Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ)

Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ) Nâng cao khả năng sinh tổng hợp và tinh sạch hoạt chất acarbose từ chủng actinoplanes sp KCTC 9161 (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hà Thị Tâm Tiến NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VÀ TINH SẠCH HOẠT CHẤT ACARBOSE TỪ CHỦNG ACTINOPLANES SP KCTC 9161 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội - 2013 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn, sửa luận văn giúp đỡ trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Quang Huy, Phó trƣởng khoa, Phụ trách Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên hƣớng dẫn, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tâp Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ sinh học enzyme, Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, thời gian cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, tập thể Bộ môn Sinh lý thực vật hóa sinh, trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, bảo, giúp đỡ tận tình cho trình thực nghiệm nhƣ chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phòng tổ chức cán bộ, Khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho học hoàn thiện đề tài luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, tháng 11 năm 2013 Học viên Hà Thị Tâm Tiến ii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU .vi DANH MỤC HÌNH VẼ Error! Bookmark not defined BẢNG KÝ HIỆU CHỮ CÁI VIẾT TẮT Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Khái quát acarbose 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose 1.3 Vai trò acarbose .5 1.3.1 Vai trò acarbose bệnh đái tháo đƣờng 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng khác acarbose 1.4 Vai trò Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose .9 1.4.1 Đại cƣơng Actinoplanes .9 1.4.2 Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 10 1.4.3 Ứng dụng Actinoplanes sản xuất acarbose 11 1.5 Nghiên cứu hoạt chất acarbose giới 12 1.5.1 Nghiên cứu sản xuất acarbose 12 1.5.2 Nghiên cứu ứng dụng đột biến vi sinh vật 16 1.5.3 Các phƣơng pháp tinh thu nhận acarbose 17 1.5.4 Nghiên cứu sản xuất acarbose nƣớc 20 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu hóa chất 23 2.1.1 Chủng giống 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Môi trƣờng 23 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Lên men chìm nuôi cấy vi sinh vật 25 iii 2.2.2 Lựa chọn môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 25 2.2.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 26 2.2.4 Ảnh hƣởng nguồn carbon nitrogen nuôi cấy 26 2.2.5 Ảnh hƣởng tốc độ lắc, nhiệt độ pH nuôi cấy 26 2.3 Gây đột biến NTG .26 2.4 Sắc ký lớp mỏng TLC 27 2.5 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose .27 2.6 Tách chiết tinh acarbose 28 2.6.1 Tách chiết tinh sơ 28 2.6.2 Tinh acarbose sắc ký cột 29 2.7 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 31 2.8 Sắc ký lỏng ghép khối phổ 31 2.9 Xác định cấu trúc phân tử acarbose cộng hƣởng từ hạt nhân 31 2.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy 33 3.2 Tối ƣu thành phần môi trƣờng điều kiện nuôi cấy 35 3.2.1 Ảnh hƣởng thời gian 35 3.2.2 Ảnh hƣởng nguồn maltose 37 3.2.3 Ảnh hƣởng nguồn glucose 38 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn bột ngô 40 3.2.5 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng .41 3.2.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 42 3.2.7 Ảnh hƣởng tốc độ lắc .43 3.2.8 Môi trƣờng điều kiện nuôi cấy tối ƣu 44 3.2.9 Xác định hàm lƣợng acarbose HPLC .45 3.3 Gây đột biến chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 46 3.4 Tinh acarbose có hoạt tính ức chế α-glucosidase 48 iv 3.4.1 Chọn lựa phƣơng pháp tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 48 3.4.1.1 Tinh sắc ký hấp thụ silica gel 48 3.4.1.2 Tinh sắc ký lọc gel sephadex G100 49 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính .50 3.4.2 Chọn lựa phƣơng pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than 51 3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 .51 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 51 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose 52 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase .55 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose 56 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận .60 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 23 Bảng 2.2 Danh sách thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng 24 Bảng 2.3 Các môi trƣờng khảo sát nghiên cứu 25 Bảng 3.1 Khối lƣợng chế phẩm qua bƣớc tinh acarbose 55 vi MỞ ĐẦU Đái tháo đƣờng (ĐTĐ) vấn đề sức khỏe mang tính chất toàn cầu, ảnh hƣởng đến nhiều ngƣời, độ tuổi lao động toàn giới Theo thông báo tổ chức y tế giới (WHO) ƣớc tính năm giới có 3,4 triệu ngƣời chết đái tháo đƣờng, 80% ca tử vong xảy nƣớc phát triển Hiện giới có 347 triệu ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng, có 90% số ca mắc đái tháo đƣờng type Chi phí y tế dành cho bệnh tăng lên 465 tỷ USD (Dehghan, Gagari, 2013) Ở Việt Nam, theo tổng hội Y học Việt Nam, năm 2012 có 5,7% dân số mắc ĐTĐ 12,8% số ngƣời mắc rối loạn dung nạp đƣờng Với tỷ lệ bệnh nhân tăng 810% năm, Việt Nam trở thành nƣớc có tỷ lệ gia tăng bệnh ĐTĐ nhanh giới Chi phí điều trị ĐTĐ chiếm 6% ngân sách ngành Y tế hầu hết tập trung cho biến chứng ĐTĐ nhƣ: bệnh tim mạch, tai biến mạch máu não, mù lòa, hoại tử chi, suy thận gây (Công Sơn, Thế Ân, 2013) Các thuốc điều trị ĐTĐ type chủ yếu tập trung vào nhóm chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase nhƣ: acarbose, miglitol, voglibose, 1-deoxynojimycine Acarbose hợp chất hữu giả đƣờng pseudo-oligosaccharide có tác dụng kìm hãm hoạt động α-glucosidase, enzyme chuyển hóa oligosaccharide thành glucose monosaccharide ruột non, với ƣu điểm làm giảm đƣờng huyết sau ăn, không làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ HbA1c, triglyceride giảm biến chứng tiểu đƣờng Do đó, acarbose đƣợc sử dụng rộng rãi điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2, tạo cho bệnh nhân khả kiểm soát hàm lƣợng đƣờng máu tốt sau ăn thức ăn chứa tinh bột Acarbose đƣợc sinh tổng hợp từ chủng vi sinh vật khác nhƣ Streptomyces, đặc biệt chủng Actinoplanes Hiện nay, Việt Nam nhu cầu sử dụng dƣợc phẩm để sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc với giá thành cao, sử dụng thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc nhƣ mƣớp đắng xanh có chứa hoạt chất charantin, glycosid steroid có tác dụng hạ đƣờng máu, làm tăng khả dung nạp glucose ngƣời bệnh; dây thìa canh chứa gymnemic acid làm tăng tiết insulin tuyến tụy; bạch truật có hoạt chất achactan A, B C có tác dụng hạ đƣờng máu; cam thảo đất có hoạt chất amellin làm giảm đƣờng máu triệu chứng bệnh ĐTĐ type Tuy nhiên sử dụng nguồn nguyên liệu từ thảo dƣợc phụ thuộc nhiều vào thời vụ, với hàm lƣợng hoạt chất thấp, số nguyên liệu sử dụng phải nhiều, số thảo dƣợc quý ngày khan Do đó, việc sản xuất hoạt chất sử dụng nguồn vi sinh vật hƣớng nghiên cứu cấp thiết Việc sản xuất acarbose từ xạ khuẩn Actinoplanes mang lại hiệu kinh tế, sản xuất nhanh, chủ động, giá thành thấp sử dụng nguồn nguyên liệu dễ kiếm Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: “Nâng cao khả sinh tổng hợp tinh hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161” khuân khổ đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đƣờng” TS Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm với mục tiêu: (1) Tối ƣu đƣợc môi trƣờng lên men thu nhận hoạt chất acarbose từ Actinoplanes sp KCTC 9161 đạt xuất cao; (2) Nâng cao khả sản xuất hoạt chất acarbose phƣơng pháp gây đột biến; (3) Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh acarbose CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát acarbose Acarbose pseudo-oligosacharide có tên hóa học O{4,6-dideoxy-4[1S(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl]-amino-α-D-glucopyranosyl}-(1→4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranose Acarbose có cấu trúc lõi acarviosyl gồm nửa valienamine liên kết với 4-amino-4,6dideoxyglucose qua liên kết N-glycosidic (Hình 1.1) Acarviosyl liên kết với phân tử maltose qua liên kết α-1,4 tạo nên phân tử acarbose hoàn chỉnh (Truscheit, et al., 1981, Wehmeier, 2003) Acarbose thành phẩm có dạng bột màu trắng, trọng lƣợng phân tử 645,6, hòa tan nƣớc, ethanol, methanol, có pKa 5,1 công thức phân tử C25H43NO18 Hình 1.1 Cấu trúc hóa học acarbose 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose Acarbose chất ức chế cạnh tranh Khả ức chế cạnh tranh acarbose có đƣợc nhờ vào cấu tạo phân tử Acarbose có cấu trúc kích thƣớc gần giống với tetrasachacride: gồm có bốn tiểu phần nhỏ cấu tạo nên Bốn tiểu phần nối với liên kết α-1,4 giống nhƣ phân tử đƣờng Do đó, acarbose liên kết dễ dàng với α-glucosidase, cạnh tranh vị trí liên kết với oligosaccharide (Hình 1.2) Hình 1.2 Cơ chế hoạt động acarbose ruột non (Bischoff, 1994) Khi ăn, tinh bột bị α-amylase thủy phân thành oligosaccharide; màng ruột non, α-glucosidase tiếp tục thủy phân oligosaccharide, trisaccharide disaccharide thành glucose monosaccharide khác Acarbose liên kết trực tiếp với αglucosidase bề mặt niêm mạc ruột non, liên kết kéo dài từ 4-6 giờ, α-glucosidase liên kết để thủy phân oligosaccharide thành glucose Do bệnh nhân tiểu đƣờng tránh đƣợc tƣợng tăng đƣờng huyết sau ăn Acarbose hoạt tính ức chế lactase không gây tƣợng không dung nạp lactose thể (Công báo số 119, Bộ Y tế, 2012) Hấp thu acarbose: sau uống phần lớn acarbose lƣu lại ống tiêu hóa để đƣợc enzyme tiêu hóa chủ yếu vi khuẩn đƣờng ruột chuyển hóa để acarbose phát huy tác dụng dƣợc lý Dƣới 2% liều uống đƣợc hấp thụ dƣới dạng thuốc có hoạt tính, khoảng 35% liều uống đƣợc hấp thu chậm dƣới dạng chất chuyển hóa đƣợc tạo thành đƣờng tiêu hóa Nồng độ đỉnh acarbose huyết tƣơng khoảng sau uống Nồng độ đỉnh chất chuyển hóa huyết tƣơng từ 14-24 sau uống Chuyển hóa acarbose: acarbose đƣợc chuyển hóa hoàn toàn đƣờng tiêu hóa, chủ yếu vi khuẩn chí đƣờng ruột lƣợng enzyme tiêu hóa 3.4.1.3 Tinh cột than hoạt tính Dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 đƣợc hấp thụ vào than hoạt tính, sau giải hấp thụ ethanol theo gradien nồng độ từ đến 20% để thu acarbose C C 10 11 LC 12 13 14 15 16 C 17 18 19 20 LC 21 22 23 24 C 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 C 35 36 37 38 39 Hình 3.18 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 qua cột than hoạt tính LC: dịch lên men; 1-39: phân đoạn; C: chuẩn acarbose Kết TLC (Hình 3.18) cho thấy dịch qua cột thu đƣợc nhóm: nhóm (600 ml) hỗn hợp dịch than đƣợc rửa nƣớc cất chứa glucose maltose; nhóm (20 ml) cột đƣợc rửa ethanol 5% có maltose chất khác có băng thấp băng maltose sắc ký đồ TLC; nhóm (48 ml) cột đƣợc rửa ethanol 10-15% thu đƣợc băng, acarbose đƣợc đẩy nhóm này, nhiên băng acarbose mờ chứng tỏ hàm lƣợng acarbose thấp; nhóm (46 ml) cột đƣợc rửa ethanol 15% thu đƣợc băng đậm có băng cao chuẩn acarbose ngang chuẩn acarbose, acarbose đƣợc đẩy phần nhóm này; nhóm (40 ml) cột đƣợc rửa ethanol 15% thu đƣợc acarbose tinh có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ TLC; nhóm (26 ml) cột đƣợc rửa ethanol 15-20% chứa nhiều tạp chất có băng 50 acarbose mờ nhiều băng thấp chuẩn acarbose Nhƣ từ 50 ml dịch lên men cho qua cột than hoạt tính thu đƣợc 86 ml dịch chứa acarbose 3.4.2 Chọn lựa phương pháp tinh acarbose từ dịch qua cột than Tập trung phân đoạn có chứa acarbose cột than hoạt tính cô đặc 90% đƣa lên cột sắc ký lần để tinh thu hoạt chất acarbose 3.4.2.1 Tinh sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 Đƣa dịch cô đặc lên cột rửa cột hệ dung môi methanol : nƣớc = 4:1 (v/v) để thu hoạt chất acarbose Kết acarbose đƣợc đẩy từ phân đoạn đến 15 với tạp chất khác (Hình 3.19) Dịch qua cột giống với dịch lên cột chứng tỏ chƣa thu đƣợc hoạt chất acarbose C 10 11 12 13 14 15 Hình 3.19 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion amberlite IRA400 10-15: phân đoạn; C: chuẩn acarbose 3.4.2.2 Tinh sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose Đƣa dịch cô đặc lên cột rửa cột đệm sodium phosphate 0,05 M, pH 6,9, sau thu hoạt chất acarbose dung dịch NaCl đệm sodium phosphate 0,05 M Kết tƣơng tự nhƣ tinh cột amberlite IRA400 acarbose đƣợc đẩy từ phân đoạn đến 11 với tạp chất khác Dịch qua cột giống với dịch lên cột chứng tỏ chƣa thu đƣợc hoạt chất acarbose (Hình 3.20) Kết phù hợp với số nghiên cứu trƣớc (Lin, et al., 2007) Việc sử dụng 51 chất trao đổi ion để tinh hoạt chất acarbose khó đạt đƣợc acarbose có đủ độ tinh C 10 11 Hình 3.20 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE-sepharose 6-11: phân đoạn; C: chuẩn acarbose 3.4.3 Tinh thu nhận acarbose Dịch cô đặc tiếp tục đƣợc tinh cột than hoạt tính 2, mẫu đƣa lên cột rửa 50 ml ethanol 5%, sau rửa 50 ml ethanol 15% Kết dịch tinh gồm nhóm chính: 20 ml chất đƣợc đẩy ra, 30 ml tạp chất đƣợc đẩy ra, có băng cao chuẩn, 10 ml sau acarbose đƣợc đẩy với tạp chất (2 băng), 40 ml cuối thu đƣợc hoạt chất acarbose có băng ngang với chuẩn (Hình 3.21) LC 20 C 21 22 23 24 25 26 27 C 28 29 30 31 32 33 34 35 36 C 37 38 39 40 41 Hình 3.21 Sắc ký đồ TLC phân đoạn tinh acarbose qua cột than hoạt tính LC: dịch lên cột; 20-41: phân đoạn; C: chuẩn acarbose 52 Phân đoạn có chứa acarbose đƣợc cô đặc 90% để loại hết dung môi ethanol sau đƣa lên cột trao đổi cation dạng acid mạnh amberlite XAD 1600T Cột đƣợc rửa nƣớc sau rửa giải hỗn hợp dung môi nƣớc : acetone = 9:1 (v/v) Các phân đoạn có chứa acarbose lại đƣợc chạy qua cột trao đổi anion dạng base yếu amberlite IRA67 rửa giải nƣớc để trung hòa dịch có chứa acarbose Cô cạn phân đoạn chứa acarbose thu đƣợc chất keo không màu Chất keo đƣợc kết tủa methanol tuyệt đối cho chất bột màu trắng Hàm lƣợng acarbose dịch lên men dịch tinh đƣợc xác định hệ thống HPLC ghép khối phổ (Tại Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lƣờng chất lƣợng) Kết sắc ký đồ HPLC (Hình 3.22, 3.23 3.24) cho thấy, mẫu: acarbose chuẩn, dịch lên men dịch acarbose tinh xuất peak thời gian lƣu 0,666 phút, khối lƣợng phân tử 645,6 peak hoạt chất acarbose Hàm lƣợng acarbose dịch lên men đạt 10,48 mg/ml, dịch tinh đạt 191,5 mg/ml cao gấp 18,3 lần so với dịch lên men Hoạt chất acarbose thu đƣợc có độ tinh đạt 98% Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ chuẩn acarbose 53 Hình 3.23 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Hình 3.24 Sắc ký đồ HPLC ghép khối phổ hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 54 Nhƣ tinh đƣợc hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 với kết đƣợc trình bày bảng 3.1 Từ 500 ml dịch lên men với hàm lƣợng 10,48 mg/ml acarbose, qua bƣớc tinh thu đƣợc 20 ml dịch acarbose tinh cô đặc có hàm lƣợng 191,5 mg/ml acarbose Nhƣ vậy, hiệu suất thu hồi sau trình tinh đạt 73,1% acarbose Bảng 3.1 Khối lƣợng chế phẩm qua bƣớc tinh acarbose Các bƣớc tinh Lên cột (ml) Dịch rửa (ml) Dịch acarbose (ml) Dịch lên men 500 - - Dịch acarbose cô đặc (ml) - Cột than 500 6740 1240 100 - - Cột than 100 500 440 50 - - XAD 1600T 50 100 70 50 - - IRA67 50 100 60 20 191,5 3,830 Hàm lƣợng acarbose (g/l) Khối lƣợng acarbose (g) 10,48 5,240 3.4.4 Hoạt tính ức chế α-glucosidase Các phân đoạn chứa acarbose qua sắc ký cột đƣợc tập trung lại kiểm tra hoạt tính ức chế α-glucosidase Hình 3.25 Hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sau qua cột tinh DLM: dịch lên men, DTS: dịch tinh 55 Kết hình 3.25 cho thấy, hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose tinh đạt 68,7%, tăng 1,6 lần so với dịch lên men (42,9%) tăng 4,2 lần so với dịch qua cột than (16,5%) Dịch tinh qua cột amberlite IRA400 DEAE-sepharose có hoạt tính đạt 20,3% 30,29%, cao dịch qua cột than thấp dịch acarbose tinh Dịch qua cột than có hoạt tính đạt 58,0% cao dịch lên men thấp dịch tinh qua hai cột amberlite XAD 1600T IRA67 3.5 Xác định cấu trúc hóa học acarbose Cấu trúc hóa học hợp chất acarbose tinh đƣợc xác định phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Hợp chất acarbose thu đƣợc có đặc điểm nhƣ sau: chất bột màu trắng, khối lƣợng phân tử 645,6, có tỷ lệ phần trăm thành phần 46,5% C; 6,7% H; 2,2% N 44,6% O Sắc ký lớp mỏng cho vệt có hệ số Rf = 0,28 hệ dung môi 94% (ethyl acetate : methanol = 1:1) 6% (nƣớc : acid fomic = 5:2) Hình 3.26 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 56 Phổ 13C-NMR (Hình 3.25) DEPT cho tín hiệu 31 cacbon có nhóm methyl (17,4 ppm), nhóm CH2O, CH (123,7 ppm), C bậc (139,1 ppm) lại nhóm CH-O có độ dịch chuyển hóa học đặc trƣng nhóm CH-OH vòng carbohydrate (65-77,4 ppm) Phổ 1H-NMR (Hình 3.26) cho tín hiệu nhóm methyl (1,30 ppm), nhóm CH (5,85 ppm), nhóm CH đặc trƣng CH-1 vòng đƣờng có nhóm α (5,34; 5,25; 5,18 ppm) nhóm β (4,60 ppm) Ngoài có tín hiệu đặc trƣng nhóm CH2O có độ dịch chuyển hóa học dịch phía trƣờng thấp (4,0-4,19 ppm) Các tín hiệu proton khác nằm vùng từ 3,49-4,00 ppm đặc trƣng cho proton đƣờng Hình 3.27 Phổ proton 1H-NMR hoạt chất acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 Các liệu cho phép gợi ý đến hỗn hợp pseudotetrasaccharite (25C) kết hợp với liệu phổ COSY, HSQC VÀ HMBC (Phụ lục hình P2, P3 P4) 57 cho phép dự đoán cấu trúc hợp chất tinh đƣợc acarbose Khi so sánh liệu phổ với liệu phổ acarbose công bố (Bock, Pedersen, 1984) cho phép khẳng định hợp chất tinh đƣợc acarbose có công thức phân tử C25H43NO18 có cấu trúc nhƣ hình 3.28 OH HO HO O N H OH HO OH OH O HO O OH OH O HO O OH OH Hình 3.28 Cấu trúc phân tử acarbose tinh từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 58 3.6 Quy trình tách chiết tinh acarbose Từ liệu nghiên cứu trên, xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô phòng thí nghiệm Dịch lên men (8 ngày) (1) Hòa vào than hoạt tính pH 3, khuấy giờ, để lạnh sau 12 giờ, rửa đến lần nƣớc cất Hỗn hợp than hoạt tính dịch lên men (2) Nhồi lên cột Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 20%) (3) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột than hoạt tính (Hệ dung môi ethanol từ 5% đến 15%) (4) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 90% Sắc ký cột amberlite XAD 1600T (Hệ dung môi gồm: acetone 10%) (5) Tập trung phân đoạn có hoạt chất acarbose, cô đặc 20% Sắc ký cột amberlite IRA67 (Rửa nƣớc) (6) Dịch acarbose tinh (7) Cô cạn kết tủa methanol acarbose Hình 3.29 Qui trình tinh hoạt chất acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Môi trƣờng điều kiện tối ƣu cho sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 gồm thành phần (g/l): 50 maltose, 30 glucose, 15 bột ngô, 1,0 monosodium glutamate, 2,0 CaCl2, 2,5 CaCO3, 1,0 K2HPO4 điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian 192 giờ, cho suất đạt 9,98 g/l acarbose tăng gấp 3,4 lần so với trƣớc tối ƣu Khả ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose sinh từ Actinoplanes sp KCTC 9161 môi trƣờng tối ƣu tăng 5,4% so với môi trƣờng trƣớc tối ƣu, đạt 54,2% Đã tạo đƣợc dòng đột biến N217 từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 có khả sinh tổng hợp acarbose cao, cho suất 10,94 g/l tăng 0,96 g/l so với chủng tự nhiên cho hoạt tính ức chế α-glucosidase hoạt chất acarbose đạt 52,8% tăng gấp 1,35 lần đối chứng Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh acarbose từ dịch lên men chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 sử dụng kết hợp sắc ký cột than hoạt tính, sắc ký trao đổi cation amberlite XAD 1600T sắc ký trao đổi anion amberlite IRA67 Hiệu suất thu hồi acarbose đạt 73,1% Hoạt chất acarbose thu đƣợc có băng đậm ngang chuẩn sắc ký đồ TLC (Rf = 0,28), có độ tinh 98% Hoạt tính ức chế α-glucosidase dịch acarbose tinh đạt 68,7% tăng 1,6 lần so với dịch lên men Kiến nghị Xây dựng quy trình lên men sản xuất acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 quy mô pilot Thử nghiệm, đánh giá chất lƣợng chế phẩm acarbose tạo ra, định hƣớng sản xuất thuốc điều trị đái tháo đƣờng type 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế (2012), "Dƣợc thƣ quốc gia Việt Nam 2", Công báo số 119, 1, tr 8-12 Lê Văn Chi (2004), "Tăng đƣờng huyết sau ăn", Tạp chí Thông tin Tim mạch học, 8, tr 37-42 Phạm Hữu Điển (2003), "Một số hợp chất thiên nhiên từ thực vật có tác dụng hạ đƣờng huyết", Tạp chí Dược học, (7), tr 10-12 Nguyễn Lân Dũng (2006), Phân loại xạ khuẩn, Thư viện Học liệu mở Việt Nam, tr 1-11 Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dƣợc liệu có tác dụng hạ đƣờng huyết trị tiểu đƣờng", Tạp chí Dược học, (353), tr 7-9 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Nƣơng, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Quyền Đình Thi (2013), "Nghiên cứu thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose Actinoplanes sp KCTC 9161" Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 1, tr 403-406 Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hƣơng, Đỗ Anh Vũ (2008), "Tác dụng hạ đƣờng huyết dây thìa canh Gymnema sylvestre", Tạp chí Dược học, (391), tr 3133 Công Sơn, Thế Ân (2013), Phòng trị bệnh ung thư, tiểu đường, NXB Hồng Đức, Hà Nội 10 Quyền Đình Thi, Đỗ Thị Tuyên, Lê Thị Trang, Lê Thanh Hoàng (2012), "Nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes VTCC-A1779", Tạp chí Hóa học, 50(5A), tr 113-116 11 Quyền Đình Thi, Vũ Văn Hạnh (2011), "Tuyển chọn chủng Bacillus sp sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase để điều trị bệnh đái tháo đƣờng type 2", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 729-735 61 12 Hà Thị Tâm Tiến, Nguyễn Thị Nƣơng, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2013), "Ảnh hƣởng nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 biến thể", Tạp chí Y học Việt Nam, (2), tr 71-75 13 Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi (2011), "Sàng lọc số chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp cao chất acarbose có tính ức chế α-glucosidase", Tạp chí Công nghệ sinh học, 9, tr 861-865 Tài liệu tiếng anh 14 Beenken KE, Hawkins AR, Frost JW, Brown KA (2012), "Impact of extracellular nuclease production on the phenotype of Staphylococcus aureus under in vitro and in vivo conditions", Infect Immun, 80(5), pp 1634-1638 15 Bischoff H (1994), "Pharmacology of alpha-glucosidase inhibition", Eur J Clin Invest, 24(3), pp 3-10 16 Blanch M, Calsamiglia S, Devant M, Bach A (2010), "Effects of acarbose on ruminal fermentation, blood metabolites and microbial profile involved in ruminal acidosis in lactating cows fed a high-carbohydrate ration", J Dairy Res, 77, pp 123-128 17 Bock K, Pedersen H (1984), "The solution conformation of acarbose", Carbohydrate Research, (132), pp 142-149 18 Cavalleri B, Pagani H, Volpe G, Selva E, Parenti F (1884), "A new antibiotic from Actinoplanes: fermentation, isolation and prelimilary physico-chemical characteristics", The Journal of Antibiotics, 37(4), pp 309-317 19 Choi BT, Shin CS (2003), "Reduced formation of by product component C in acarbose fermentation by Actinoplanes sp CKD 485-16", Biotechnol Prog, 19, pp 1677-1682 20 Cordero BF, Obraztsova I, Couso I, Leon R, Vargas MA, Rodriguez JF (2011), "Enhancement of lutein production in Chlorella sorokiniana by improvement of cuture conditions and random mutagenesis", MarDrugs, 9(9), pp 16071624 62 21 Couch JN (1950), "Actinoplanes, a new genus of the actinomycetales", Journal of the Elisha Michell Scientific Society, (66) 22 Dehghan P, Gagari BP (2013), "Efects of high performance inulin supplementation on glucemic status and lipid profile in women with type diabetes: A randomized, Placebo-controlled cilinical trial", Health Promotion Perspectives, 3(1), pp 55-63 23 Frommer W, Junge B, Muller L, Schmidt D (1979), "New enzyme inhibitors from microorganisms", Planta Med, 35(3), pp 195-217 24 Frommer W, Plus W, Schafer D, Schmidet D (1975), "Glycoside-hydrolase enzyme inhibitors", United States Patent, US 3876766 25 Hayashim T (2008), "The alpha-glucosidase inhibitor acarbose reduces the net electronegative charge of low-density lipoprotein in patients with newly diagnosed type diabetes", Clin Chim Acta, 390, pp 110-114 26 Hemker M, Stratmann A, Goeke K, Schroder W, Lenz JG, Piepersberg W, Paper H (2001), "Identification, cloning, expression and charecterization of the extracellular acarbose-modifying glycotransferase, AcbD from Actinoplanes sp strain SE50", Journal of Bacteriology, 183(15), pp 4484-4492 27 Hong CL, Kim KH, Choi BT, Choi S, Choi R (2003), "Process for preparing acarbose with high purity", United States Patent, US 6649755B1 28 Hu ZC, Zheng YG (2011), "Enhancement of 1,3-dihydroxyacetone production by a UV-induced mutant of Gluconobacter oxydans with DO control strategy", Appl Microbiol Biotechnol, 165(5-6), pp 1152-1160 29 Huh JH, Kim DJ, Zhao XQ, Li M, Jo YY, Yoon TM (2004), "Widespread activation of antibiotics biosynthesis by S-adenosylmethionine in Streptomycetes", FEMS Microbiol Lett, 238, pp 439-447 30 Jung H, Jeya M, Kim S, Kumar SR, Zhang Y, Lee J (2009), "Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspective", Applied Microbiology and Biotechnology, 84(3), pp 417-428 31 Keri V, Deak L (2002), "Method for purification of acarbose", United States Patent, US 20020183262A1 63 32 Klein A, Selber K, Wehlmann H, Rosen W, Puhler A, Schwientek P, Kalinowski J, Wehmeier UF (2013), "New Actinomycete intergrative and conjugative element from Actinoplanes sp SE50/110 as plasmid for genetic transformation of related Actinobacteria", International Publication Number, WO 2013/083566 A1 33 Lange PM, Rauenbusch E (1987), "Polymers for the purification of acarbose", United States Patent, US 4666776 34 Lechevalier H, Lechevalier M (1970), "In the Actinomycetales", Veb G Fisher, pp 393-405 35 Lee JS, Hai T, Paper H, Kim TJ, Suh JW (2008), "Three trehalose synthetic pathways in the acarbose-producing Actinoplanes sp SN223/29 and evidence for the Tre role in biosynthesis of component C", Appl Microbiol Biotechnol, 80(5), pp 767-778 36 Lee S, Saueribrei B, Niggemann J, Egelkraut E (1997), "Biosynthesic studies on the alfa-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp source of the maltose unit", J Antibiot (Tokyo), 50, pp 767-778 37 Lee SS, Egelkrout E (1998), "Studies on the a-glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.: glutamate is the primary source of the nitrogen in acarbose", J Antibiot, 51(11), pp 225-227 38 Li KT, Hou J, Wei SJ, Cheng X (2012), "An optimized industrial fermentation processes for acarbose production by Actinoplanes sp A56", Bioresource Technology, 118, pp 580-583 39 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CH (2007), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 7253278 B2 40 Lin CL, Huang TL, Chen JK, Wu CS (2005), "Purification process for manufacturing a high pure acarbose", United States Patent, US 20050118686A1 41 Mahmud T (2003), "The C7N aminocyclitol family of natural products", Nat Prod Rep, 20, pp 137-166 64 [...]... các thành phần cơ bản và các thông số trong quá trình lên men sinh tổng hợp acarbose Nhằm nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu bổ sung thêm các chất cảm ứng để tăng khả năng sinh tổng hợp sinh acarbose trong quá trình lên men Sun và cs (2012) công bố mô hình lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng A utahensis ZJB-08196 với năng suất 6113 mg/l acarbose thông qua quá... nhiệt độ bảo quản đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 và các biến thể Kết quả cho thấy, nhiệt độ bảo quản ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển và hiệu suất sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp VTCC-A1779 và 2 dòng đột biến A242, A313 Các chủng dòng Actinoplanes sp sinh trƣởng tốt nhất và ổn định nhất khi bảo quản ở -80C Sinh tổng hợp acarbose đều ổn định sau... Thời gian thích hợp cho sinh 21 tổng hợp acarbose cao ở 168 giờ, 28C với tốc độ lắc 200 vòng/phút Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất đạt 52,24% trong môi trƣờng lên men MT1 (Nguyễn Thị Nƣơng, et al., 2013) 22 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và hóa chất 2.1.1 Chủng giống Chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC 9161 sinh tổng hợp acarbose cao, do Bảo tàng... thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp acarbose của chủng Actinoplanes sp KCTC 9161, nguồn cacbon và nitơ sẽ đƣợc bổ sung vào môi trƣờng theo nồng độ khác nhau để chọn đƣợc nồng độ tối ƣu 2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 đƣợc nuôi trong môi trƣờng lên men thích hợp đã chọn đƣợc ở mục 2.2.2 trong điều kiện 28oC, 200 vòng/phút để khảo sát khả năng sinh tổng hợp acarbose. .. tạo thành acarbose (Mahmud, 2003) 1.5.2 Nghiên cứu về ứng dụng đột biến trên vi sinh vật Để nâng cao tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật, nhiều phƣơng pháp gây đột biến đã đƣợc sử dụng nhằm tác động vào vật chất di truyền làm thay đổi các đặc tính sinh học của vi sinh vật, đặc biệt là gây đột biến trên Actinoplanes để nâng cao khả năng sinh tổng hợp acarbose Lee và cs (2008)... cho khả năng sinh tổng hợp acarbose 20 cao Kết quả từ 12 chủng Actinoplanes sp nghiên cứu đã lựa chọn đƣợc 6 chủng sinh tổng hợp acarbose cao dựa trên sắc ký đồ TLC và hoạt tính ức chế αglucosidase Môi trƣờng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose chủng Actinoplanes sp gồm (g/l): 30 glucose, 30 maltose, 10 bột ngô, 20 bột đậu tƣơng, 1 monosodium glutamate, 2 CaCl2, 0,5 FeSO4, 1 K2HPO4 và 2,5 CaCO3,... 2,5 CaCO3, pH 7,2 Chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp acarbose cao nhất sau 144 giờ nuôi cấy, ở 28C Chủng Actinoplanes sp VTCC-A1094 và VTCC-A1779 có hoạt tính ức chế α-glucosidase cao nhất lần lƣợt là 92% và 81% (Đỗ Thị Tuyên, et al., 2011) Quyền Đình Thi và cs (2011) đã tiến hành nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ các dòng đột biến Actinoplanes sp VTCC-A1779 Kết quả cho thấy, từ 60 dòng đột biến,... đều ổn định sau khi bảo quản ở 4C, -20C, với hoạt tính ức chế α-glucosidase ổn định so với chủng gốc (Hà Thị Tâm Tiến, et al., 2013) Nguyễn Thị Nƣơng và cs (2013) khi tối ƣu thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 cho thấy: Môi trƣờng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 bao gồm (g/l): 30 maltose, 30 glucose,... một chủng tự nhiên Actinoplanes sp SE50 khác đƣợc phân lập gọi là Actinoplanes sp SE50/110 (Actinoplanes sp KCTC 9161) đã sản xuất acarbose lên tới 1 g/l và từ đó chủng này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu về gene sinh tổng hợp acarbose, chức năng mã hóa enzyme của nó (Klein, et al., 2013, Schwientek, 2012) 11 Cụm gene (acb) sinh tổng hợp acarbose trong Actinoplanes sp SE50/110 đã đƣợc... phần C từ 289 mg/l xuống còn 107 mg/l (Xue, et al., 2013) Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, Wei và cs (2010) đã tối ƣu môi trƣờng lên men cho chủng Actinoplanes sp A56 sinh tổng hợp acarbose Thực hiện phƣơng pháp tối ƣu toán học để nghiên cứu ảnh hƣởng của glucose, maltose, dịch chiết ngô, bột đậu tƣơng và monosodium glutamate đến sinh tổng hợp acarbose Kết quả cho thấy maltose và dịch ... môi trƣờng lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 cho thấy: Môi trƣờng thích hợp cho lên men sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp KCTC 9161 bao gồm (g/l):... Actinoplanes để nâng cao khả sinh tổng hợp acarbose Lee cs (2008) nghiên cứu cụm gene Tre X-Y-Z, TpS1 TreS sinh tổng hợp trehalose từ chủng Actinoplanes sp SN223/29, xác định đƣợc gene sinh tổng. .. tiến hành nâng cao sinh tổng hợp acarbose từ dòng đột biến Actinoplanes sp VTCC-A1779 Kết cho thấy, từ 60 dòng đột biến, chọn đƣợc dòng sinh tổng hợp acarbose cao chủng gốc dòng có hoạt tính