Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp actinomycin d của streptomyces

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ    SINH  STREPTOMYCES 21.123  4 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ    SINH  STREPTOMYCES 21.123  CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học:    Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.  người đã hướng dẫn, ân cần chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên   môn C lý Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin cảm ơn đến ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài cao học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong suốt thời gian qua. Do thời gian có hạn, nên trong luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và bạn bè để đề tài hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 8 năm 2014 Học viên Tạ Thu Lan  N  DANH    1 CH 2  2 1.1.1. Một số đặc điểm 2 1.1.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 2 1.1.3. Phân loại chi Streptomyces 3  3 1.2.1. Sàng lọc ngẫu nhiên 3 1.2.2. Đột biến nhân tạo 4 1.2.3. Nghiên cứu các điều kiện lên men 4  4  5 1.5. Kháng sinh Actinomycin D 8  8  9 1.6.1. Phổ hồng ngoại (IR) 9 1.6.2. Phổ tử ngoại (UV-VIS) 9 1.6.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 9 1.6.4. Khối phổ (MS) 10 Streptomyces 21.123 11  11 1.8.1. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D 11 1.8.2. Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 13 CH 15  15 2.1.1. Vi sinh vật 15 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 15 2.1.3. Một số dụng cụ, máy móc 15 2.1.4. Môi trường 15 2.1.5. Vật liệu dùng trong sắc ký 16 2.2. Ph 16 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 17 2.2.3. Phương pháp cải tạo giống 18 2.2.4. Phương pháp lên men sinh tổng hợp kháng sinh 20 2.2.5. Phương pháp chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 20 2.2.6. Thu bột kháng sinh bằng phương pháp cất quay 21 2.2.7. Phương pháp tinh chế kháng sinh bằng sắc ký 21 CH 23  23  23  24  25  26   tr 28  29  29  30   34 3.4.1. Kết quả phổ tử ngoại và đo nhiệt độ nóng chảy 34 3.4.3. Phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 36 CH 45 Streptomyces 21.123. 45  46  48  48  48  49  54  ATCC American Type Culture Collection ESI-MS Electronstray Ionisation Mass Spectrometry ĐB Đột biến ISP International Streptomyces Project (chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh HTKS Hoạt tính kháng sinh MT1 Môi trường 1 MT1dt Môi trường 1 dịch thể SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên STHKS Sinh tổng hợp kháng sinh VSV Vi sinh vật NMR Nuclear Magnetic Resonance COSY Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HSQC Heteonuclear Single Quantum Coherence HMBC Heteonuclear Multiple Bond Correlation  Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính KS sau SLNN chủng Streptomyces 21.123 Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 1 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 2 Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính KS sau đột biến lần 3 Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính KS chọn biến chủng lên men chìm tốtnhất Bảng 3.6: Kết quả thử hoạt tính KS chọn dung môi Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.8: Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 1 Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần2 Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn có hoạt tính KS lần 2 Bảng 3.11: Thành phần kháng sinh tinh khiết thu được Bảng 3.12: Kết quả phổ UV Bảng 3.13: Các đặc trưng của phổ NMR của chất 2 so với actinomycin D Bảng 3.14: Các đặc trưng của phổ NMR của chất 1 so với actinomycin D  Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của actinomycin D Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của actinomycin X 2 và actinomycin D 1  Công nghệ kháng sinh, công nghệ sản xuất ra các dược chất kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm trùng, kể cả các bệnh ung thư là công nghệ gốc, các nước phát triển sở hữu loại công nghệ này, còn các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam gặp nhiều khó khăn trong việc làm chủ, phát triển công nghệ kháng sinh. Nghiên cứu kháng sinh ngày nay phát triển theo 3 hướng chính bao gồm lên men sinh tổng hợp, bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần, trong đó hướng sinh tổng hợp kháng sinh với nhiều ưu điểm được sử dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới. Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội trong nhiều năm qua đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D một kháng sinh chống ung thư. Năm 2007-2011, bộ môn đã thực hiên đề tài nghiên cứu về chủng xạ khuẩn này và thu được một số kết quả nhất định, kháng sinh tổng hợp được có tác dụng tốt trên nhiều vi khuẩn nhưng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh còn thấp, kháng sinh cuối cùng thu được độ tinh khiết chưa cao. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp actinomycin D của Streptomyces 21.123” làm luận văn thạc sĩ để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về chủng xạ khuẩn này. Luận văn mong muốn đạt được những mục tiêu sau đây: 1. Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp actinomycin D. 2. Cải thiện khả năng chiết xuất và tinh chế actinomycin D từ hỗn hợp kháng sinh thu được. 2   1.1.1. Một số đặc điểm Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là vi khuẩn Gram dương, phát triển thành hệ sợi phân nhánh, có tỷ lệ G+C thường lớn hơn 55%, phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: kháng sinh, enzym, vitamin, acid hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. 1.1.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces Streptomyces làm một chi thuộc bộ Actinomycetales, với hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh, ít khi đứt đoạn, đường kính từ 0,5-2,0 m. Các đại diện chi này có hệ sợi khí sinh và hệ sợi cơ chất phát triển phân nhánh. Sợi cơ chất mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi hệ sợi khí sinh dạng phấn, đôi khi có tính kỵ nước. Xạ khuẩn chi Streptomyces chủ yếu sinh sản vô tính bằng bào tử . Trên đầu sợi khí sinh hình thành chuỗi sinh bào tử với hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces và môi trường nuôi cấy. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces là các vi khuẩn hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối thích thường là 25- 30C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh) [...]... là Streptomyces padanus có khả năng tổng hợp Actinomycin X2 một kháng sinh chống ung thư đang được nghiên cứu với nhiều triển vọng [32] 14 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguy n liệu 2.1.1 Vi sinh vật Giống xạ khuẩn: Chủng Streptomyces 21.123 đã qua phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao, phổ tác d ng rộng, do bộ môn Vi sinh và Sinh học, trường Đại học D ợc... năng sinh tổng hợp actinomycin D, các tác giả Ấn Độ đã nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp actinomycin D gấp 400% ( 400 mg/l so với ban đầu là 80mg/l) Kết quả cho thấy việc sử d ng UV và các tác nhân gây đột biến vẫn là những tác nhân quan trọng trong việc nâng cao hiệu xuất sinh tổng hợp kháng sinh từ vi sinh vật [30] 1.8.2 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 Chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29... trạng) Kết quả d n đến mất (giảm) khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc tăng khả năng sinh kháng sinh (đột biến d ơng tính) Để cải tạo chủng giống có hiệu suất cao cần tiến hành đột biến bậc thang và kết hợp các tác nhân đột biến Từ chủng Penicillin chrysogenum đầu tiên chỉ có khả năng sinh tổng hợp 60 mg/l sau quá trình đột biến cải tạo giống đã có những chủng có khả năng sinh tổng hợp 85000... tập hợp thành một khối phổ đồ 10 Khối phổ cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận d ng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [2], [6], [16] 1.7 Các nghiên cứu về chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 Trong khóa luận “ Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 21.123” năm 2007 của tác giả Nguyễn Thị Hải Vân và luận văn “ Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp. .. sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình d ng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon Ngoài ra, kỹ thuật xác định trình tự gen đã và đang được áp d ng để phân loại Streptomyces [21] 1.2 Cải tạo giống xạ khuẩn tổng hợp kháng sinh Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ các cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính thấp Vì vậy, muốn thu được chủng có hoạt tính cao để đưa... tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 21.123” của tác giả Hoàng Thị Thùy Hương năm 2009 đã cho thấy những kết quả nghiên cứu ban đầu về chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 Chất kháng sinh do Streptomyces 21.123 là hướng sinh tổng hợp kháng sinh ngoại bào có phổ kháng khuẩn với 10 vi khuẩn kiểm định, có hoạt tính tốt nhất tại pH bằng 9 Chất kháng sinh từ d ch lọc có thể được chiết bằng nhiều dung môi hữu... được phân lập Streptomyces sindenensis có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D Trong nghiên cứu nhóm tác giả đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện và thành phần môi trường lên men kết quả thu được từ chủng ban đầu có hoạt tính kháng sinh 80mg/ l, sau quá trình tối ưu, áp d ng vào lên men thu được 365 mg/ l sinh khối với tốc độ cấp khí 1.5 vvm, tốc độ khuấy 660 rmp [29], [31] Trong một nghiên cứu khác được... sinh lý Hỗn d ch này được bổ sung vào môi trường lên men bề mặt trong điều kiện các yếu tố môi trường tối ưu, và nguồn carbon và nitơ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp kháng sinh Nồng độ kháng sinh cao nhất đạt được là 17.150 mg/kg cơ chất đi kèm với bổ sung dung d ch vi lượng để sinh tổng hợp kháng sinh đạt mức trên : Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong môi + trường lỏng * Ưu điểm: D ... trúc hóa học của Actinomycin D a) Cấu trúc hóa học Actinomycin D là một kháng sinh chromopeptid chống ung thư được phân lập từ rất nhiều loài Streptomyces sp Actinomycin D được cục quản lý D ợc phẩm Hoa Kỳ cấp số đăng ký vào tháng 10 năm 1964 và được đưa ra thị trường bởi hãng d ợc phẩm Merck Sharp d ới tên thương mại là Cosmegen Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra khoảng hơn 30 loại actinomycin, ... hoạt tính kháng sinh của 50 biến chủng ở bảng trên ta có thể nhận thấy đột biến bằng HNO2 cho kết quả thu được các biến chủng có khả năng sinh tổng hợp cao so với biến chủng ĐBII 27 mang đi đột biến Sau ĐB 3 d ng chủng Streptomyces 21.123 thu được các biến chủng 8, 37, 45 có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất được giữ lại cho nghiên cứu tiếp theo 3.2 K t quả chọn lọc bi n chủng tổng hợp kháng sinh tốt nhất . nghệ kháng sinh. Nghiên cứu kháng sinh ngày nay phát triển theo 3 hướng chính bao gồm lên men sinh tổng hợp, bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần, trong đó hướng sinh tổng hợp kháng sinh với nhiều. phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có chủng xạ khuẩn Streptomyces 21.123 có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D một kháng sinh chống ung thư. Năm 2007-2011,. sinh còn thấp, kháng sinh cuối cùng thu được độ tinh khiết chưa cao. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp actinomycin D của Streptomyces 21.123” làm