Chủng giống xạ khuẩn Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc hoạt hóa trên môi
trƣờng thạch, sau 4 ngày xuất hiện các khuẩn lạc màu cam. Một khuẩn lạc riêng rẽ đƣợc nuôi vào bình 100 ml chứa 25 ml môi trƣờng nhân giống. Sau 96 giờ đƣợc tiếp chuyển sang bình 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng lên men theo các công thức thí nghiệm tối ƣu (Wei, et al., 2010).
2.2.2. Lựa chọn môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc nuôi nhân giống sau 96 giờ, tiếp 10% dịch nhân giống vào mỗi bình 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng lên men MT1, MT2, MT3, MT4, MT5 với các thành phần nhƣ bảng 2.3. Chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161 đƣợc nuôi lên men sinh tổng hợp acarbose trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút trong 144 giờ.
Bảng 2.3. Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu
Môi trƣờng
Thành phần môi trƣờng (g/l)
glucose maltose Sucrose BN BĐT casein glutamate peptone glycerol khoáng
MT1 30 30 - 10 - - 1 - - +
MT2 - 30 - 10 - - 1 - - +
MT3 - - 30 - - 0,1 - 0,2 - +
MT4 40 43 - - 17 - 5 - 5 +
MT5 30 50 - - 17 - 5 - 5 +
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 26
Sau khi chọn đƣợc môi trƣờng thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161, nguồn cacbon và nitơ sẽ đƣợc bổ sung vào môi trƣờng theo nồng độ khác nhau để chọn đƣợc nồng độ tối ƣu.
2.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc nuôi trong môi trƣờng lên men thích hợp đã chọn đƣợc ở mục 2.2.2 trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút để khảo sát khả năng sinh tổng hợp acarbose tăng dần theo thời gian nuôi cấy. Dải thời gian lựa chọn để nghiên cứu từ 24 đến 216 giờ với khoảng cách lấy mẫu là 24 giờ. Các chỉ tiêu đánh giá dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế α-glucosidase.
2.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitrogen khi nuôi cấy
Nguồn carbon và nitrogen không những ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh trƣởng mà còn ảnh hƣởng lớn đến năng suất sinh tổng hợp acarbose của chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161. Để xác định đƣợc môi trƣờng tối ƣu cho sinh tổng
hợp acarbose các nồng độ maltose (20, 30, 40, 50 và 60 g/l), glucose (10, 20, 30, 40 và 50 g/l) và bột ngô (0, 5, 10, 15, 20 và 25 g/l) lần lƣợt đƣợc tối ƣu trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút trong 192 giờ.
2.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc, nhiệt độ và pH khi nuôi cấy
Để xác định tốc độ lắc, nhiệt độ và pH nuôi cấy tối ƣu, chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161 đƣợc nuôi trong môi trƣờng lên men trong 192 giờ ở các điều kiện nghiên cứu: tốc độ lắc 100, 150, 200 và 220 vòng/phút; nhiệt độ 25, 28, 30 và 37oC; pH 6,0; 6,5, 7,0; 7,5; 8,0 và 8,5 trong đó thông số tốt nhất của nghiên cứu trƣớc sẽ đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Tốc độ lắc, nhiệt độ và pH tối ƣu cho sinh tổng hợp acarbose cao đƣợc xác định dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế α- glucosidase.
2.3. Gây đột biến bằng NTG
N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) là một hóa chất gây ra đột biến điểm, làm biến đổi các base gây ra sự kết cặp sai. NTG sẽ alkyl hóa cả 4 loại
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 27
nucleotide. Tuy nhiên, đột biến hầu nhƣ chỉ xảy ra khi nhóm alkyl đƣợc thêm vào ở oxy số 6 của guanine tạo ra O-6-alkylguanine. Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine gây ra đột biến G-X thành A-T trong lần sao chép tiếp theo.
Tiến hành: chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc nuôi trên đĩa thạch ở 28oC trong 5 ngày. Bào tử hòa vào dung dịch 0,2% tween 20. Dịch bào tử đƣợc trộn với dung dịch NTG ở các nồng độ 5, 10, 15 và 20 µg/ml. Mỗi nồng độ đều đƣợc xử lý trong 30, 60 và 90 phút ủ 25oC, 300 vòng/phút. Dịch sau ủ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Thu cặn bào tử và tiếp tục rửa với 0,2% tween 20 lặp lại 4-5 lần. 200 µl dịch bào tử đƣợc trải trên mỗi đĩa thạch lặp lại 3 lần và nuôi ở 28oC, sau 5 ngày tính số khuẩn lạc mọc trên các đĩa. Nuôi lên men để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp acarbose của các dòng đột biến (Quyền Đình Thi, et al., 2012).
2.4. Sắc ký lớp mỏng TLC
Nguyên lý: Sắc ký lớp mỏng bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động đƣợc lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất phân tử nhỏ dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có đƣợc chỗ liên kết với pha tĩnh. Do đó, các chất có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển lên bản sắc ký với các tốc độ khác nhau và đƣợc tách ra ở các vị trí khác nhau (Phan Tuấn Nghĩa, 2012).
Tiến hành: Dịch sau lên men đƣợc ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút. Dịch nổi chiết bằng dung môi ethanol theo tỷ lệ 1 mẫu : 4 dung môi trong thời gian 30 phút. Dịch chiết đƣợc ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại tủa, thu dịch nổi và kiểm tra hoạt chất acarbose trên sắc ký lớp mỏng. Bản sắc ký silica gel (Merck) 60 F254, dày 0,25 mm với pha động là hệ dung môi gồm 94% (ethyl acetate : methanol = 1:1) và 6% (nƣớc : acid formic = 5:2). Các phân tử đƣờng đƣợc phát hiện bằng xông hơi acid H2SO4 10% trong ethanol và hiện màu ở nhiệt độ 110oC trong 10 phút.
2.5. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose
Nguyên lý: α-glucosidase là enzyme cắt liên kết α-1,4. Cơ chất sử dụng là pNPG (Yamaki, Mori, 2006), pNPG khi bị α-glucosidase thủy phân sẽ sinh ra p-
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 28
nitrophenyl có màu vàng và hấp thụ bƣớc sóng 415 nm. Enzyme α-glucosidase sẽ bị ức chế một phần bởi hoạt chất acarbose trong mẫu thí nghiệm. Do đó, lƣợng p-
nitrophenyl sinh ra sẽ ít hơn so với khi không có mặt acarbose.
Tiến hành: Sử dụng khay vi thể 96 giếng, thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, có đối chứng, mỗi giếng gồm: 20 µl mẫu thí nghiệm (giếng đối chứng thay bằng 20 µl đệm potasium phosphate 0,5 M, pH 6,7), 50 µl emzyme α-glucosidase nồng độ 25 mg/ml, 50 µl cơ chất pNPG 3 mM và 120 µl đệm potasium phosphate 0,5 M, pH
6,7. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 37oC trong 45 phút, sau đó thêm 50 µl Na2CO3 0,67 M vào mỗi giếng để dừng phản ứng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc đo ở bƣớc sóng 415 nm trên máy Elisa reader (Biotek, ELx800, USA). Một đơn vị α-glucosidase đƣợc định nghĩa nhƣ là lƣợng enzyme giải phóng 1 µmol của pNPG ở điều kiện thí nghiệm.
Mức độ ức chế α-glucosidase đƣợc tính theo công thức:
% Ức chế =
A415 ĐC – A415 TN
x 100 A415 ĐC
Trong đó: A415ĐC và A415TN là giá trị OD mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm đo tại bƣớc sóng 415 nm.
2.6. Tách chiết và tinh sạch acarbose
2.6.1. Tách chiết và tinh sạch sơ bộ
Dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sau 192 giờ đƣợc ly tâm ở
4000 vòng/phút trong 15 phút để loại cặn tế bào, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ các chất không tan khác. Dịch nổi đƣợc tủa với ethanol theo tỷ lệ 1 mẫu: 4 ethanol (v/v) trong 30 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi thu đƣợc kiểm tra bằng TLC.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 29
2.6.2. Tinh sạch acarbose bằng sắc ký cột Sắc ký lọc gel sephadex G100 Sắc ký lọc gel sephadex G100
Cột sephadex G100 là cột phân tách hỗn hợp theo nguyên tắc lọc gel, các chất có kích thƣớc khác nhau có thời gian đi qua hệ thống gel khác nhau. Gel sephadex G100 đƣợc ngâm với nƣớc trƣớc khi nhồi 24 giờ. Cột đƣợc cân bằng với đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5 trong 6 giờ. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa chiết bằng đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 7,5 thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký cột hấp thụ silica gel
Hạt silica gel đƣợc ngâm trong ethanol trƣớc khi nhồi 24 giờ. Cột đƣợc cân bằng với dung môi ethanol trong 1 giờ, sau đó cho 10 ml mẫu dịch lên men lên cột và rửa chiết bằng dung môi ethanol thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi anion giữa các ion trong mẫu với nhóm trao đổi ion (dimethylaminoethyl liên kết với polysaccharide polymer tích điện dƣơng) của chất giá. Khi mẫu qua cột các ion tích điện âm sẽ gắn vào cột và sau đó đƣợc đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch muối có chứa ion có ái lực mạnh hơn đối với nhóm trao đổi ion của chất giá.
Gel DEAE-sepharose đƣợc nhồi lên cột và rửa với nƣớc 4-6 giờ để loại hết cồn trong dịch bảo quản. Cột đƣợc cân bằng với đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 6,9 trong 6 giờ. Đƣa 10 ml mẫu lên cột và thu mẫu bằng dung dịch NaCl 0,1 M pha trong đệm sodium phosphate 0,05 M, thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400
Dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa các ion trong mẫu với nhóm trao đổi ion polystyrene divinylbenzene của chất giá. Hạt amberlite IRA400 đƣợc ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trƣớc khi nhồi lên cột, sau đó rửa cột bằng nƣớc đến
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 30
khi pH trong cột đạt 2. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa bằng hỗn hợp dung môi methanol: nƣớc = 4:1 (v/v) thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml.
Sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67
Amberlite IRA67 là chất trao đổi anion dạng base yếu dựa trên mạng acrylic của chất giá để trung hòa các chất acid mạnh. Hạt amberlite IRA67 đƣợc ngâm hoạt hóa bằng HCl 5% trong 2 giờ trƣớc khi nhồi lên cột, sau đó rửa cột bằng nƣớc đến khi pH trong cột đạt 7. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa giải bằng nƣớc để trung hòa dung dịch có chứa acarbose.
Sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T
Amberlite XAD 1600T là chất trao đổi cation dạng acid mạnh dựa trên mạng polystyrene. 10 ml mẫu đƣợc đƣa lên cột và rửa cột bằng nƣớc sau đó thu mẫu bằng hỗn hợp nƣớc : acetone = 9:1 (v/v) (Hong, et al., 2003).
Sắc ký cột hấp phụ than hoạt tính
Dựa trên khả năng hấp phụ của than hoạt tính với các chất màu hay các loại đƣờng khác nhau. Các chất hấp phụ yếu hơn sẽ bị loại ra trƣớc với nồng độ dung môi thấp và ngƣợc lại các chất hấp phụ mạnh sẽ đƣợc đẩy ra sau cùng nồng độ dung môi cao hơn.
Tiến hành : 2,5 g than hoạt tính đƣợc đun cách thủy 1 giờ trƣớc khi nhồi cột để đuổi hết các bọt khí có trong các hạt than, 50 ml dịch lên men ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút để loại sinh khối tế bào, sau đó hấp phụ vào than hoạt tính trong điều kiện pH 2-3, khuấy nhẹ 1 giờ và để ở 4o
C trong 12 giờ. Hỗn hợp đƣợc rửa với 200 ml nƣớc cất 3 đến 5 lần. Dịch than có chứa acarbose đƣợc nhồi lên cột và giải hấp phụ acarbose bằng ethanol theo gradien nồng độ từ 0% đến 20% trong đó rửa bằng 20 ml ethanol 5%, 40 ml ethanol 10 %, 100 ml ethanol 15% và 20 ml ethanol 20%. Các phân đoạn thu đƣợc TLC để kiểm tra khả năng tinh sạch acarbose.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 31
2.7. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Hàm lƣợng acarbose đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). HPLC là quá trình tách một hỗn hợp chất trong cột sắc ký ở trạng thái lỏng. Các chất mẫu phân tích phải đƣợc hòa tan trong một chất lỏng phù hợp thƣờng chính là pha động chạy sắc ký.
Các mẫu dịch lên men đƣợc phân tích bằng hệ thống HPLC với hệ dung môi acetonitrile : nƣớc = 3:1 (v/v), tốc độ dòng chảy 0,5 ml/phút, thời gian chạy 30 phút. Hàm lƣợng acarbose đƣợc xác định dựa trên sắc ký đồ HPLC của chuẩn acarbose tại nồng độ xác định.
2.8. Sắc ký lỏng ghép khối phổ
Dựa trên nguyên tắc mẫu nghiên cứu sau khi đƣợc tách chất trên hệ thống sắc ký lỏng các chất sẽ đi vào nguồn ion hóa, tại đây các chất sẽ đƣợc ion hóa, sau đó các ion sẽ đƣợc tách ra và phân mảnh qua một loạt các phân tích sẽ thu đƣợc sơ đồ phân mảnh ion. Dựa vào sơ đồ này kết hợp với ngân hàng giữ liệu các chất đã biết có thể xác định đƣợc khối lƣợng phân tử cũng nhƣ hàm lƣợng của chất cần nghiên cứu.
Các mẫu dịch lên men và dịch tinh sạch đƣợc phân tích trên hệ thống HPLC ghép khối phổ. Hàm lƣợng acarbose đƣợc xác định dựa trên sắc ký khối phổ của chuẩn acarbose.
2.9. Xác định cấu trúc phân tử acarbose bằng cộng hƣởng từ hạt nhân
Cấu trúc phân tử acarbose đƣợc xác định theo phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR). Dựa trên nguyên tắc spin hạt nhân dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. NMR hoạt hóa spin hạt nhân khi nguyên tố có số proton hoặc neutron lẻ. Nhƣ vậy, 1H và 13C sẽ cho ta tín hiệu NMR. Trong phân tử tùy theo cấu trúc mà tần số cộng hƣởng của proton (hay 13C) khác nhau. Tổng số các mũi cộng hƣởng đó tạo thành phổ NMR của phân tử. Kết hợp với các số liệu thu đƣợc từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hóa học của chất cần nghiên cứu.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 32
2.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc tính toán theo phƣơng pháp phân tích thống kê toán học. Quá trình xử lý số liệu đƣợc thực hiện trên máy tính với ứng dụng chƣơng trình excel. Dùng hàm average để tính trung bình và hàm studv để phân tích sai số với ba lần lặp lại thí nghiệm.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc nuôi lên men sinh tổng hợp acarbose trong 5 loại môi trƣờng khác nhau MT1, MT2, MT3, MT4 và MT5 (Bảng 2.3), nhằm lựa chọn một môi trƣờng tốt nhất, có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao thông qua các thông số nhƣ: sắc ký đồ TLC của hoạt chất acarbose và hoạt tính ức chế α-gluocsidase.
Sắc ký đồ TLC của hoạt chất acarbose trong các môi trƣờng lên men khác nhau đƣợc thể hiện trên hình 3.1. Dịch nuôi trong môi trƣờng MT1, MT2, MT4, MT5 đều xuất hiện băng ngang chuẩn acarbose với hệ số Rf = 0,28 tƣơng ứng với chuẩn acarbose. Trong đó, dịch nuôi trong môi trƣờng MT1 có thành phần chứa maltose, glucose và bột ngô xuất hiện băng acarbose đậm (làn 1), môi trƣờng MT2 thành phần chỉ có maltose và bột ngô, không có glucose băng acarbose xuất hiện mờ hơn môi trƣờng MT1 (làn 2).
1 2 3 4 5 C
Hình 3.1. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161 trong các môi trƣờng lên men 1: MT1, 2: MT2, 3: MT3, 4: MT4, 5: MT5
Môi trƣờng MT4 và MT5 thành phần có maltose, glucose và bột đậu tƣơng với tỷ lệ khác nhau đều xuất hiện băng đậm acarbose, chỉ khác nhau ở các băng phụ, trong đó môi trƣờng MT4 có nhiều glucose và ít maltose xuất hiện băng phụ đậm (làn 4) còn môi trƣờng MT5 có ít glucose và nhiều maltose hơn thì có các băng phụ