P ơ g p áp à g ọ g u i
+ Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 21.123 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn
dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 (nồng độ định ước). Sau đó pha loãng
tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
+ Phân tán hỗn dịch bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml
hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-5 đến 10-6 nhỏ vào đĩa
Petri chứa MT1. Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Mỗi nồng độ tiến hành trên 3 đĩa. Cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm 28 ºC – 29 ºC.
+ Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Sau 6 ngày để trong tủ ấm, các khuẩn lạc xạ khuẩn đã phát triển. Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đa dạng, mọc riêng rẽ cấy zigzag lên đĩa Petri có môi trường MT1, để vào
tủ ấm 6 ngày ở 28 – 29 0
C rồi thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.
P ơ g p áp iế
+ Bằng ánh sáng UV
* Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces
21.123 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều, thu
* Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6, nhỏ vào hộp Petri có môi trường MT1, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.
* Đột biến bằng ánh sáng UV: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1 đổ
ra đĩa Petri vô trùng. Chiếu ánh sáng UV ( = 254 nm) vào hỗn dịch bào
tử đặt cách nguồn phát 60 cm, trong thời gian 4 - 5 phút. Lấy ra để vào
chỗ tối 2 giờ, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5
.
* Phân tán bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml hỗn
dịch bào tử sau đột biến ở các nồng độ 10-4
, 10-5, nhỏ vào hộp Petri có
MT1, dàn đều bằng que chang vô trùng rồi cho vào tủ ấm 28 ºC – 29 ºC. Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức: % độ sống sót =
0
N Nm
x 10-6+k x 100%
Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến.
N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
10-k : Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng.
* Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến, cấy zigzac ra hộp Petri. Làm song song mẫu chứng. Sau 6 ngày để trong tủ ấm 28 ºC – 29 ºC, thử hoạt tính kháng sinh. Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức:
% biến đổi hoạt tính =
0 D mi D x 100% Với:
Dmi: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng
thứ i sau đột biến.
D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
* Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2
* Pha hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces
21.123 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc đều, thu được
hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 (nồng độ định ước). Sau đó lấy 1
ml pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng.
* Hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6, nhỏ vào hộp Petri
có môi trường thạch, dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng.
* Đột biến bằng acid nitrơ: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1 cho
thêm 0,07g NaNO2. Điều chỉnh pH xuống 4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N,
để yên trong 2-3 phút. Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch
NaOH 0,1N , rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5
.
* Phân tán bào tử sau đột biến, tiến hành khảo sát sau đột biến, tính toán kết quả, chọn lọc ngẫu nhiên các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV.