Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ streptomyces 184 225

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KIM OANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KIM OANH MÃ SINH VIÊN: 1301314 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 184.225 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu – người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình, hết lòng truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức tạo điều kiện tốt cho em từ ngày nghiên cứu khoa học tới hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ em q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu tồn thể Thầy Cơ giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập trường Cuối cùng, em dành lời cảm ơn đến gia đình thân thương, bạn bè quan tâm, ủng hộ, động viên giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm điều kiện nghiên cứu kiến thức thân có hạn, khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đóng góp ý kiến từ thầy bạn bè để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2018 Sinh viên Nguyễn Kim Oanh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh .2 1.1.2 Phân loại .2 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh .2 1.1.4 Vấn đề đề kháng kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn .4 1.2.3 Một số khóa phân loại xạ khuẩn 1.2.4 Đặc điểm sinh lý dinh dưỡng 1.2.5 Đặc điểm chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 1.3 Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1 Mục đích 1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao sàng lọc ngẫu nhiên 1.3.3 Đột biến cải tạo giống 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men .6 1.4.2 Phương pháp lên men 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men .7 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men .7 1.5.1 Phương pháp chiết xuất 1.5.2 Các phương pháp tinh chế 1.6 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .9 1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS) 1.6.2 Phổ hồng ngoại (IR) 10 1.6.3 Phổ khối lượng (MS) .10 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) .11 1.7 Các nghiên cứu liên quan 11 1.7.1 Nghiên cứu chủng Streptomyces flavogriseus NJ-4 – chủng cho sản xuất actimomycin D holomycin (2017) 11 1.7.2 Hợp chất nhóm actinomycin từ chủng Streptomyces sp RAB12 - tiềm kháng khuẩn cao (2018) 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị .14 2.2.1 Nguyên vật liệu 14 2.2.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1 Chọn lọc, cải tạo giống 16 2.3.2 Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 16 2.3.3 Chiết tách tinh chế kháng sinh 16 2.3.4 Xác định số tính chất cấu trúc kháng sinh thu .16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 17 2.4.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 17 2.4.3 Nguồn hydrat carbon tốt cho môi trường nuôi cấy 18 2.4.4 Phương pháp cải tạo giống .18 2.4.5 Lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 20 2.4.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu .21 2.4.7 Thu kháng sinh thô phương pháp cô quay chân không 21 2.4.8 Tách, tinh chế kháng sinh thô phương pháp sắc ký 22 2.4.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 23 2.4.10 Xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu 23 CHƯƠNG 3: 3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24 Cải tạo giống nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 184.225 24 3.1.1 Kết chọn nguồn hydrat carbon tốt cho môi trường nuôi cấy 24 3.1.2 Kết sàng lọc chọn chủng có HTKS cao 24 3.1.3 Kết đột biến nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 184.225 25 3.2 Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh 27 3.2.1 Chọn môi trường lên men chìm tốt 27 3.2.2 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt .28 3.3 Chiết kháng sinh từ dịch lọc dịch lên men 29 3.4 Tinh chế chất kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu 29 3.4.1 Kết tách kháng sinh sắc ký .29 3.4.2 Kết kết tinh 32 3.5 Kết phổ 33 3.5.1 Kết phổ kháng sinh 33 3.5.2 Kết phổ kháng sinh 37 3.5.3 Kết phổ kháng sinh .38 3.6 Bàn luận 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Đề xuất 40 PHỤ LỤC .45 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT COSY Corelation Spectroscopy – Phổ NMR tương quan D̅ Đường kính trung bình DMHC Dung mơi hữu DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer – Phổ tăng cường không biến dạng nhờ chuyển giao phân cực ĐBHH Đột biến hóa học ĐBUV Đột biến UV Gr (-) Gram âm Gr (+) Gram dương HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coleration – Phổ tương quan đa liên kết dị nhân HR-MS High Resolution Mass Spectrometry – Phổ khối hiệu cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence – Phổ kết hợp lượng tử đơn dị nhân HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Infra red – Hồng ngoại ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế KS Kháng sinh MS Mass spectrometry – Phổ khối MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NMR Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân s Sai số có hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên UV-VIS Ultraviolet-visible spectroscopy – Phổ tử ngoại-khả kiến V Thể tích VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tên vi khuẩn kiểm định Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy VK kiểm định Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) Bảng 2.4 Dung môi sử dụng Bảng 2.5 Các hóa chất sử dụng Bảng 3.1 Kết thử HTKS với nguồn hydrat carbon khác Bảng 3.2 Kết thử HTKS sau SLNN Bảng 3.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần Bảng 3.4 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần Bảng 3.5 Kết thử HTKS sau ĐBHH Bảng 3.6 Kết chọn môi trường lên men Bảng 3.7 Kết lên men chìm dạng chủng, biến chủng MT2dt Bảng 3.8 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.9 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.10 Kết thử HTKS phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.12 Kết SKLM phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.13 Khối lượng kháng sinh tinh khiết hiệu suất tinh chế Bảng 3.14 Các đỉnh hấp thụ nhóm chức đặc trưng KS2 Bảng 3.15 Bảng so sánh đặc trưng phổ NMR KS2 với nhóm phenoxazone Bảng 3.16 Bảng so sánh đặc điểm phổ NMR chất KS2 actinomycin D Bảng 3.17 Các đỉnh hấp thụ nhóm chức đặc trưng KS1 Bảng PB.1 Kết thử HTKS sau SLNN Bảng PB.2 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần Bảng PB.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần Bảng PB.4 Kết thử HTKS sau ĐBHH DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1 Cấu trúc hóa học actinomycin D Hình 3.2 Cấu trúc hóa học actinomycin X2 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học actinomycin F4 Hình PH.1 Sơ đồ chế tác dụng kháng sinh Hình PH.2 Hình ảnh xạ khuẩn cấy zigzac đĩa Petri khuẩn lạc sau ĐBUV1 Hình PH.3 Thử HTKS phương pháp: khối thạch, giếng thạch, khoanh giấy lọc Hình PH.4 Bình chứa dịch lên men Hình PH.5 Hình ảnh chạy sắc ký cột mỏng sau chạy SKLM (lần 1) Hình PH.6 Hiện hình VK Hình PH.7 Kháng sinh sau kết tinh lại Hình PH.8 Hình ảnh kháng sinh 1, kháng sinh 2, kháng sinh tinh khiết (theo thứ tự) Hình PH.9 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình PH.10 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình PH.11 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình PH.12 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình PH.13 Phổ hồng ngoại kháng sinh Hình PH.14 Phổ khối lượng kháng sinh Hình PH.15 Phổ khối lượng kháng sinh Hình PH.16 Phổ khối lượng kháng sinh Hình PH.17 Phổ cộng hưởng từ kháng sinh ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc kháng sinh nghiên cứu sử dụng gần 90 năm qua để điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh truyền nhiễm Từ năm 1940, loại thuốc làm giảm đáng kể bệnh tật tử vong bệnh nhân có hội sống thấp Tuy nhiên, thuốc kháng sinh sử dụng rộng rãi khó kiểm sốt nhiều nước phát triển, với gia tăng đề kháng vi khuẩn theo chế mối đe dọa lớn tới việc điều trị bệnh truyền nhiễm thông thường, dẫn đến bệnh tật kéo dài, tàn tật tử vong Nếu khơng có kháng sinh hiệu để phòng ngừa điều trị nhiễm trùng, thủ thuật y tế cấy ghép nội tạng, hóa trị ung thư, quản lý bệnh tiểu đường phẫu thuật lớn trở nên nguy hiểm Do vậy, vấn đề khám phá nghiên cứu kháng sinh ngày coi trọng trước gia tăng đề kháng vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh Trong số tất chất kháng sinh sản xuất, chi Streptomyces chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần sản xuất khoảng hai phần ba số thuốc kháng sinh thị trường[31] Khám phá chi Streptomyces thu hút ý nhà nghiên cứu cho việc tìm phân lập chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao Trước tình trạng đa kháng thuốc hành, với việc nhận vai trò quan trọng việc sản xuất kháng sinh mới, định tiến hành đề tài: “Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.225” với mục tiêu sau: Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng giống Streptomyces 184.225 Lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kháng sinh Chiết xuất tinh chế kháng sinh Xác định sơ số tính chất cấu trúc kháng sinh thu Bảng PB.1 Kết thử HTKS sau SLNN Kết Dạng P mirabilis chủng Kết B subtilis D̅ Dạng chủng P mirabilis D̅ B subtilis D̅ D̅ (mm) s 21,87 0,84 22,25 0,91 18 22,05 0,37 22,23 0,86 21,86 0,31 22,51 0,36 19 22,25 0,65 22,39 0,46 23,12 0,85 23,18 0,39 20 22,13 0,24 22,83 0,31 23,35 0,62 22,59 0,68 21 21,10 0,55 23,40 1,59 22,20 0,29 21,24 1,84 22 22,16 0,52 23,73 1,73 22,10 1,21 22,19 0,34 23 21,79 0,38 22,93 0,58 22,36 1,16 21,95 1,40 24 22,64 0,28 22,85 0,91 16,39 1,57 19,37 0,55 25 20,65 0,81 22,85 0,85 23,09 0,58 23,23 0,84 26 21,55 0,43 22,80 1,55 10 23,14 0,93 22,63 1,32 27 21,81 0,16 22,98 1,72 11 23,22 0,95 21,86 0,91 28 21,94 0,41 23,54 1,35 12 22,30 0,81 21,88 0,05 29 20,83 0,49 22,57 1,21 13 22,57 0,76 21,80 0,46 30 20,41 1,31 22,87 0,90 14 23,23 1,55 20,55 0,56 31 21,59 0,29 23,20 1,04 15 21,01 0,63 23,18 0,59 32 21,39 0,84 22,04 0,68 16 23,05 0,18 23,27 0,25 33 21,14 0,26 23,21 0,59 17 23,33 0,13 21,95 0,46 34 21,10 0,75 23,18 1,23 (mm) s (mm) s (mm) s Bảng PB.2 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần Kết Biến chủng P mirabilis D̅ (mm) s 21,28 0,89 21,06 B subtilis % biến đổi % biến đổi hoạt D̅ (mm) s 109,77 21,59 0,84 108,55 0,31 108,63 21,84 1,05 109,82 22,10 0,60 114,00 21,74 1,22 109,32 21,41 0,63 110,45 21,51 0,27 108,18 21,76 1,24 112,24 22,83 0,23 114,78 20,37 0,48 105,09 21,87 1,02 109,96 20,19 0,43 104,16 21,39 0,81 107,58 20,10 0,50 103,68 21,25 1,18 106,84 21,18 0,82 109,25 21,44 0,82 107,81 10 21,09 0,82 108,80 21,59 1,27 108,55 11 18,40 0,35 94,91 19,29 0,68 97,02 12 17,49 0,37 90,23 19,27 0,89 96,92 13 19,70 1,00 101,62 21,56 0,15 108,41 14 20,60 0,53 106,26 21,91 0,14 110,19 15 20,23 0,28 104,37 20,75 0,83 104,36 16 20,87 0,85 107,67 20,93 1,78 105,23 17 19,91 0,23 102,72 21,71 1,18 109,15 18 20,26 0,55 104,50 19,43 1,85 97,72 19 19,44 0,59 100,28 19,47 0,71 97,92 20 20,01 0,34 103,23 19,83 0,66 99,70 21 20,70 0,58 106,77 21,35 1,06 107,38 22 20,16 1,62 103,99 21,81 1,47 109,69 23 19,01 0,52 98,07 20,35 0,30 102,31 24 17,95 0,26 92,61 19,06 0,22 95,84 25 18,39 0,43 94,84 19,84 0,34 99,77 26 19,27 0,37 99,42 22,47 0,93 113,01 hoạt tính tính 27 18,28 0,16 94,29 20,55 0,89 103,32 28 17,84 0,19 92,02 19,89 0,71 100,03 29 19,82 0,86 102,24 20,93 0,45 105,23 30 19,68 0,92 101,51 20,75 0,42 104,36 31 18,93 0,45 97,63 19,40 0,49 97,55 32 19,87 0,61 102,51 20,98 0,39 105,50 33 19,06 1,13 98,31 19,95 1,13 100,30 Chứng 19,39 0,34 100,00 19,89 0,63 100,00 Bảng PB.3 Kết thử HTKS sau ĐBUV lần Kết Biến P mirabilis chủng D̅ (mm) s 21,80 0,32 22,85 B subtilis % biến đổi % biến đổi hoạt D̅ (mm) s 104,47 20,79 0,58 100,61 0,08 109,49 22,89 0,64 110,78 20,13 0,81 96,49 20,57 1,26 99,55 21,91 0,23 105,02 21,44 0,07 103,78 20,93 0,38 100,32 20,89 1,35 101,13 22,61 0,31 108,37 22,51 1,31 108,94 21,95 0,67 105,18 22,03 0,19 106,65 22,34 0,58 107,06 22,50 1,25 108,91 22,19 0,81 106,36 22,39 1,05 108,36 10 22,92 1,30 109,84 22,73 0,86 110,00 11 21,35 1,14 102,33 21,71 1,33 105,07 12 21,75 1,05 104,22 22,89 0,62 110,78 hoạt tính tính 13 20,99 1,35 100,58 22,13 1,32 107,13 14 22,11 0,53 105,94 22,50 0,95 108,91 15 20,21 0,87 96,84 19,99 0,28 96,77 16 22,54 0,42 108,02 21,69 0,20 104,97 17 22,55 0,75 108,08 21,96 1,42 106,29 18 20,93 0,64 100,29 21,83 0,88 105,65 19 21,59 0,11 103,45 22,72 0,99 109,97 20 21,08 0,08 101,02 21,51 0,16 104,13 21 21,61 0,36 103,55 21,85 0,71 105,78 22 21,69 0,90 103,96 21,38 0,75 103,48 23 20,35 0,79 97,54 20,25 0,78 98,03 24 21,87 0,44 104,79 22,47 0,17 108,78 25 21,69 0,55 103,93 21,63 0,90 104,71 26 21,07 0,25 100,99 21,22 0,66 102,71 27 20,94 0,41 100,35 20,88 1,41 101,06 28 20,89 0,77 100,13 20,59 0,57 99,68 29 21,86 0,68 104,76 21,08 0,55 102,03 30 21,75 0,98 104,22 21,19 0,56 102,55 31 21,55 0,25 103,29 21,05 0,56 101,87 32 20,84 0,84 99,87 20,55 1,53 99,48 33 20,77 0,82 99,52 20,78 0,48 100,58 Chứng 20,87 0,97 100,00 20,66 0,22 100,00 Bảng PB.4 Kết thử HTKS sau ĐBHH Kết Biến chủng P mirabilis D̅ (mm) s 23,55 1,12 23,94 B subtilis % biến đổi % biến đổi D̅ (mm) s 101,29 23,25 0,61 97,19 0,64 102,98 23,85 0,61 99,72 22,63 0,23 97,36 23,71 1,02 99,14 23,89 0,35 102,78 24,75 0,60 103,46 22,26 0,71 95,76 23,45 0,31 98,05 23,45 0,32 100,86 24,17 0,05 101,06 23,53 1,08 101,20 24,33 0,16 101,70 25,16 1,87 108,23 24,37 0,82 101,90 25,47 2,36 109,55 24,18 0,75 101,09 10 23,99 1,51 103,21 24,51 0,81 102,48 11 23,79 1,39 102,32 23,65 0,09 98,86 12 23,27 1,57 100,11 24,07 1,42 100,61 13 23,71 1,19 101,98 23,74 0,96 99,25 14 24,42 2,00 105,05 24,84 1,59 103,85 15 23,56 1,28 101,35 25,37 1,01 106,05 16 23,19 1,32 99,77 24,19 1,01 101,11 17 22,64 0,77 97,39 24,41 0,27 102,03 18 23,67 0,71 101,81 23,77 0,99 99,36 19 23,60 0,44 101,52 23,51 0,71 98,27 20 22,71 0,96 97,68 22,52 1,32 94,15 21 23,33 1,18 100,37 23,91 0,53 99,94 22 24,03 0,42 103,38 24,21 1,22 101,23 23 22,94 0,82 98,68 24,01 1,18 100,36 24 23,55 0,76 101,32 25,13 0,06 105,07 25 23,27 0,14 100,11 24,01 0,63 100,39 26 23,42 0,82 100,75 23,63 0,95 98,80 hoạt tính hoạt tính 27 23,47 0,46 100,98 23,36 1,36 97,66 28 23,50 0,98 101,09 24,34 0,32 101,76 29 23,17 0,57 99,66 24,78 0,59 103,60 30 23,38 0,65 100,57 24,36 0,51 101,84 31 23,40 0,66 100,66 24,64 0,31 103,01 32 23,10 0,53 99,37 24,11 0,41 100,78 33 22,87 0,20 98,37 24,28 0,51 101,51 Chứng 23,25 0,47 100,00 23,92 0,53 100,00 ... xuất kháng sinh mới, định tiến hành đề tài: Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ Streptomyces 184.225 với mục tiêu sau: Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh. .. Hình PH.7 Kháng sinh sau kết tinh lại Hình PH.8 Hình ảnh kháng sinh 1, kháng sinh 2, kháng sinh tinh khiết (theo thứ tự) Hình PH.9 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình PH.10 Phổ tử ngoại kháng sinh Hình... nghiên cứu kháng sinh ngày coi trọng trước gia tăng đề kháng vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh Trong số tất chất kháng sinh sản xuất, chi Streptomyces chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần