Để nâng cao khả năng sinh tổng hợp acarbose, phƣơng pháp gây đột biến chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 bằng hóa chất NTG đƣợc thực hiện. Quan sát các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch sau 5 ngày nuôi nhận thấy NTG có ảnh hƣởng lớn tới khả năng sống sót của bào tử. Thời gian gây đột biến càng lâu, nồng độ NTG càng cao thì khuẩn lạc mọc càng ít. Tại nồng độ 5 µg/ml NTG, thời gian 30 phút có 2 khuẩn lạc, thời gian 60 phút có 5 khuẩn lạc mọc. Tại nồng độ 10 µg/ml NTG, thời gian 30 phút có 7 khuẩn lạc và nồng độ 15 µg/ml NTG, thời gian 30 phút có 1 khuẩn lạc. Khi sử dụng nồng độ NTG 20 µg/ml để gây đột biến không có khuẩn lạc nào mọc và ở tất cả các nồng độ NTG gây đột biến trong thời gian 90 phút cũng không thu đƣợc khuẩn lạc nào. Sau nhiều lần đột biến chỉ thu đƣợc 15 khuẩn lạc có hình thái ổn định giống chủng tự nhiên.
Các dòng đột biến thu đƣợc đƣợc ký hiệu là Nabc trong đó N: gây đột biến bằng NTG; a: nồng độ NTG gây đột biến (a = 1, 2, 3 và 4 tƣơng ứng với nồng độ NTG là 5, 10, 15 và 20 μg/ml); b: thời gian gây đột biến (b = 1, 2, 3 tƣơng ứng với thời gian gây đột biến là 30, 60, 90 phút); c: số thứ tự dòng đột biến trong cùng điều kiện nồng độ NTG và thời gian gây đột biến.
Khi nuôi lên men sinh tổng hợp acarbose 15 dòng đột biến này đều sinh tổng hợp acarbose xuất hiện băng ngang chuẩn acarbose trên sắc ký đồ TLC (Hình 3.13). Kết quả hình 3.13 cho thấy các dòng 3 ký hiệu N213, dòng 7 ký hiệu N217, dòng 8 ký hiệu N111 và dòng 15 ký hiệu N311 có băng đậm ngang chuẩn, các dòng còn lại
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 47
đều có băng ngang chuẩn acarbose, chứng tỏ tất cả 15 dòng đột biến chọn lọc đƣợc đều có khả năng sinh tổng hợp acarbose.
1 2 3 C 4 5 6 7 8 9 10 11 C 12 13 14 15 ĐC
Hình 3.13. Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các dòng đột biến của
chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1-15: dòng đột biến; ĐC: chủng tự nhiên; C: chuẩn acarbose
Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong dịch lên men của các dòng đột biến tăng không đáng kể so với mẫu đối chứng trong đó dòng 7 ký hiệu N217 (nồng độ 10 µg/ml NTG, thời gian 30 phút) hoạt tính ức chế cao nhất 52,8%, tăng 1,35 lần so với chủng tự nhiên, tiếp đến là các dòng N112, N121, N213 và dòng N311, hoạt tính ức chế đạt trên 50%, các dòng đột biến còn lại đều có hoạt tính đạt từ 40 đến 49% (Hình 3.14).
Hình 3.14. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose sinh tổng hợp từ các
dòng đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
Dịch lên men dòng N217 đạt năng suất 10,94 g/l acarbose khi phân tích bằng hệ thống HPLC với hệ dung môi acetonitrile : nƣớc = 75:25 (v/v) (hình 3.15). Hàm
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 48
lƣợng acarbose trong dịch lên men của dòng đột biến tăng thêm 960 mg/l so với chủng tự nhiên.
Nhƣ vậy kết quả bƣớc đầu gây đột biến chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 cho khả năng nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose tăng so với chủng gốc. Khác với kết quả nghiên cứu của Quyền Đình Thi và cs (2012) gây đột biến trên chủng
Actinoplanes VTCC-A1779 và VTCC-A1094 cho năng suất sinh tổng hợp acarbose
cao gấp 3 lần so với chủng tự nhiên (Quyền Đình Thi, et al., 2012).
Minutes 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 uR IU 10 20 30 40 50 60 70 80 uR IU 10 20 30 40 50 60 70 80 3. 37 0 0. 00 0 101695834 7.47 0 A ca rb os e 1. 09 4 2772284 RI 29-8-Chph2-F10.dat Retention Time Name ESTD concentration Area
Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men biến thể N217 gây đột
biến từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161