Dịch cô đặc tiếp tục đƣợc tinh sạch bằng cột than hoạt tính 2, mẫu đƣa lên cột và rửa bằng 50 ml ethanol 5%, sau đó rửa bằng 50 ml ethanol 15%. Kết quả dịch tinh sạch gồm 3 nhóm chính: 20 ml đầu tiên không có chất nào đƣợc đẩy ra, 30 ml tiếp theo tạp chất đƣợc đẩy ra, có một băng cao hơn chuẩn, 10 ml sau đó acarbose đã đƣợc đẩy ra cùng với tạp chất (2 băng), 40 ml cuối cùng đã thu đƣợc hoạt chất acarbose có một băng ngang với chuẩn (Hình 3.21).
LC 20 C 21 22 23 24 25 26 27 C 28 29 30 31 32 33 34 35 36 C 37 38 39 40 41
Hình 3.21. Sắc ký đồ TLC các phân đoạn tinh sạch acarbose khi qua cột than hoạt tính 2
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 53
Phân đoạn có chứa acarbose đƣợc cô đặc 90% để loại hết dung môi ethanol sau đó đƣa lên cột trao đổi cation dạng acid mạnh amberlite XAD 1600T. Cột đƣợc rửa bằng nƣớc và sau đó rửa giải bằng hỗn hợp dung môi nƣớc : acetone = 9:1 (v/v). Các phân đoạn chính có chứa acarbose lại đƣợc chạy qua cột trao đổi anion dạng base yếu amberlite IRA67 và rửa giải bằng nƣớc để trung hòa dịch có chứa acarbose. Cô cạn phân đoạn chứa acarbose thu đƣợc chất keo không màu. Chất keo này đƣợc kết tủa trong methanol tuyệt đối cho chất bột màu trắng.
Hàm lƣợng acarbose trong dịch lên men và dịch tinh sạch đƣợc xác định bằng hệ thống HPLC ghép khối phổ (Tại Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lƣờng chất lƣợng). Kết quả sắc ký đồ HPLC (Hình 3.22, 3.23 và 3.24) cho thấy, ở cả 3 mẫu: acarbose chuẩn, dịch lên men và dịch acarbose tinh sạch đều xuất hiện 1 peak tại thời gian lƣu 0,666 phút, khối lƣợng phân tử 645,6 là peak của hoạt chất acarbose. Hàm lƣợng acarbose trong dịch lên men đạt 10,48 mg/ml, trong dịch tinh sạch đạt 191,5 mg/ml cao gấp 18,3 lần so với dịch lên men. Hoạt chất acarbose thu đƣợc có độ tinh sạch đạt 98%.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 54
Hình 3.23. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161.
Hình 3.24. Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 55
Nhƣ vậy chúng tôi đã tinh sạch đƣợc hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 với kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Từ 500 ml dịch
lên men với hàm lƣợng 10,48 mg/ml acarbose, qua các bƣớc tinh sạch thu đƣợc 20 ml dịch acarbose tinh sạch cô đặc có hàm lƣợng 191,5 mg/ml acarbose. Nhƣ vậy, hiệu suất thu hồi sau quá trình tinh sạch đạt 73,1% acarbose.
Bảng 3.1. Khối lƣợng chế phẩm qua các bƣớc tinh sạch acarbose
Các bƣớc tinh sạch Lên cột (ml) Dịch rửa (ml) Dịch acarbose (ml) Dịch acarbose cô đặc (ml) Hàm lƣợng acarbose (g/l) Khối lƣợng acarbose (g) Dịch lên men 500 - - - 10,48 5,240 Cột than 1 500 6740 1240 100 - - Cột than 2 100 500 440 50 - - XAD 1600T 50 100 70 50 - - IRA67 50 100 60 20 191,5 3,830 3.4.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase
Các phân đoạn chứa acarbose khi qua sắc ký cột đƣợc tập trung lại và kiểm tra hoạt tính ức chế α-glucosidase.
Hình 3.25. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes
sp. KCTC 9161 sau khi qua các cột tinh sạch DLM: dịch lên men, DTS: dịch tinh sạch.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 56
Kết quả hình 3.25 cho thấy, hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose tinh sạch đạt 68,7%, tăng 1,6 lần so với dịch lên men (42,9%) và tăng 4,2 lần so với dịch qua cột than 1 (16,5%). Dịch tinh sạch qua cột amberlite IRA400 và DEAE-sepharose có hoạt tính đạt 20,3% và 30,29%, cao hơn dịch qua cột than 1 và thấp hơn dịch acarbose tinh sạch. Dịch qua cột than 2 có hoạt tính đạt 58,0% cao hơn dịch lên men và thấp hơn dịch tinh sạch khi qua hai cột amberlite XAD 1600T và amberlite IRA67.
3.5. Xác định cấu trúc hóa học acarbose
Cấu trúc hóa học của hợp chất acarbose tinh sạch đƣợc xác định bằng phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Hợp chất acarbose thu đƣợc có đặc điểm nhƣ sau: chất bột màu trắng, khối lƣợng phân tử 645,6, có tỷ lệ phần trăm thành phần 46,5% C; 6,7% H; 2,2% N và 44,6% O. Sắc ký lớp mỏng cho một vệt duy nhất có hệ số Rf = 0,28 trong hệ dung môi 94% (ethyl acetate : methanol = 1:1) và 6% (nƣớc : acid fomic = 5:2).
Hình 3.26. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 57
Phổ 13C-NMR (Hình 3.25) và DEPT cho tín hiệu của 31 cacbon trong đó có một nhóm methyl (17,4 ppm), 4 nhóm CH2O, 1 CH (123,7 ppm), 1 C bậc 4 (139,1 ppm) và còn lại là các nhóm CH-O có độ dịch chuyển hóa học đặc trƣng của các nhóm CH-OH trong vòng carbohydrate (65-77,4 ppm).
Phổ 1H-NMR (Hình 3.26) cho tín hiệu của một nhóm methyl (1,30 ppm), 1 nhóm CH (5,85 ppm), 4 nhóm CH đặc trƣng của CH-1 của vòng đƣờng trong đó có 3 nhóm α (5,34; 5,25; và 5,18 ppm) và 1 nhóm β (4,60 ppm). Ngoài ra còn có một tín hiệu đặc trƣng của 1 nhóm CH2O có độ dịch chuyển hóa học dịch về phía trƣờng thấp (4,0-4,19 ppm). Các tín hiệu proton khác nằm trong vùng từ 3,49-4,00 ppm đặc trƣng cho proton của đƣờng.
Hình 3.27. Phổ proton 1H-NMR của hoạt chất acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161.
Các dữ liệu trên cho phép gợi ý đến một hỗn hợp pseudotetrasaccharide (25C) kết hợp với dữ liệu của phổ COSY, HSQC VÀ HMBC (Phụ lục hình P2, P3 và P4)
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 58
cho phép dự đoán cấu trúc của hợp chất tinh sạch đƣợc là acarbose. Khi so sánh dữ liệu phổ này với dữ liệu phổ acarbose đã công bố (Bock, Pedersen, 1984) cho phép khẳng định hợp chất tinh sạch đƣợc chính là acarbose có công thức phân tử C25H43NO18 và có cấu trúc nhƣ hình 3.28 O H OH N O H OH O 6 O H OH O O OH O H OH O O OH OH O H OH H 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Hình 3.28. Cấu trúc phân tử acarbose tinh sạch từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 59
3.6. Quy trình tách chiết tinh sạch acarbose
Từ các dữ liệu nghiên cứu trên, chúng tôi xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
quy mô phòng thí nghiệm.
Dịch lên men (8 ngày)
(1) Hòa vào than hoạt tính tại pH 3, khuấy 1 giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa 3 đến 5 lần bằng nƣớc cất.
Hỗn hợp than hoạt tính và dịch lên men
(2) Nhồi lên cột
Sắc ký cột than hoạt tính 1 (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 20%)
(3) Tập trung các phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90%
Sắc ký cột than hoạt tính 2 (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 15%)
(4) Tập trung các phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90%
Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%)
(5) Tập trung các phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 20%
Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa bằng nƣớc) (6)
Dịch acarbose tinh sạch
(7) Cô cạn và kết tủa trong methanol
Hình 3.29. Qui trình tinh sạch hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Môi trƣờng và điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 gồm các thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose,
15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 trong điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút và thời gian 192 giờ, cho năng suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trƣớc tối ƣu.
2. Khả năng ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose sinh ra từ Actinoplanes
sp. KCTC 9161 trong môi trƣờng tối ƣu tăng 5,4% so với môi trƣờng trƣớc tối ƣu, đạt 54,2%.
3. Đã tạo ra đƣợc dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao, cho năng suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên và cho hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng.
4. Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh sạch acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 bằng sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính,
sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T và sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67. Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1%.
5. Hoạt chất acarbose thu đƣợc có một băng đậm ngang chuẩn trên sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh sạch 98%. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch acarbose tinh sạch đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men.
Kiến nghị
1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 quy mô pilot.
2. Thử nghiệm, đánh giá chất lƣợng của chế phẩm acarbose tạo ra, định hƣớng trong sản xuất thuốc điều trị đái tháo đƣờng type 2.
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Bộ Y tế (2012), "Dƣợc thƣ quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr. 8-12. 2. Lê Văn Chi (2004), "Tăng đƣờng huyết sau ăn", Tạp chí Thông tin Tim mạch
học, 8, tr. 37-42.
3. Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đƣờng huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12.
4. Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr. 1-11.
5. Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dƣợc liệu có tác dụng hạ đƣờng huyết và trị tiểu đƣờng", Tạp chí Dược học, (353), tr. 7-9.
6. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam.
7. Nguyễn Thị Nƣơng, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose ở
Actinoplanes sp. KCTC 9161". Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 1, tr.
403-406.
8. Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hƣơng, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đƣờng huyết của dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 31- 33.
9. Công Sơn, Thế Ân (2013), Phòng và trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng
Đức, Hà Nội.
10. Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ các dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779",
Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr. 113-116.
11. Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn các chủng Bacillus sp. sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2",
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 62
12. Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nƣơng, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanes sp. VTCC-A1779 và các biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2),
tr. 71-75.
13. Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc một số chủng Actinoplanes sp. sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức
chế α-glucosidase", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr. 861-865.
Tài liệu tiếng anh
14. Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus
under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp. 1634-1638. 15. Bischoff H (1994), "Pharmacology of alpha-glucosidase inhibition", Eur J Clin
Invest, 24(3), pp. 3-10.
16. Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a high-carbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp. 123-128.
17. Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose",
Carbohydrate Research, (132), pp. 142-149.
18. Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physico-chemical
characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp. 309-317.
19. Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp. CKD 485-16", Biotechnol Prog,
19, pp. 1677-1682.
20. Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp. 1607-
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 63
21. Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66).
22. Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type 2 diabetes: A randomized, Placebo-controlled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp. 55-63.
23. Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp. 195-217.
24. Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766.
25. Hayashim T (2008), "The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type 2 diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp. 110-114.
26. Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbose-modifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes
sp. strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp. 4484-4492.
27. Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1.
28. Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3-dihydroxyacetone production by a UV-induced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy",
Appl Microbiol Biotechnol, 165(5-6), pp. 1152-1160.
29. Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by S-adenosylmethionine in
Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp. 439-447.
30. Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp. 417-428. 31. Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 64
32. Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp. SE50/110 as plasmid for genetic
transformation of related Actinobacteria", International Publication Number,
WO 2013/083566 A1.
33. Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose",
United States Patent, US 4666776.
34. Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp. 393-405.
35. Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp. SN223/29 and evidence
for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol,
80(5), pp. 767-778.
36. Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp. source of the
maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp. 767-778.
37. Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the a-glucosidase inhibitor acarbose in
Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp. 225-227.
38. Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp. A56", Bioresource Technology, 118, pp. 580-583.