3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc nuôi lên men trong môi trƣờng MT1 bao gồm (g/l): 30 maltose, 30 glucose, 10 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút trong 216 giờ, cứ 24 giờ lấy mẫu 1 lần để nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose.
1 2 3 4 5 6 7 8 C
Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC các mẫu acarbose sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161 theo thời gian
1: 48 giờ; 2: 72 giờ; 3: 96 giờ; 4: 120 giờ; 5: 144 giờ; 6: 168 giờ; 7: 192 giờ; 8: 216 giờ; C: chuẩn acarbose.
Sắc ký đồ TLC hình 3.3 cho thấy, từ 48 đến 72 giờ nuôi lên men chủng
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 36
chuẩn trên sắc ký đồ TLC (làn 1 và 2). Sau 96 giờ lên men (làn 3) acarbose bắt đầu đƣợc tổng hợp, xuất hiện băng mờ ngang chuẩn. Băng acarbose xuất hiện đậm dần theo thời gian. Dịch lên men cho băng acarbose đậm nhất tại 192 giờ và nhạt hơn sau 216 giờ, chứng tỏ acarbose đƣợc sinh tổng hợp nhiều nhất trong khoảng 192 giờ và càng để lâu acarbose sẽ bị chuyển hóa thành các chất khác.
Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong giai đoạn đầu của quá trình lên men từ 24 đến 72 giờ hầu nhƣ không có. Hoạt tính ức chế α- glucosidase của acarbose trong dịch lên men tăng dần theo thời gian từ 18,6% sau 96 giờ lên đến 50,3% sau 168 giờ và đạt cao nhất tại 192 giờ ức chế 55,2%, sau đó hoạt tính lại giảm xuống 52,2% sau 216 giờ (Hình 3.4).
Nhƣ vậy, thời gian thích hợp lên men chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 là 192 giờ, hoạt chất acarbose đƣợc sinh tổng hợp nhiều nhất, thể hiện trên sắc ký đồ TLC có băng ngang chuẩn đậm nhất và hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất (55,2%).
Hình 3.4. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 theo thời gian.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu trƣớc đây, Sun và cs (2012) khi tối ƣu các điều kiện nuôi cấy để tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng A. utahensis ZJB-08196, sau 192 giờ khả năng sinh tổng hợp
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 37
lên men chủng Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose từ 144 đến 192 giờ (Li, et al., 2012, Wei, et al., 2010, Xue, et al., 2013).
3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn maltose
Maltose không chỉ là nguồn carbon quan trọng cung cấp cho xạ khuẩn phát triển sinh tổng hợp acarbose trong môi trƣờng lên men, maltose còn là đơn vị cấu thành trực tiếp trong phân tử acarbose. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nồng độ maltose trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng sinh tổng hợp acarbose (Wang, et al., 2011, Wei, et al., 2010).
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc nuôi trong môi trƣờng MT1 với các
nồng độ matlose khảo sát từ 20, 30, 40, 50 và 60 g/l. Kết quả khảo sát cho thấy khả năng sinh tổng hợp acarbose tỷ lệ thuận với nồng độ maltose. Trên sắc ký đồ TLC (Hình 3.5a) cho thấy, trong tất cả các môi trƣờng có nồng độ maltose khác nhau đều xuất hiện băng acarbose ngang với chuẩn có hệ số Rf = 0,28. Hoạt tính ức chế α- glucosidase của acarbose trong các môi trƣờng cũng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ maltose từ 36,6% tại nồng độ 20 g/l maltose lên đến 51,9% tại nồng độ 50 g/l maltose. Tuy nhiên, khi nồng độ maltose cao (60 g/l) thì hoạt tính ức chế α- glucosidase lại giảm xuống chỉ còn 49,20% (Hình 3.5b).
C 1 2 3 4 5
(a) (b)
Hình 3.5. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng
độ maltose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1-5: nồng độ maltose từ 20 đến 60 g/l, C: chuẩn acarbose
Nhƣ vậy nồng độ maltose thích hợp nhất cho sinh tổng hợp acarbose chủng
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 38
Phần lớn các công trình nghiên cứu trên thế giới đều chỉ ra rằng maltose cần phải duy trì ở nồng độ cao trong suốt quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp acarbose. Wei và cs (2010) khi lên men chủng Actinoplanes A56 trong môi trƣờng có nồng độ
maltose đạt 61,25 g/l, cho năng suất 1043 mg/l acarbose (Wei, et al., 2010). Lên men chủng A. utahensis ZJB-08196 tại nồng độ maltose 50 mg/l cho năng suất 4210 mg/l (Wang, et al., 2011), tại nồng độ maltose ban đầu 43 g/l và maltose đƣợc bổ sung thêm trong suốt quá trình nuôi cấy đã cho năng suất 6113 mg/l (Sun, et al., 2012) thậm chí hàm lƣợng acarbose đạt 6606 mg/l (Xue, et al., 2013).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khẳng định một lần nữa khẳng định hàm lƣợng acarbose đƣợc sinh tổng hợp từ chủng Actinoplanes phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ maltose trong môi trƣờng nuôi cấy. Choi và Shin (2003) cũng đã khẳng định, maltose bán phân tử của acarbose, cần đƣợc duy trì ở nồng độ cao trong môi trƣờng trong suốt quá trình lên men sinh tổng hợp acarbose có hiệu quả (Choi, Shin, 2003).
3.2.3. Ảnh hưởng của nguồn glucose
Glucose là một thành phần quan trọng trong môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật và là thành phần không thể thiếu trong môi trƣờng lên men chủng Actinoplanes sp.
KCTC 9161 sinh tổng hợp acarbose. Glucose tác động chủ yếu lên quá trình sinh trƣởng của xạ khuẩn, đảm bảo cho xạ khuẩn tồn tại phát triển khỏe mạnh để tổng hợp các hợp chất cần thiết khác có vai trò quan trọng đối với sự sống, môi trƣờng và con ngƣời.
Glucose đƣợc đƣa vào môi trƣờng MT1 với các nồng độ khác nhau từ 10, 20, 30, 40 và 50 g/l nuôi ở 28oC, 200 vòng/phút trong 192 giờ. Hàm lƣợng acarbose tăng tỷ lệ thuận với sự tăng nồng độ glucose trong môi trƣờng thể hiện ở hoạt tính ức chế α- glucosidase của hoạt chất acarbose (Hình 3.6b). Hoạt tính ức chế của hoạt chất acarbose trong các môi trƣờng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ glucose, nồng độ glucose tăng từ 10 đến 30 g/l hoạt tính tăng từ 29,3 đến 43,1%. Ở nồng độ 50 g/l glucose hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất đạt 44,4%, tuy nhiên khi nồng độ
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 39
glucose tăng từ 30 lên 40 và 50 g/l thì hoạt tính ức chế của hoạt chất acarbose trong môi trƣờng tăng không đáng kể từ 43,1 đến 44,4%.
C 1 2 3 4 5
(a) (b)
Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng
độ glucose đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1-5: nồng độ glucose từ 10 đến 50 g/l, C: chuẩn acarbose
Năng suất sinh tổng hợp acarbose trong các môi trƣờng có nồng độ glucose khác nhau đƣợc thể hiện trên sắc ký đồ TLC (Hình 3.6a). Theo đó, ở nồng độ 30 đến 50 g/l glucose thì băng ngang chuẩn acarbose đậm hơn so với băng acarbose ở các nồng độ glucose thấp hơn, nhƣng tại nồng độ 50 g/l trên sắc ký đồ TLC (làn 5) xuất hiện một băng glucose đậm cao nhất mà những làn khác không có, chứng tỏ glucose vẫn chƣa đƣợc sử dụng hết trong quá trình lên men. Nhƣ vậy để đạt hiệu quả kinh tế cũng nhƣ năng suất acarbose thì nồng độ glucose bổ sung vào môi trƣờng lên men 30 g/l là thích hợp nhất.
Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả của một số tác giả trên thế giời: Wang và cs đã tối ƣu điều kiện lên men sản xuất acarbose của chủng A. utahensis
ZJB-08196 hàm lƣợng acarbose đạt cao nhất ở nồng độ 50 g/l maltose và 30 g/l glucose (Wang, et al., 2011). Nhiều công bố đã chỉ ra rằng nồng độ glucose thích hợp cho sinh tổng hợp acarbose từ Actinoplanes từ 30 đến 40 g/l (Choi, Shin, 2003, Lee, et al., 1997). Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sinh tổng hợp acarbose cao nhất tại nồng độ glucose 30 g/l. (Nguyễn Thị Nƣơng, et al., 2013).
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 40
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn bột ngô
Bột ngô là nguồn cung cấp nitrogen cho xạ khuẩn hoạt động, là nguồn nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền. Việc sử dụng bột ngô làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình sản xuất acarbose mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nồng độ bột ngô có ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161. Với các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20 và 25 g/l bột ngô đƣợc đƣa vào môi trƣờng MT1 sau 192 giờ nuôi cấy, hàm lƣợng acarbose đạt cao nhất ở nồng độ 15 g/l bột ngô (Hình 3.7).
C 1 2 3 4 5 6
(a) (b)
Hình 3.7. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nồng
độ bột ngô đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1-6: nồng độ bột ngô từ 0 đến 25 g/l, C: chuẩn acarbose
Trên sắc ký đồ TLC (Hình 3.7a) cho thấy, khi nồng độ bột ngô thấp 0 đến 5 g/l xuất hiện băng ngang chuẩn acarbose rất mờ, nồng độ bột ngô từ 10 đến 25 g/l xuất hiện băng acarbose đậm ngang với chuẩn và băng đậm nhất ở nồng độ 10 và 15 g/l (làn 3, 4), điều này chứng tỏ hàm lƣợng acarbose cao khi sử dụng bột ngô với nồng 10 đến 15 g/l. Kết quả này còn đƣợc khẳng định bởi hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose cao nhất đạt 54,5% tại nồng độ 15 g/l bột ngô (Hình 3.7b). Tại nồng độ 0 và 5 g/l hoạt tính ức chế của hoạt chất acarbose rất thấp chỉ đạt 25% đến 30%, nhƣng tại nồng độ bột ngô cao 20 và 25 g/l hoạt tính ức chế tăng lên đến 49,8% và 48,0%.
Wei và cs (2010) đã tối ƣu môi trƣờng sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 41
acarbose cao nhất (Wei, et al., 2010). Đỗ Thị Tuyên và cs (2011) đã lựa chọn môi trƣờng sinh tổng hợp acarbose cao từ chủng Actinoplanes VTCC-A1779 và VTCC- A1094 có sử dụng cao bột ngô với nồng độ 10 g/l cho năng suất acarbose cao nhất (Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011).
3.2.5. Ảnh hưởng của pH môi trường
Giá trị pH của môi trƣờng nuôi cấy là một thông số quan trọng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, trao đổi và vận chuyển các chất qua màng tế bào xạ khuẩn, ảnh hƣởng tới các quá trình sinh tổng hợp enzyme và các sản phẩm lên men. Khoảng pH thích hợp cho Actinoplanes phát triển từ 6 đến 9,5 (Schwientek, et al., 2012). Việc xác
định giá trị pH môi trƣờng thích hợp cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc tiến hành.
Môi trƣờng MT1 đã tối ƣu nguồn maltose, glucose và bột ngô có pH đƣợc điều chỉnh 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 và 8,5. Sau 192 giờ nuôi cấy, tất cả các môi trƣờng nuôi cấy đều cho sinh tổng hợp acarbose, có băng đậm ngang chuẩn trên sắc ký đồ TLC và dịch nuôi có hoạt tính ức chế α-glucosidase (Hình 3.8).
1 2 3 4 5 C 6
(a) (b)
Hình 3.8. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của pH
môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1-6: pH từ 6,0 đến 8,5, C: chuẩn acarbose
Hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất tại pH 6,5 với khả năng ức chế của acarbose là 44,8%, tiếp đến là tại các giá trị pH 6,0 và 7,0 với hoạt tính ức chế đạt 38-40%, ở các giá trị pH còn lại từ 7,5 đến 8,5 hoạt tính ức chế đạt thấp dần khi pH
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 42
tăng và khả năng ức chế giảm từ 32,5 đến 31,0%. Nhƣ vậy môi trƣờng có pH trung tính 6,5 đến 7,0 thích hợp cho chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 sinh tổng hợp
acarbose.
Kết quả đạt đƣợc này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, năng suất acarbose đạt cao nhất 3267 mg/l tại pH 7,0 từ chủng A. utahensis
ZJB-08196 (Wang, et al., 2011). pH thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. SN223/29 là 7,2 (Lee, et al., 1997), chủng Actinoplanes sp. A56 là 7,0 (Wei, et al., 2010). Chủng Actinoplanes sp. VTCC-A1779 và VTCC-
A1094 là 7,2 (Quyền Đình Thi, et al., 2012, Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011)
3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 đƣợc phân lập từ trong đất nên có phổ nhiệt độ ƣa thích vừa phải, do đó các nhiệt độ 25, 28, 30 và 37oC đã đƣợc lựa chọn để đánh giá ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose và hoạt tính ức chế α-glucosidase của chủng này.
Kết quả thu đƣợc sau 192 giờ nuôi cấy, nhiệt độ có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp acarbose. Trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu từ 25 đến 37o
C thì nhiệt độ càng thấp khả năng tổng hợp acarbose càng cao thể hiện trên sắc ký đồ TLC, băng ngang chuẩn acarbose đậm nhất tại nhiệt độ 25oC và nhạt dần từ 28 đến 37oC (Hình 3.9a). Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong dịch nuôi cấy cao nhất tại 25oC đạt 47,5%, tuy nhiên tại các giá trị nhiệt độ cao hơn 28 đến 37o
C hoạt tính ức chế α-glucosidase của dịch lên men giảm không đáng kể đạt 42-43%. Nhƣ vậy, nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng
Actinoplanes sp. KCTC 9161 là 25oC. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với khuyến cáo của nhà cung cấp giống (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Hàn Quốc), nhiệt độ thích hợp nuôi lên men là 25-26oC. Tuy nhiên, nhiệt độ này thấp hơn so với các nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy khác trên thế giới, phần lớn các nghiên cứu trƣớc đều chỉ ra nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp acarbose là 27- 28oC (Lee, Egelkrout, 1998, Li, et al., 2012).
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 43
C 1 2 3 4
(a) (b)
Hình 3.9. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của nhiệt
độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1: 25oC; 2: 28oC; 3: 30oC; 4: 37oC; C: chuẩn acarbose
3.2.7. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Để xác định ảnh hƣởng của lƣợng oxy không khí lên sự sinh trƣởng, phát triển và sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161, chủng đƣợc nuôi
trong môi trƣờng MT1 đã tối ƣu tại 25oC với các giá trị tốc độ lắc khác nhau 100, 150, 200 và 220 vòng/phút, sau 192 giờ nuôi, khả năng sinh tổng hợp acarbose và hoạt tính ức chế α-glucosidase đƣợc xác định.
1 2 C 3 4
(a) (b)
Hình 3.10. Sắc ký đồ TLC (a) và hoạt tính ức chế α-glucosidase (b) về ảnh hƣởng của tốc
độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161
1-4: 100-220 vòng/phút; C: chuẩn acarbose
Kết quả cho thấy, tốc độ lắc hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp acarbose. Ở cả 4 giá trị tốc độ lắc thí nghiệm chủng Actinoplanes sp. KCTC
Hà Thị Tâm Tiến Đại học Khoa học tự nhiên
Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 44
9161 đều sinh tổng hợp acarbose. Kết quả đƣợc thể hiện trên sắc ký đồ TLC, cả 4 mẫu xuất hiện băng đậm ngang chuẩn acarbose với hệ số Rf = 0,28. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của hoạt chất acarbose trong cả 4 mẫu dịch nuôi khác nhau không đáng kể và đều đạt trên 40%, đạt cao nhất tại tốc độ lắc 150 vòng/phút đạt 47,3%, tiếp đến tại giá trị tốc độ lắc 200 vòng/phút đạt 46,4%, hoạt tính ức chế của dịch nuôi thấp nhất tại giá trị tốc độ lắc 100 vòng/phút đạt 43,0% (Hình 3.9).
3.2.8. Môi trường và điều kiện nuôi cấy tối ưu
Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi đã xây dựng đƣợc môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng Actinoplanes sp. KCTC 9161 cho khả năng sinh tổng hợp acarbose cao nhất gồm (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium