Nghiên cứu kháng sinh do streptomyces 184 21 tổng hợp

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ YẾN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO Streptomyces 184.21 TỔNG HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ YẾN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO Streptomyces 184.21 TỔNG HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo PGS-TS Cao Văn Thu- người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, các cán bộ, kĩ thuật viên giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Bộ môn Hóa vật liệu- khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11, tháng 5, năm 2015 Sinh viên PHẠM THỊ YẾN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh. 2 1.1.1. Định nghĩa về kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh 2 1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh 3 1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 4 1.2.2. Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 5 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn 6 1.3. Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 6 1.4. Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn………………………………7 1.4.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 7 1.4.2. Đột biến cải tạo giống 7 1.4.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 8 1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. 8 1.6. Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9 1.7. Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh 10 1.7.1. Phổ hồng ngoại (IR) …….10 1.7.2. Phổ tử ngoại (UV)…………………………………………… 11 1.7.3. Phổ khối (MS)………………………………………………………… 11 1.8. Một số nghiên cứu liên quan 11 1.8.1. Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày . 11 1.8.2. Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces. 12 1.8.3. Xác định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces ambofaciens…………12 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 14 2.1.1. Nguyên vật liệu…………………………………………………………14 2.1.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ………………………………………. …….17 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp thực nghiệm. 17 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống……………………………………17 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán …….18 2.3.3.Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp…………… …….19 2.3.4. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên ………………………………………………………………………………19 2.3.5. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV……… ……………… 19 2.3.6. Đột biến hóa học bằng HNO 2 ………………………………………… 20 2.3.7. Phương pháp lên men mẻ…….…………………………………………21 2.3.8. Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men ………………………………………………………………………21 2.3.9. Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ. ……22 2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký……………………………22 2.3.11. Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết……………… ……23 2.3.12. Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu được… ……………24 2.3.13. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP……………………………24 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN. 25 3.1. Kết quả thử hoạt tính của Streptomyces 184.21 khi phân lập 25 3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định. 25 3.3. Nghiên cứu hình thái của Streptomyces 184.21 27 3.4. Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên. 27 3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần………………………………………… 29 3.6. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 31 3.7. Kết quả đột biến kháng sinh sau đột biến hóa học. 32 3.8 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh…………………………… …….33 3.9. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc……………………………………………………………… …….35 3.10. Kết quả chọn dung môi chiết xuất KS…………………………………….36 3.11. Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi………………… 37 3.12. Kết quả sắc kí cột………………………………………………………….38 3.13. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được………………………………………… 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CW Cell wall (Thành tế bào) DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr Gram Gr (+) Gram dương Gr (-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Infrared (Hồng ngoại) L-DAP L-diaminopimelat acid MS Mass spectrometry (Phổ khối) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P. mirabilis Proteus mirabilis RAPD Random amplified polymorphic DNA (ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên) S. aureus Staphylococcus aureus SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TK Tinh khiết UV Ultraviolet (Tử ngoại) VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Nội dung Bảng 1.1 Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định Bảng 2.2 Các môi trường kiểm định Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 184.21 trên vi khuẩn khi phân lập Bảng 3.2 Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 184.21 trên 5 loại môi trường Bảng 3.3 Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 184.21 theo ISP Bảng 3.4 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 184.21 Bảng 3.5 Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 1 Bảng 3.6 Kết quả hoạt tính KS sau đột biến lần 2 Bảng 3.7 Kết quả hoạt tính KS sau đột biến hóa học Bảng 3.8 Kết quả chọn môi trường lên men Bảng 3.9 Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày, 5 ngày Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của KS trong dịch lọc Bảng 3.12 Kết quả thử chiết kháng sinh bằng 5 DMHC ở 5 pH khác nhau Bảng 3.13 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ( hiện hình VSV bằng E. coli) Bảng 3.14 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 Bảng 3.15 Kết quả sắc kí lớp mỏng các phân đoạn 3-7 Bảng 3.16 Kết quả chạy cột lần 2 Bảng 3.17 Kết quả chạy cột lần 3 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Tên hình Nội dung Phụ lục P1 Hình dạng chuỗi bào tử Streptomyces 184.21 Phụ lục P2 Bề mặt bào tử Streptomyces 184.21 Phụ lục P3 Phổ UV-VIS của kháng sinh do chủng Streptomyces 184.21 sinh tổng hợp. Phụ lục P4 Kháng sinh tinh 1 do Streptomyces 184.21 tổng hợp Phụ lục 5 Phổ hồng ngoại IR do Streptomyces 184.21 tổng hợp Phụ lục P6 Phổ khối MS do Streptomyces 184.21 tổng hợp Phụ lục P7 Thử hoạt tính KS pha dung môi và pha nước ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng ức chế S. aureus của Penicillin được phát hiện vào tháng 10/1928 và Penicillin được sử dụng vào năm 1943 đã mở ra kỉ nguyên mới trong y học lâm sàng và nghành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh. Ngoài được sử dụng trong dự phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm, bệnh ung thư cho người, kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi, trồng trọt và công nghiệp thực phẩm. Do được sử dụng tràn lan và không đúng cách nên tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng. Nhận thức được vai trò quan trọng của các kháng sinh trong đời sống nói chung, y học nói riêng, hiệu quả kinh tế to lớn mà ngành công nghiệp kháng sinh mang lại, cùng với mối lo về tình trạng đa kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia tăng, các nhà khoa học vẫn đang ngày đêm nghiên cứu để tìm ra các kháng sinh mới. Hiện nay các nhà khoa học đã phát minh hơn 16.000 chất kháng sinh, hàng năm lại có khoảng hơn 100 kháng sinh mới được công bố và một số được đưa vào sử dụng, nên việc tìm ra một kháng sinh mới là rất khó. Phương pháp chủ yếu để tìm ra các kháng sinh mới hiện nay vẫn là phương pháp sinh học- nghiên cứu các chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường ĐH Dược Hà Nội, chúng tôi đã chọn đề tài” Nghiên cứu kháng sinh nhờ Streptmyces 184.21 tổng hợp” với các mục tiêu như sau: - Sơ bộ xác định hình thái Streptomyces 184.21 theo ISP. - Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh của Streptomyces 184.21. - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích. - Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được. 1 [...]... thời, họ cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của kháng sinh do 15 loài xạ khuẩn này sinh ra Các loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên ong bắp cày giúp bảo vệ loài ong này khỏi các vi sinh vật gây bệnh, và chúng có thể là nguồn cung cấp những kháng sinh tự nhiên mới mà các nhà nghiên cứu dược phẩm quan tâm 1.8.2 Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh ở Alicyclobacillus,... Toshiba 60W, điện thế 220V 17 2.2 Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu xác định hình thái  Cải tạo chủng xạ khuẩn ban đầu  Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh  Nghiên cứu một số đặc tính của kháng sinh do chủng xạ khuẩn sinh ra 2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1.Phương pháp nuôi cấy và giữ giống Chủng Streptomyces 184. 21 được cấy zigzac trên ống thạch nghiêng, cho vào tủ ấm 28-300C Sau 6-10... quả thử hoạt tính của Streptomyces 184. 21 khi phân lập - Mục đích: Lựa chọn chủng xạ khuẩn có tính chất tốt để nghiên cứu - Kết quả: Kết quả hoạt tính của Streptomyces 184. 21 được giới thiệu ở bảng 3.1 Bảng 3.1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 184. 21 trên vi khuẩn khi phân lập 184. 21 (mm) s P.mirabilis B.cereus S.aureus E.coli S.typhi S.flexneri 24,05 22,6 21, 6 21, 7 19,81 20,77 1,34... cặp điện tử tự do không tham gia liên kết của O, N, các halogen 1.8 Một số nghiên cứu liên quan 1.8.1 Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp trên ong bắp cày [24] Việc tìm kiếm những kháng sinh mới là rất cần thiết, góp phần giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang tiếp diễn Những nghiên cứu gần đây đã... nghĩa kháng sinh phải bao hàm các chất tổng hợp bằng hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon (pefloxacin, norfloxacin…) 1.1.2.Phân loại kháng sinh[ 9], [10], [11], [15] Có rất nhiều cách khác nhau để phân loại kháng sinh: Phân loại theo nguồn gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh bán tổng hợp) , theo phổ tác dụng (phổ rộng hay chọn lọc), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp. .. chủng Streptomyces 184. 21 có hoạt tính cao hơn các chủng còn lại để nghiên cứu 3.2 Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định  Mục đích: Chọn MT nuôi cấy thích hợp và chủng VSV kiểm định dùng cho các nghiên cứu tiếp theo  Nuôi cấy chủng Streptomyces 184. 21 trên 5 MT, sau đó thử hoạt tính kháng sinh trên 10 chủng VSV kiểm định, kết quả như sau (bảng 3.2) Bảng 3.2: Hoạt tính kháng sinh. .. của iso- even FAs và anteiso-FAs Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở loài S.avermitilis khi có thêm acid pivalic mang lại ba nhánh FAs Ngoài con đường này, cả acid pivalic và acid 2- methylbutyric cũng được kết hợp trong sinh tổng hợp kháng sinh avermectin 1.8.3 Xác định hoạt tính sinh học của một nhóm gồm 51 macrolide bằng cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide trong Streptomyces ambofaciens [23] Nhu cầu... li tâm rồi thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp giếng thạch  Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: Các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch 2.3.8 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men...CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1.Định nghĩa kháng sinh[ 3], [6], [7] Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh Theo các nhà sinh học định nghĩa: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa,... tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nhân, thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học… Song cách phân loại KS theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1.1) Bảng 1.1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Phân loại 1 Kháng Nhóm kháng sinh sinh có Aminoglycosid . tử Streptomyces 184. 21 Phụ lục P2 Bề mặt bào tử Streptomyces 184. 21 Phụ lục P3 Phổ UV-VIS của kháng sinh do chủng Streptomyces 184. 21 sinh tổng hợp. Phụ lục P4 Kháng sinh tinh 1 do Streptomyces. sinh tinh 1 do Streptomyces 184. 21 tổng hợp Phụ lục 5 Phổ hồng ngoại IR do Streptomyces 184. 21 tổng hợp Phụ lục P6 Phổ khối MS do Streptomyces 184. 21 tổng hợp Phụ lục P7 Thử hoạt tính. suất sinh kháng sinh của Streptomyces 184. 21. - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích. - Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được.