa trên mạng acrylic của chất giá để trung hòa các chất acid mạnh. Hạt amberlite IRA67 đƣợc ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trƣớc khi nhồi lên cột, sau đó rửa cột bằng nƣớc đến khi pH trong cột đạt 7. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa giải bằng nƣớc để trung hòa dung dịch có chứa acarbose.
Sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T
Amberlite XAD 1600T là chất trao đổi cation dạng acid mạnh dựa trên mạng polystyrene. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa cột bằng nƣớc sau đó thu mẫu bằng hỗn hợp nƣớc : acetone = 9:1 (v/v) (Hong, et al., 2003).
Sắc ký cột hấp phụ than hoạt tính
Dựa trên khả năng hấp phụ của than hoạt tính với các chất màu hay các loại đƣờng khác nhau. Các chất hấp phụ yếu hơn sẽ bị loại ra trƣớc với nồng độ dung môi thấp và ngƣợc lại các chất hấp phụ mạnh sẽ đƣợc đẩy ra sau cùng nồng độ dung môi cao hơn.
Tiến hành : 2,5 g than hoạt tính đƣợc đun cách thủy 1 giờ trƣớc khi nhồi cột để đuổi hết các bọt khí có trong các hạt than, 50 ml dịch lên men ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút để loại sinh khối tế bào, sau đó hấp phụ vào than hoạt tính trong điều kiện pH 2-3, khuấy nhẹ 1 giờ và để ở 4o
C trong 12 giờ. Hỗn hợp đƣợc rửa với 200 ml nƣớc cất 3 đến 5 lần. Dịch than có chứa acarbose đƣợc nhồi lên cột và giải hấp phụ acarbose bằng ethanol theo gradien nồng độ từ 0% đến 20% trong đó rửa bằng 20 ml ethanol 5%, 40 ml ethanol 10 %, 100 ml ethanol 15% và 20 ml ethanol 20%. Các phân đoạn thu đƣợc TLC để kiểm tra khả năng tinh sạch acarbose.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 31