Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng streptomyces 9 25

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI LÊ QUANG VŨ GÓP PHẦIV IVÍiHLÊIV c r tr SLYII TỔNG HỢP K H M G SLYII TỪ COẺNG STREPTOMTCES 9 .2 5 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC Khoá 1998 - 2003 Giáo viên hướng dẫn: TS. Cao Văn Thu Noi thực hiện: BM Công Nghiệp Dược Thời gian thực hiện: 2/2003- 5/2003 Hà Nội - 5/2003 li?64- Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy giáo TS. CAO VĂN THU, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này. Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. Với kiến thức và thời gian thực hiện khoá luận còn hạn chế, chắc rằng khoá luận của tôi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong được sự đóng góp ỷ kiến của các thầy cô và bạn bè để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2003 Sinh viên Lê Quang Vũ MỤC LỤC TRANG PHẦN I. ĐẶT VẤN ĐỂ PHẨN II. TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm chung về Streptomyces 1 3 3 2.1.1. Một số đặc điểm về hình thái của chi Streptomyces. 2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces. 2.1.3. Một số khá lớn kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng hợp đã được nghiên cứu và sử dụng 2.2. Cải tạo giống vi sinh vật 5 2.2.1. Chọn lọc ngẫu nhiên 2.2.2. Đột biến nhân tạo. 2.3. Lên men 6 2.3.1. Lên men bề mặt. 2.3.2. Lên men chìm. 2.4. Chiết tách và tinh chế 8 2.4.1. Phương pháp chia cắt pha. 2.4.2. Phương pháp chuyển pha. 2.5. Các kết quả mới về quá trình nuôi cấy và chiết tách một sô kháng sinh 1 1 2.5.1. Bafilomycin B, và Cị. 2.5.2. Kháng sinh adriamycin, 14 hydroxyl daunomycin chống ung thư từ chủng Str. peucetius var. caesius. PHẦN m. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 13 3.1. 13 Nguyên liệu và trang thiết bị 3.1.1. Chủng gốc vi sinh vật và nguyên liệu. 3.1.2. Các trang thết bị 3.2. Phương pháp thực nghiệm 17 3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán. 3.2.2. Phương pháp cải tạo giống 3.2.3. Phương pháp lên men. 3.2.5.Phương pháp xác định kháng sinh nội bào. 3.2.4. Phương pháp thử độ ổn định của hoạt chất kháng sinh trong dịch lên men với pH khác nhau. 3.2.6. Phương pháp chiết tách kháng sinh. 3.2.7. Phương pháp sắc ký. 3.2.8. Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP (International Strepmyces Project). 3.3. Kết quả và nhận xét 24 3.3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp trong môi trường 2 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. 3.3.3. Kết quả nghiên cứu tuyển chon giống bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên. 3.3.4. Kết quả cải tạo giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo với các tác nhân ánh sáng u v (k = 254nm). 3.3.5. Kết quả khảo sát chọn môi trường lên men chìm có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất. 3.3.6. Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp sinh kháng sinh của các biến chủng sau đột biến 3.3.7. Kết quả thử kháng sinh nội bào. 3.3.8. Kết quả quá trình lựa chọ dung môi chiết và pH chiết thích hợp với hoạt chất kháng sinh ở dịch lọc dịch lên men. 3.3.9. Kết quả thử độ ổn định của hoạt chất tại các pH khác nhau 3.3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng. 3.3. 11. Kết quả phân loại và định tên Streptomỵces 9.25 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 37 4.1. Kết luận 37 4.2. Đề xuất 38 TẢI LIỆU THAM KHÁO PHU LUC CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT ADN: Adenin deoxyribonucleic BC: Bacillus cereus Bp: Bacillus pumilis Bs : Bacillus subtilis BuOH: n- butanol BuOAc: Butyl acetat EC: Escherichia coli EtOAc: Ethyl acetat Gy: Grey MeOH: Methanol MT: Môi trường Pro: Proteus mirabilis Pseu: Pseudomonas aeruginosa Shi: Shigella flexneri SL: Sarcina lutea sm: smooth Sta: Staphylococcus aureus RF: Rectiflexibiles STH: Sinh tổng hợp Typhi: Samonella typhi VSVKĐ: Vi sinh vật kiểm định W: White Y: Yellow PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỂ • Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều kháng sinh mới, đã được sản xuất bằng phương pháp bán tổng hợp hoặc tổng hợp toàn phần, nhưng việc tìm ra các kháng sinh mới nguyên gốc từ các loài vi sinh vật vẫn đang được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm. Ở Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới là điều kiện tốt cho các loài vi sinh vật phát triển trong đó có nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt, tiêu biểu là chi Streptomyces thuộc lớp phụ Actinomycetales cũng đang được đánh giá cao và nhiều nhà khoa học quan tâm. Việc phân lập các chủng Streptomyces được tiến hành nghiên cứu tại bộ môn công nghiệp dược của trường ĐH Dược Hà Nội. Tuy nhiên những chủng nguyên thuỷ ban đầu, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chưa cao. Do vậy, nghiên cưú nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và nghiên cứu chiết tách tinh chế kháng sinh là điều kiện cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trước khi đưa ra công nghiệp hoá. Tiếp tục từ những việc nghiên cứu đã lởi phát) chúng tôi lựa chọn đề tài có tên: “Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ khuẩn streptomyces 9.25" với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống và lên men để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Nghiên cứu sơ bộ phương pháp chiết tách và tinh chế kháng sinh. - Nhận dạng định tên chủng Streptomyces 9.25 1 PHẦN II TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm chung về streptomyces 2.1.1. Một sô đặc điểm về hình thái của chi streptomyces Streptomyces là chi thuộc lớp phụ Actinomycetales phân bố rộng rãi trong tự nhiên ở nhiều nơi: đất, bùn ao hồ, cát, nước... Trung bình cứ 1 gam đất nói chung có trên một triêu xạ khuẩn. Mật độ xạ khuẩn ở các mẫu đất khác nhau rất khác nhau, phụ thuộc nhiều điều kiện: môi trường như độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, pH.... Streptomỵces tạo ra khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất, các khuẩn lạc hình thành sau vài ngày nuôi cấy có mầu sắc hết sức phong phú, thường hay gặp là màu trắng, màu xám, màu tím... Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt có nếp toả ra hình phóng xạ. Khuẩn ty cơ chất đang sinh trưởng có tính chất như xốp, bề mặt nhẵn hoăc xù xì có xu hướng dính chặt vào môi trường. Khuẩn ty khí sinh có đường kính từ 0,5 - 1,4 |Lim và từ đó hình thành nên những chuỗi bào tử. Đây là cơ sở sinh sản đặc trưng, chuỗi bào tử có cấu tạo gồm một sợi trục không có chức năng sinh sản, những đoạn phân nhánh cuối cùng mới có khả năng sinh bào tử. Trên mỗi nhánh có từ 10 - 100 bào tử. Bào tử có thể hình cầu, elip... Đường kính của bào tử có kính thước tương ứng với đường kính của khuẩn ty. 2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces. Streptomyces phát triển được ở nhiệt độ từ 20 - 40 °c. Nhưng điều kiện phát triển tối thích của nó là 30 ± 2°c và ở pH: 7,0 ± 0,2. Một số đặc điểm cần lưu ý của streptomyces là sự tạo sắc tố hoà tan, khuẩn lạc có màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, đây cũng là những cơ sở để giúp phân loại định tên loài cho các loài Streptomyces. 2 Các loài trong chi Streptomyces là các vi khuẩn gram dương, hiếu khí, sống hoại sinh trong đất và nước. Chúng có khả năng phân huỷ mạnh glucid, có thành tế bào kiểu I chức DAP (diaminopimelat) và glycin. 2.1.3. Một sô khá lớn kháng sinh do một sô loài streptomyces sinh tổng hợp đã được nghiên cứu và sử dụng Nhiều loài Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp tạo ra được nhiều loại thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau như: aminoglycosid, phenicol, macrolid, lincosamid, tetracylin... - Nhóm Amỉnosid + Streptomycin do S.griseus (Waskman 1943) + Kanamycin do S.kanamycetiusịUmezawa 1957) + Torbramỵcin do S.tenebreus + Neomycin do s.fradie +Paromomycin do S.rimosus formaparomomycinus / + Spectimomycin do S.pectabilis -Nhóm phenỉcol. + Cloramphenicol do s.venzuelae - Nhóm Tetracyclin. + Tetracylin do S.aureofaciens + Oxy tetracylin do S.rimosus + Clotetracylin do S.aureofaciens -Nhóm macrolid. + Erythromycin do S.erythreus + Olean domycin do S.antibioticus + Spiramycin do S.ambofaciens - Nhóm lincosamỉd. + Lincomycin do S.lincolensis 3 - Kháng sinh chống nấm. + Nystatin do S.noursei + Amphotericin do s. nodosus 2 .2 . Cải tạo giống vi sinh vật Hầu hết các vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ các cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính thấp, đồng thời trong quá trình nuôi cấy hoạt tính của chúng thường giảm dần. Do đó để thu được những chủng có hoạt tính cao, ổn định đưa vào sản xuất cần phải tiến hành cải tạo giống bằng các biện pháp khác nhau. 2.2.1. Chọn lọc ngẫu nhiên Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau có cá thể tăng hoạt tính kháng sinh so với cá thể khác. Ta cần chọn lấy những cá thể có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp. Trên thực tế tần suất xuất hiện các biến chủng dương tính rất thấp và việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có hoạt tính kháng sinh cao chỉ để nghiên cứu ban đầu ít có giá trị áp dụng vào sản xuất, để thu được những chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao. Ta phải cải tạo giống. Ở đây chúng tôi kết hợp đột biến và sàng lọc. Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học hiện đại và việc tìm ra bản chất gen, hiểu bản chất đột biến và quá trình phát sinh đột biến. Người ta có khả năng tạo ra đột biến mạnh để tăng hiệu quả trong quá trình nghiên cứu sản xuất. 2 .2 .2 . Đột biến nhân tạo Đột biến là quá trình làm thay đổi trình tự sắp xếp của các base hoặc thay đổi bản thân các base trong ADN. Các yếu tố gây đột biến là các tác nhân gây đột biến có thể làm thay đổi một vài nhược điểm của giống. Đột biến nhân tạo là đột biến được tạo bởi các tác nhân đột biến với mục đích nhằm nâng cao tần suất xuất hiện đột biến. 4 Các tác nhân đột biến: + Tác nhân vật lý: Tia X, ánh sáng uv, tia Ỵ... + Tác nhân hoá học: N-mustar, etylenimin, HN02... + Tác nhân sinh học: Đột biến do hiện tượng thiếu các base, nitơ hay do tác động của gen gây đột biến. Trong khoá luận này chúng tôi chỉ nghiên cứu cải tạo giống bằng cách gây đột biến bằng ánh sáng tử ngoại. Ánh sáng u v có khả năng đâm thấu tới nhân với tế bào vi sinh vật nên được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo giống. Cơ chế gây đột biến của ánh sáng UV: Ánh sáng uv có tác dụng trên ADN và mạnh nhất ở bước sóng 260 nm, gây dime hoá thymin (do làm đứt liên kết hydro trong mạch kép ADN). Ở đây 2 thymin gần nhau sẽ liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C5 và C6, hậu quả là sao chép bị nhầm. Do ADN- polymease dễ lắp một nucleotit vào vị trí trên. Ngoài ra do tác dụng của ánh sáng uv trên sợi ADN cũng xuất hiện một dime pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. Ở đây C6 của pyrimidin 5' được liên kết với C4 của pyrimindin 3'. Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu gây lên đột biến bỏti tia uv. Các yếu tố ảnh hưởng đến hậu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến: + Thòi gian chiếu. + Khoảng cách chiếu. + Độ pha loãng. 2.3. Lên men. Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu để sản xuất các sản phẩm trao đổi chất nhờ các vi sinh vật hoặc các thành phần tế bào của chúng. Hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình lên men hoặc bán tổng hợp rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như cloramphenicol. Có 2 kiểu lên men chính: + Lên men bề mặt. + Lên men chìm. 2.3.1. Lên men bề mặt Vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn hay lỏng hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy lên men bề mặt đòi hỏi phải có bề mặt rộng và lớp môi trường không quá sâu. Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện đầu tư ban đầu thấp nhưng cũng có nhược điểm hiệu suất sử dụng thấp, đòi hỏi diện tích lớn, khó cơ giới tự động hoá. Vì vậy không được áp dụng trong sản xuất công nghiệp mà chỉ sử dụng để chọn giống trong phòng thí nghiệm. 2.3.2. Lên men chìm. Đa số các kháng sinh hiện nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên men chìm. Ở phương pháp này vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, phát triển trong không gian 3 chiều. Giống lên men được tạo ra qua các cấp nhân giống khác nhau. + Giống cấp I: được nuôi cấy trong bình trên máy lắc, + Giống cấp II: trong bình giống 50 lít, + Giống cấpIII: nuôi cấy trong bình có dung tích 1- 5 m3 Tỷ lệ giống từ 1-10 %. Tuỳ thuộc vào sản phẩm và thời gian lên men có thể kéo dài từ 96h — 180h, tuy nhiên hiệu quả lên men tăng lên khi thời gian lên men được rút ngắn. ư u điểm của lên men chìm: + Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật. + Hiệu suất sử dụng không gian cao. + Các thiết bị lên men chìm dễ cơ giới hoá tự động hoá tiết kiệm được mặt bằng, nhân công. Tuy nhiên lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và vô trùng tuyệt đối, đòi hỏi đầu tư lớn. Lên men chìm được chia ra nhiều kiểu như: lên men gián đoạn, lên men có bổ sung và lên men liên tục. *. Lên men gián đoạn: Lên men gián đoạn như một hệ thống đóng kín sau khi cấy giống trong điều kiện vô trùng, tiến hành lên men trong điều kiện sinh lý tối ưu, trong thòi gian lên men ngoài cấp khí, chất phá bọt, chất điều chỉnh pH ngoài ra không bổ sung gì thêm. Để theo dõi quá trình lên men người ta tiến hành phân tích các mẫu dịch lên men mới lấy để xác định tham số chính. *. Lên men liên tục: Hệ thống lên men liên tục hoạt động như một hệ mở. Trong quá trình lên men vừa bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng vừa lấy bớt ra đồng lượng dịch lên men đã biến đổi cùng vi sinh vật trong đó giữ thể tích không đổi, lên men liên tục có sản lượng cao, có thời gian chết ngắn hơn lên men gián đoạn. *. Lên men bổ sung là biến tướng phát triển tiếp tục của lên men gián đoạn khi ta bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để tránh các ức chế trao đổi chất của vi sinh vật nhằm tăng cường sinh tổng hợp hoạt chất. Trong quá trình lên men, lượng giống, tuổi, cách nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình. Theo kinh nghiệm, nếu muốn đạt hiệu suất sinh tổng hợp cao thì môi trường nhân giống phải khác môi trường lên men. 7 2.4. Chiết tách và tinh chê Các sản phẩm mục tiêu có trong dịch lên men thường có nồng độ thấp. Ngoài ra dịch lên men còn tồn tại nhiều sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất khác. Do đó việc nghiên cứu quá trình chiết tách và nghiên cứu kháng sinh là một việc vô cùng quan trọng. Có hai phương pháp hay dùng nhất để chiết hỗn hợp đổng nhất đó là phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha. 2.4.1. Phương pháp chia cắt pha Đây là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất tách thành hỗn hợp không đồng nhất. *. Loại dung môi: Bằng cách cô đặc có thể tiến hành ở áp suất giảm. Nếu cô ở áp suất thường thì hoạt chất có thể bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao. Nhưng ngược lại cô ở áp suất giảm, tiến hành phức tạp hơn ở nhiệt độ thấp hơn sẽ an toàn cho hoạt chất hơn. Người ta thường dùng một bình cất quay nối với một bơm chân không, dung môi ngưng đọng chảy qua một bình khác. Sự quay làm tăng diện tích bề mặt bay hơi, do dung môi được tráng lên thành bình. *. Giảm khả năng hoà tan của dung môi. - Thay đổi nhiệt độ. - Thêm chất lỏng không phải là dung môi vào dung dịch. - Phương pháp muối kết (dựa vào độ mạnh yếu khách nhau của các ion). 2.4.2. Phương pháp chuyển pha. Dùng một dung môi hay một hệ dung môi thích hợp để chuyển một chất từ pha này sang pha khác. Trong nhóm này hai phương pháp chiết và sắc ký là hay được sử dụng để nghiên cứu kháng sinh. *. Phương pháp chiết Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không đồng tan vói nhau. Nếu lắc dung dịch A có chứa chất tan s với dung môi B thì quá trình phân bố chất tan s vào hai pha A và B sẽ được trạng thái cân bằng như sau: c K= q CA CA, CBlần lượt là nồng độ của chất s trong pha (A và B) Kq là hằng số cân bằng ở nhiệt độ xác định trong những điều kiện lý tưởng. Các phương pháp chiết: - Chiết một lần (chiết đơn) thường cho hiệu suất thấp. - Chiết lặp (chiết nhiều lần) cho hiệu suất cao, nhưng tốnthời gian và công sức, có thể chiết gián đoạn hay chiết liên tục. - Chiết ngược dòng: dựa trên nguyên tắc dung môi chiết và dung dịch cần chiết chuyển động ngược chiều nhau hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha trộn và di động ngược chiều nhau. *. Sắc ký: Sắc ký là phương pháp tách và phân tích các chất dựa vào sự phân bố của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc vói hai pha các cấu tử hỗn hợp sẽ phân bố vào hai pha tương ứng với các phần tử của pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký . Các chất khác nhau thì có các ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh, chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so vói chất có ái lực yếu hơn với pha này do vậy các chất có thể được tách riêng xa nhau. Theo bản chất có thể chia sắc ký thành 4 loại: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel - Sắc ký phân bố: pha tĩnh là chất lỏng không hoà tan được với pha động chất lỏng này được bao trên bề mặt chất rắn gọi là giá mang. - Sắc ký hấp phụ: pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ. Q - sắc ký trao đổi ion: pha tĩnh là chất mang có nhóm hoạt hoá chứa các ion trao đổi, sắc ký trao đổi ion dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch với các ion thành phần của chất trao đổi ion. - Sắc ký trên gel: chất hấp phụ là các gel, pha tĩnh là dung môi nằm trong lỗ xốp các hạt, pha động là dung môi giữa các hạt, các phân tử chất có phân tử lượng lớn thì sẽ không bị giữ và di chuyển theo dung môi các phân tử nhỏ chui vào các lỗ xốp. Khi rửa các phân tử sẽ ra lần lượt là các cỡ lớn đến nhỏ. Có nhiều loại gel với các lỗ xốp khác nhau để tách phân tử có trọng lượng khác nhau. Khi chiết tách và tinh chế sản phẩm người ta dùng kết hợp cả hai phương pháp: phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha. 2.5. Các kết quả mới về quá trình nuôi cấy và chiết tách một sô kháng sinh. 2.5.1. Bafilomycin và . Khi nuôi cấy Streptomyces halstedii theo phương pháp thông thường thì tác dụng chống nấm không phát hiện được ở cả dịch môi trường và dịch chiết nội bào. Tuy nhiên khi nuôi cấy Streptomyces halstedii trong môi trường dạng film mỏng 1 mm thì thấy đây là một môi trường thích hợp cho sự tạo kháng sinh chống nấm. S.halstedii được nuôi cấy qua đêm ở nhiệt độ 30°c trong môi trường này, sau đó dùng 1 ml môi trường trên thêm vào 15 ml môi trường lên men, hỗn hợp này được phân tán vào bình Rhou để ở nhiệt độ 30°c đến khi tạo bào tử (từ 10-14 ngày). Ly tâm để lấy hệ sợi, hệ sợi được rửa bằng nước cất và lọc qua phễu lọc cellulose. Hệ sợi được thu nhận và chiết bằng MeOH. Ly tâm phá vỡ tế bào bằng siêu âm, sau đó ly tâm lấy dịch. Để thu đủ hoạt chất tinh khiết phục vụ cho việc phân tích cấu trúc, dịch chiết của 80 bình lên men được gộp lại để cất quay và cô đặc. Dịch cô đặc được tinh chế bằng cột C18Ec, chất hấp phụ được hoạt hóa bằng MeOH và được rửa bằng nước. Sau đó được phản hấp phụ bằng hệ dung môi MeOH: nước {8:2}. Các phân đoạn chứa kháng sinh được phát hiện bằng hai phương pháp: Phương pháp vi sinh vật và phương pháp sắc ký lóp mỏng với hệ dung môi EtOAc : MeOH : H20 {7:2:1} Hai chất bafilomycin B| và Cịđược tách riêng và phân tích bằng phương pháp HPLC. Kết quả phân tích cho thấy bafilomycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid. 2.5.2. Kháng sinh adrỉamycỉn, 14 - hydroxyl daunomycin chống ung thư từ chủng Str. peucetius var. caesius Daunomycin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracylin được chiết từ môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius. Cấu trúc của daunomycin là một một a- glucosid của daunomicinon (có 4 vòng là dẫn chất có màu của anthraquinon). Daunomycin được chỉ định trong bệnh bạch cầu cấp tính, đặc biệt là ở trẻ em. Chủng sinh tổng hợp daunomycin là Str.peucetius var.caesius có đặc điểm: Khuẩn ty khí sinh phát triển yếu, có màu trắng hoặc đỏ, khuẩn ty cơ chất có màu vàng chanh, vàng da cam hoặc nâu đỏ, khi nuôi cấy trên môi trường hữu cơ hình thành sắc tố màu đỏ sáng. Khi đột biến bằng tác nhân Nnitroso-Nmetylurethan tạo ra được biến chủng caesius có khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh, màu xanh xám, khuẩn ty cơ chất màu đỏ sẫm, sắc tố hoà tan từ màu vàng đến cam hay tím. Biến chủng này có khả năng sinh tổng hợp một hợp chất mới có cấu trúc gần giống daunomycin đó là adriamycin. Adriamycin là một kháng sinh nội bào quá trình chiết tách bao gồm chiết bằng dung môi, sắc ký cột, cellulose và kết tinh dưới dạng Hydroclorid. Adriamycin hydroclorid tan trong nước, ethanol không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực, dung dịch adriamycin có màu da cam à pH acid, da cam đỏ ở pH trung tính, tím xanh ở pH > 9. Khi thuỷ phân adriamycin bằng acid yếu thì thu được aglycon là adriamycinon là một đường amin. Những nghiên cứu hoá trị liệu cho thấy adriamycinon kìm hãm sự phát triển của ung thư biểu mô, có khả năng ức chê mạnh sacom và ung thư tuỷ ác tính oberlinggluerin-gluerin. Chỉ số điều trị adriamycin có nhiều triển vọng hơn cả daunomycin. PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Nguyên liệu và trang thiết bị 3.1.1. Chủng gốc vi sinh vật và nguyên liệu *. Giống xạ khuẩn gốc: Streptomyces 9.25 do phòng thí nghiệm vi sinh kháng sinh bộ môn Công Nghiệp Dược trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp. *. Chủng vi sinh vật kiểm định: - Escherichia coli (EC) A TCC25922 - Proteus mirabilis (pro) B V 108 - Pseudomonas aeruginosa (pseu) VM201 - Shigella ũexneri (shi) DTI 12 - Salmonella typhi (Typhi) DT220 - Bacillus cereus (BC) A TCC9946 - Bacillus pumilus (Bp) A TCC10241 - Bacillus subtilis (Bs) A TCC10241 - Sarcima lutea (SL) A TCC9341 - Staphynococus aureus (sta) A TCC1228 - Candida albicans Cl DV216 - Aspergillus niger DIPC109 *. Các môi trường đã sử dụng: Môi trường 1 (MT 1): Tinh bột 20g; KNO3 l,0g; K2 HP0 4 0,5g; MgS04 .7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .6H20 0,lg; thạch 18,0g; nước cất vừa đủ lOOOml, pH : 6 ,8 - 7,2, tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. 13 Môi trường 3 (MT 3): Lactose 30,Og; NH4 NO3 2,0g; cao ngô 5,0g; K2 HP0 4 l,0g; MgS04 .7H20 0,2 g; Na2 S0 4 0,5g; thạchl8,0g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH: 6 ,8 - 7,2 tiệt trùng 120°c, thời gian 30 phút. Môi trường 4 (MT 4): Glucose 20g; cao ngô 5,0g; K2 HP0 4 0,5g; MgS04 .7H20 0,5g; NH4 NO3 2,0g; CaC03 4,0g; thạch 18,0g, nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2, tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. Môi trường 5 (MT 5): Bột ngô 20g; bột đậu tương 10,Og; NaCl lg; CaC0 3 2,0g; K2 HP0 4 l,Og; CoC12 .7H20 0.002g; thạchl8,0g, nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. Môi trường 6 (MT 6 ): Bột đậu tương 15,0g; tinh bột khoai tây 20,Og; (NH4 )2 S0 4 2,0g, cao nấm men 5,0g; CaC0 3 4,0g; CoC12 .7H20 0.02g, thạch 18,0g, nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. Môi trường 7 (MT 7): Saccarose 30,Og; bột đậu tương lOg; (NH4 )2 S0 4 2,0g ; CaC0 3 2,0g ; NaCl l,Og; CoC12 .7H20 0,002g; thạch 18,Og; nước vừa đủ 1000ml; pH 6 ,8 — 7,2. Tiệt trùng ở 120° c, thời gian 30 phút. . Môi trường lên men chìm: Môi trường l ũ (MT 1’) : Tinh bột 20g; KNO3 1,0g; K2 HP0 4 0,5g; MgS04 .7H20 0,5 g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .7H20 0,0 lg; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. Môi trường 2D (MT 2'): Tinh bột 20g; NaN0 3 2,()g; K2 HP0 4 1,0g; KC1 0,5g; MgS04 .7H20 0,5 g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8 7,2 tiệt trùng ở 120°c, thòi gian 30 phút. Môi trường 3d (MT 3’): Tinh bột 20g; NaNO3 2,0g; MgS04 .7H20 0,5 g; K2 HP0 4 l,0g; KC1 0,5g; Cao nấm men 5,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. Môi trường khác: Môi trường thạch thường: pepton 5,0g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g; thạch 18g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 118°c, thời gian 30 phút. Môi trường canh thang: pepton 5,0g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 118°c, thòi gian 30 phút. Môi trường Sabrouraud glucose 20,Og; pepton 10,Og; thạch 18,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH 6,0, tiệt trùng ò 0,8 atm, thời gian 30 phút. Môi trường phân loại xạ khuẩn. ISP1: pepton 5,0g; cao nấm men3,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút. ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH 7,3; thạch 20; tiệt trùng 120°c thời gian 30 phút. ISP 3: Yến mạch 20,Og; Dung dịch muối vi lượng l,Og; Thạch 18,Og; Nước cất vđ 1000ml; pH: 7,3. Tiệt trùng ở 120°c trong thời gian 30 phút. ISP4: dung dịch I: tinh bột 10,Og; nước cất vừa đủ 500ml; dung dịch II: K2 HP0 4 l,Og; MgS04 .7H20 1,0 g; (NH4 )2 S0 4 2,0g, CaC0 3 2,0g; muối vi lượng 1,0 ml; nước cất vừa đủ 500ml pH: 7,0-7,4. Trộn dung dịch I, II thêm 20,0g thạch tiệt trùng ở nhiệt độ 120 °c thời gian 30phút. ISP5: L-aspragime l,Og; glycerin 10,Og; KH2 P0 4 l,0g; dung dich muối vi lượng lml: thạch 20,Og; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 7,0 — 7,4 tiệt trùng ở 120°c, thòi gian 30 phút. ISP 6 : Pepton 20,Og; sắt amonicitrat 0,5g; K2 HP0 4 l,Og; Na2 S2 0 3 0,08g; thạch 18,0g; Cao nấm men l,0g; nước cất vừa đủ 1000ml, pH:7,0-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30phút. ISP7: glycerin 15,0g; L-tyrosin 0,5g; L-aspargin l,Og; ; K2 HP0 4 0,08g; MgS04 .7H2 0; NaCl 0,5g; FeS04 .7H20 0,01g; Muối vi lượng 0,lml; thạch 20g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH:7,0-7,2 tiệt trùng ở ISP9: 1 2 0 °c, thời gian 30phút. (NH4 )S0 4 2,64g; KH2 P0 4 2,38g; K2 HP0 4 5,65g; MgS04 .7H20 l,Og; Môi trường MTB l,Oml; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 7,0-7,2; tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30phút. Trong đó môi trường B: CuS04 .5H20 0,064g; FeS04 .7H20 0,1 lg; MgCl2 .4H20 0,079g; ZnS04. 7H20 0,lg; nước cất vừa đủlOOml. *. Dung dịch muối vi lượng: FeS04 .7H20 0,lg; MgCl2 .4H20 0,lg ZnS04. 7H20 0,115g; Nước cất vừa đủ 10ml. *. Các nguồn đường gồm các dung dịch đường 10% của các đường sau: + D — xylose + D — manitol + D — fructose + Rhamnose + Raffinose + Saccarose + Arabinose + Inositol + glucose Các dung dịch này được khử trùng bằng phương pháp tyndal. 3.1.2. Các trang thiết bị. - Tủ sinh học - Cân phân tích - Đèn tử ngoại - Cân kỹ thuật - Máy li tâm - pH mét - Tủ ấm - Nồi hấp áp lực 16 - Máy lắc - Kính hiển vi điện tử. 3.1.3. Các dung môi hoá chất được sử dụng - Ethylacetat (d = 0,80 - 0,81 - Buthylacetat (d = 0,88 - 0,89 t°s = 117 - 118°C) - n — buthanol (d = 0,81 - Methanol (d = 0,79 - Cloroform (d = 1,47 - 1,48 - Diclomethan t°s = 77°C) t°3 = 116 - 118°C) t°s = 64,6°C) t°s = 60 - 62°C) (d = 1,32 t°s = 40°C) Một số dung môi đã sử dụng khác: Aceton, Amonihydroxyd, Ethanol... - Bản mỏng silicagel 60F254 Merck. 3.2. Phương pháp thực nghiệm 3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán *. Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt lên lófp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật tạo thành vòng vô khuẩn. Đo đường kính vòng vô khuẩn. Hoạt tính kháng sinh tỷ lệ vói đường kính vòng vô khuẩn. *. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường kiểm định: vi sinh vật kiểm định trước khi thử được cấy vào môi trường canh thang trước 18 — 24 h đối với vi khuẩn (ủ ở 37°C) và môi trường Sabouraud lỏng trước 18 — 24 h ( đối với vi nấm ở 30°C), tạo thành nhũ dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 1 0 7- 1 0 8 tế bào trên lml, cho vào môi trường thạch thường (đã được tiệt trùng ở 118°c, thời gian 30phút) ở 45-50°C với tỷ lệ nhũ dịch: Vthạchthường= 1:40 (vói vi khuẩn) vói môi trường Sabouraud đặc (với vi nấm) đổ ra hộp petri (20ml/hộp). Đặt mẫu thử: 17 Có 3 cách thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuy ếch tán: phương pháp giếng thạch, phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh, phương pháp khối thạch. + Phương pháp khối thạch: Mẫu thử là các khối thạch chứa kháng sinh (0 = 6 mm), đặt trực tiếp lên môi trường dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định. + Phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh: Tẩm kháng sinh cần thử lên khoanh giấy lọc trong vòng 3-5 phút, sấy nhẹ ( t° D ị: Đường kính vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến . Dữ: Đường kính vòng vô khuẩn của chủng gốc. Dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có đột biến dương cao nhất. 3.2.3. Phương pháp lên men Trong nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men bằng phương pháp lên men gián đoạn trên máy lắc tròn. Quá trình lên men. 20 + Nhân giống cấp I: chủng Streptomyces 9.25 san khi được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi được cấy vào bình nón 500 ml chứa 100ml MT 1 qua 10ml nước cất vô trùng, sau đó đem lắc trên máy lắc tròn, nhiệt độ 30°c, tốc độ 180 vòng/ phút, thời gian 48h. Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng. + Lên men: giống cấp I được cấy vào bình nón 500ml chứa 100ml các môi trường lên men đem lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 30°c, tốc độ 180 vòng/phút, thời gian 120h. Các bước tiến hành được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. 3.2.4. Phương pháp thử độ ổn định của hoạt chất kháng sinh trong dịch lên men với pH khác nhau. Sau khi kết thúc quá trình lên men ta thu được dịch lên men. Tiến hành lọc tách sinh khối. Dịch lọc thu được được đưa về các pH khác nhau (2,3,4...12) nhờ acid HC1 3N và NaOH 20%. Sau đó để tủ lạnh 24h, lấy ra chỉnh pH của dịch lọc trên về pH = 7, thử hoạt tính kháng sinh của dịch trên bằng phương pháp giếng thạch, từ đó ta lựa chọn pH tối ưu cho quá trình bảo quản và lưu giữ dịch lên men. 3.2.5. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào Sinh khối sau khi tách khỏi dịch lên men được rửa bằng nước cất 3 lần sấy nhẹ đến khô (t°< 50°C), nghiền kỹ sinh khối trong cối sứ với 1 lượng nhỏ dung môi chiết tỷ lệ 1:5 (W/V). Ở đây dung môi sử dụng là n- butanol, ngâm 24h, hoạt tính kháng sinh được thử bằng phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh trên hai vi khuẩn kiểm định: Shigella flexneri (shi), Sarcina lutea (SL). 3.2.6. Phương pháp chiết tách kháng sinh Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch lên men được tách sinh khối. Dịch lọc được chỉnh về các pH thích hợp với từng dung môi chiết, tiến hành chiết trong bình gạn. Ở đây sử dụng phương pháp chiết đơn. *. Phương pháp chiết đơn 21 Dịch lọc đã chỉnh pH được cho vào bình gạn cùng vói dung môi theo tỷ lệ V dungmôi: V dịchiọc= 1 : 3 . Lắc 3 lần, m ỗi lần thời gian từ 2-3 phút, để phân lớp sau lh, gạn lấy phần dung môi. Kết quả chiết được kiểm tra bằng cách thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh. Với vi sinh vật kiểm định: Sarcina lutea. 3.2.7. Phương pháp sắc ký Do thời gian có hạn, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương phương pháp sắc ký lớp mỏng. Bản mỏng sắc ký có kích thước 8 X 1,5 cm đã được hoạt hoá ở 110°c, thời gian 30 phút, dung môi chạy sắc ký đã được pha theo đúng tỷ lệ và cho vào bình sắc ký vói một lượng vừa đủ, để một thời gian cho bão hoà hơi dung môi. Chấm dịch chiết chứa hoạt chất kháng sinh lên bản mỏng sắc ký. (cách mép dưới 1,5 cm), tuỳ theo mức độ đậm đặc của mẫu thử mà số lần chấm có thể thay đổi, sấy nhẹ bản mỏng cho khô. Đặt bản mỏng đã chấm vào bình sắc ký, để dung môi chạy hết 3/4 chiều dài bản mỏng, lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy ta được Ddm. Sấy nhẹ bản mỏng đến khô đem xác định vết. *. Có 3 phương pháp xác định vết: + Xác định bằng đèn tử ngoại: bản sắc ký đã được trộn vói một chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại (Ằ,=254nm). Vì vậy khi soi đèn tử ngoại vết chất thử có mầu thẫm trên nền huỳnh quang sáng. + Xác định vết bằng phương pháp hiện hình vi sinh vật: Bản mỏng sắc ký đã chạy và sấy khô được đặt trong đĩa petri vô trùng, đổ môi trường thạch thường đã trộn vi sinh vật kiểm định phủ lên bản mỏng để ở tủ 37°c, trong 24h. Nếu vết chất thử là kháng sinh sẽ xuất hiện vòng vô khuẩn. Đo khoảng cách từ điểm xuất phát đến vòng vô khuẩn (Dv). Xác định Rf theo công thức: 22 Rf= ậ = A/m Kết quả sắc ký lớp mỏng cho ta biết mẫu thử có bao nhiêu thành phần, trong đó có bao nhiêu thành phần kháng sinh và đồng thời sẽ lựa chọn được hệ dung môi để tiến hành tách các thành phần trong sắc ký cột. 3.2.8. Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP (International Strepmyces Project). Phương pháp xác định đặc điểm, hình thái và sắc tố của strepmyces 9.25. Các môi trường ISP1; ISP2; ISP3; ISP4; ISP5 được pha và tiệt trùng ở 118°c thời gian 30 phút, dùng pipet vô trùng hút 20ml cho vào đĩa petri vô trùng, mỗi môi trường làm 4 đĩa petri, cấy vạch bào tử của Streptomyces 9.25 lên bề mặt môi trường để ở 30°c. Tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7,14 và 2 1 ngày. Khi quan sát đánh giá chú ý một số đặc điểm sau: - Màu sắc của bề mặt khuẩn lạc. - Màu sắc của khuẩn ty cơ chất. - Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử (quan sát dưới kính hiển vi điện tử) ta thấy chuỗi bào tử thường có các dạng sau: thẳng, uốn cong (RF), móc câu (RA), xoắn ốc, lò xo (S). Ghi đầy đủ các đặc điểm hình thù của chủng Streptomyces. Nếu chuỗi bào tử mọc thành vòng đơn không xoắn, vòng đơn có xoắn, vòng đôi không xoắn hoặc vòng đôi có xoắn ký hiệu (V). Bề mặt bào tử có các dạng sau: Phẳng nhẵn (sm), gai (sp), mụn cơm (wa), tóc (ha). *. Xác định sắc tố menanoid: chủng Streptomyces 9.25 được nuôi cấy trên môi trường ISP6 , ISP7 phát hiện đánh giá sắc tố menanoid ồ ngày thứ 2 , thứ 4 nếu có đánh số (1), nếu không đánh số (0). *. Phương pháp đánh gía khả năng tiêu thụ nguồn cacbon. 23 Streptomyces 9.25 nuôi cấy trên môi trường chứa các nguồn chứa cacbon khác nhau (ISP9), đánh giá sự phát triển ở ngày thứ 7, 14, 21. Nếu phát triển đánh dấu (+), không phát triển đánh dấu (-), nếu phát triển không rõ ràng đánh dấu (±), nếu phát triển rất mạnh đánh dấu (++). 3.3. Kết quả và nhận xét 3.3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp trong MT 2 Bảng 1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên môi trường phân lập MT 2 ( D : Đường kính vòng vô khuẩn) VSVKD G(+) D(mm) BC 11,52 BP 8,84 BS 8,54 9,32 SL 8,76 STa G(-) Ec 9,30 Pseu 12,56 Shi 9,30 Typhi 9,26 Pro 9,68 Nhận xét: Ở môi trường phân lập (MT2), chủng Streptomyces 9.25 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tác dụng trên cả vi khuẩn G(+) và G(-), nhưng tác dụng trên vi khuẩn G(-) mạnh hơn trên G(+) và mạnh nhất với trực khuẩn mủ xanh. 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Chủng Streptomyces 9.25 đã được nuôi cấy trên 7 môi trường đặc khác nhau đủ ngày tuổi, để đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh khi thay đổi môi trường để chọn môi trường tốt nhất cho quá trình nuôi cấy và lên men. Kết quả được giới thiệu ở bảng 2. Bảng 2: Kết quả thử nghiệm các môi trường khác nhau vsv D(mm) - Đường kính vòng vô khuẩn trung bình KĐ MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 BC 8,94 9,62 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 BP 10,90 9,32 0 ,0 0 8,44 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 BS 8,14 9,82 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 SL 0 ,0 0 12,36 8,24 12,40 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 STA 14,50 15,92 0 ,0 0 12,46 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Ec 9,22 1 2 ,8 6 0 ,0 0 10,50 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Pseu 14,12 13,74 0 ,0 0 13,94 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Shi 13,92 15,80 0 ,0 0 13,74 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Typhi 9,92 9,62 0 ,0 0 8,24 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Pro 9,10 10,30 0 ,0 0 8,50 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Nhận xét: Chủng Streptomyces 9.25 phát triển tốt trên các môi trường MT1, MT2, MT4 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt trên các môi trường này, nhưng tốt nhất trên MT 2. Do vậy chúng tôi quyết định chọn MT 2 làm môi trường giữ giống, và các môi trường MT1, MT2 và MT4 nghiên cứu trong các quá trình lên men tiếp theo. Kháng sinh do Streptomyces 9.25 tạo ra tác dụng mạnh trên Sarcina lutea, Shigella flexneri nên chúng tôi chọn các 25 chủng vi sinh vật này làm vi sinh vật kiểm định cho quá trình thực nghiêm tiếp theo. 3.3.3. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn giống bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên Qua quá trình sàng lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc được cấy trên bể mặt MT 2 trong hộp petri đã được 6 ngày tuổi, sau đó xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch vói 2 vi sinh vật kiểm định trên ta được kết quả ở bảng 3. Bảng 3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) Biến chủng Shigella flexneri Sarcina lutea D( mm) s ữ(mm) s 1 16,09 2,87 14,08 0,46 2 11,18 0,88 11,38 1,79 3 17,05 0,35 17,14 1,14 4 16,67 1 ,8 8 16,34 1,87 5 17,92 2,93 16,63 2,17 6 16,99 1,78 14,35 0,79 7 16,41 1,99 14,09 2,08 8 19,00 0,54 16,18 1,32 9 15,69 2,25 14,31 0,67 10 16,05 2,18 13,09 1,08 11 12,18 1 ,1 2 11,16 1,77 1 2 1 0 ,6 6 0,19 12,08 2 ,1 1 13 11,15 1,23 10,92 0,48 14 12,24 2,07 11,42 0,45 15 12,74 3,77 13,17 1,84 16 14,70 0,77 15,79 1,70 17 12,57 2 ,1 1 13,32 1,07 18 14,01 0,28 14,36 0,94 19 13,59 2,85 13,05 1,93 2 0 17,98 0,96 13,03 1,14 2 1 1 1 ,2 2 1,40 10,73 0,99 2 2 12,67 3,38 10,85 1,31 23 17,34 0,59 13,81 1 ,2 2 24 14,97 1,09 11,06 1,91 25 16,71 1,94 13,79 0,85 26 15,74 1,35 12,41 0,80 27 12,56 0,76 13,10 0,89 28 14,24 1,33 13,01 0,70 29 16,20 1,90 15,10 0,69 30 11,46 4,38 13,49 0,49 Nhận xét: Qua quá trình đánh giá kết quả chúng tôi quyết định giữ lại 5 biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao đó là 3 , 5 , 6 , Trong 5 biến chủng đó tôi quyết định chọn chủng số 8 8 và 2 0 . để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. 3.3.4. Kết quả cải tạo giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo với các tác nhân ánh sáng uv (X = 254nm) Tiến hành đột biến bào tử Streptomyces 9.25 bằng uv. % Độ sống sót = 0,204 % Thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của 32 biến chủng khi nuôi cấy trên MT 2 với chủng kiểm định Sarcina lutea và Shigella flexneri. (Bảng 4) Bảng 4: Kết quả sàng lọc sau đột biến ( D đường k ín h vòng vô k h u ẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) Biến chủng Shigella flexneri Sarcina lutea I) (mm) s D(mm) s 1 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 3 0,00 0,00 0,00 0,00 4 0,00 0,00 0,00 0,00 5 0,00 0,00 0,00 0,00 6 0,00 0,00 0,00 0,00 7 0,00 0,00 0,00 0,00 8 0,00 0,00 0 ,0 0 0 ,0 0 9 19,68 1,32 18,81 0,33 1 0 7,46 2,47 6,64 0,85 11 7,51 2,54 7,00 0,65 1 2 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 13 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 14 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 15 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 16 0 ,0 0 0,00 0,00 0,00 18 0,00 0,00 0,00 0,00 19 0,00 0,00 0,00 0,00 20 7,75 2,71 0,00 0,00 2 1 0,00 0,00 0,00 0,00 18,37 1,36 18,63 1,43 22 23 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 24 6,57 1 ,0 2 0 ,0 0 0 ,0 0 25 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 26 7,86 0 ,8 0 ,0 0 0 ,0 0 27 19,25 0,27 17,23 1 ,2 0 28 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 29 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 30 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 31 8 ,2 0 2,30 0 ,0 0 0 ,0 0 32 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Mẫu chứng 14,32 1 ,1 1 15,49 1,65 Nhận xét: Sau ]đii thực hiện quá trình đột biến các chủng thu được có sự biến đổi thấy rõ so với chủng chứng theo nhiều chiều hướng khác nhau, có những biến chủng sau khi đột biến làm mất khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Nhưng cũng có một số biến chủng sau khi đột biến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao và khả năng kháng nấm mạnh hơn so với chủng chứng ban đầu. Do vậy chúng tôi quyết định giữ lại các biến chủng này làm các nghiên cứu tiếp theo đó là: 9, 22 và 27. Bảng 5. Kết quả thử hoạt tính chống nấm các chủng sau đột biến. ( D đường kính trung bình vòng vô nấm, s độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh) Biến chủng Candida albicans Aspergillus niger D(mm) s D(mm) s 9 9,22 0,94 8,24 2 ,8 8 2 2 9,20 1,43 10,87 0,40 27 9,50 1,09 10,08 1,56 Chứng 9,79 0,99 0 ,0 0 0 ,0 0 29 3.3.5. Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường lên men chìm có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất Sau khi đã chọn được chủng giống tốt nhất sau quá trình sàng lọc ngẫu nhiên chúng tôi quyết định lên men chủng số 8 trên các môi trường lên men: MT 1', MT 2', MT 3', thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, để tìm môi trường lên men có khả năng tạo điều kiện cho sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất. Kết quả được giới thiệu ò bảng 6 . Bảng 6: Kết quả lựa chọn môi trường lên men chìm Sarcina lutea Môi trường Shigella flexneri D( mm) s fl(mm) s MT1' 10,05 0,95 7,34 0,39 MT2' 12,21 0,26 9,59 0,39 MT3' 13,54 0,26 10,14 0,54 Nhận xét: Qua kết quả trên chúng tôi thấy MT 3' là môi trường có khả năng tạo điều kiện tốt cho chủng Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp kháng sinh cao. Chúng tôi quyết định chọn môi trường này lên men cho các quá trình tiếp theo. 3.3.6 Kết quả so sánh khả năng sinh tổng hợp sinh kháng sinh giữa các chủng sau đột biến. Bảng 7: So sánh kết quả thử khả năng STH kháng sinh của các biến chủng sau đột biến. Biến chủng Sarcina lutea Shigella flexneri £>(mm) s D(mm) s Chủng gốc 11,65 1,14 15,99 1,77 9 13,05 0,93 16,39 1,75 22 15,1 1,60 20,09 1,01 30 Nhận xét: Qua bảng kết quả trên chúng tôi nhận thấy sau quá trình tiến hành đột biến các chủng chúng tôi giữ lại (các chủng đột biến(+) ) đều cho khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn các chủng ban đầu, trong cả khi tiến hành lên men bề mặt và lên men chìm. 3.3.7. Kết quả thử kháng sinh nội bào. Bảng 8: Kết quả thử kháng sinh nội bào. ( D đường kính vòng vô khuẩn trung bình, s độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh) EtOAc: ethylacetat; BuOH : n —Butanol; MeOH: Methanol Sarcina lutea Dung môi D(mm) s EtOAc 7.33 0,54 BuOH 10.90 0,94 MeOH 1 0 ,1 0 0 ,2 2 Nhận xét: Như vậy chủng Streptomyces 9.25 vừa có khả năng sinh kháng sinh nội bào và kháng sinh ngoại bào. Qua bảng trên chúng tôi quyết định chọn dung môi BuOH và MeOH tiếp tục chiết kháng sinh nội bào trong quá trình nghiên cứu tiếp theo. 3.3.8. Kết quả quá trình lựa chọn dung môi chiết và pH chiết thích hợp vói hoạt chất kháng sinh ở dịch lọc sau lên men Sau khi dịch lên men được tách sinh khối. Dịch lọc được đưa về các pH = 4, 7 và 9 chúng tôi tiến hành chiết trên 5 dung môi khác nhau, (đó là CH2 C12, CHC13, EtOAc, BuOAC, BuOH) bằng phương pháp chiết đơn. Dịch chiết đem thử hoạt tính bằng phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh với vi sinh vật kiểm định Sarcina lutea cho kết quả ở bảng sau: Bảng 9: Kết quả lựa chọn dung môi chiết và pH chiết. pH = 4 Biến PH = 7 pH = 9 chủng ũ(mm) s ử(mm) s Õ(mm) s CH2 C12 10,02 0,55 8,40 1,01 7,78 0,96 CHCI3 11,93 0,69 9,02 0,71 8,32 0,90 EtOAc 8 ,2 0 0,41 7,56 0,82 0 ,0 0 0 ,0 0 BuOAC 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 BuOH 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Nhận xét: Qua bảng kết quả trên chúng tôi thấy tại pH = 4 các dung môi CHCI3 , CH2 C12 và EtOAc chiết được hoạt chất kháng sinh từ dịch lọc. Nhưng chiết bằng dung môi CH CI cho kết quả cao. Do đó chúng tôi lựa chọn dung 3 môi chiết là CHCI3 . 3.4.9. Kết quả thử độ ổn định của hoạt chất tại các pH khác nhau Dịch lọc dịch lên men được đưa về các pH khác nhau: 2, 3, 4.... 12. Để trong tủ lạnh sau 24h đem thử hoạt tính bằng phương pháp giếng thạch ta có các kết quả ở bảng 1 0 : Bảng 10: Kết quả thử độ ổn định của hoạt chất kháng sinh KQ D(m m ) s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0,00 0,00 0,00 0,00 11,45 13,59 10,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,09 2,08 0,62 0,00 0,00 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Nhận xét: Qua trên ta có thể sơ bộ kết luận kháng sinh do chủng Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp, bền ở môi trường acid yếu pH = 5 - 6 . Do vậy ta có thể chọn pH = 5 - 6 để bảo quản và lưu giữ dịch lên men. 3.3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng Dịch chiết CH CI đem cô đặc trong bình cất quay được dịch chiết có độ 3 đậm đặc thích hợp. Chúng tôi tiếp tục thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc thì chúng tôi thấy mất hoạt lực kháng sinh. Do vậy tôi có kết luận kháng sinh do chủng Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp không bền ở nhiệt độ cao. Kháng sinh nội bào được chiết bằng dung môi n-butanol đem chấm sắc ký. Sau khi tiến hành chạy sắc ký trên 24 hệ dung môi chúng tôi lựa chọn được 4 hệ có thể tách tốt với thành phần như sau: Hệ 1: n-butanol bào hoà nước. Hệ 2: n-butanol bão hoà nước : amoniac 25% = 20 : 1 Hệ 3: Chloroform : Methnol: Nước = 1 : 6 : 3 Hệ 4: Cloroform : Ethylacetat: Formaldehyd = 1 : 3 : 1 Kết quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 11: Kết quả sắc ký lớp mỏng Rf Hệ dung môi Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3 Hệ 4 uv Vi sinh vật 0,15 0,13-0,21-0,35 0,42 0,67- 0,80 0,15 0,21-0,35 0,42 0,67- 0,80 Nhận x é t: Khi phát hiện bằng vi sinh vật chúng tôi thấy hệ 2 và hệ 4 có 2 vết trùng với 2 vết khi phát hiện bằng ánh sáng tử ngoại uv. Do vậy chúng tôi kết luận rằng trong dịch chiết có ít nhất 3 thành phần, trong đó có 2 thành phần là kháng sinh. 3.3.11. Kết quả phân loại và định tên streptomyces 9.25 *. Kết quả xác định hình thái của chuỗi bào tử Streptomyces 9.25 qua kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 1 0 0 0 0 lần: Ảnh 1: Hình thái chuỗi bào tử *. Kết quả xác định hình thái kích thước bào tử và bể mặt bào tử Ảnh 2: Hình thái bào tử * Sau khi nuôi cấy Streptomyces 9.25 trên môi trường ISP kết quả được trình bày ở bảng 1 2 . 34 Bảng 12: Kết quả phân loại Streptomyces 9.25 STT 1 Các đặc điểm Streptomyces phân loại 9.25 Màu khuẩn lạc Trắng xám Streptomyces. sp (WGg) 2 Màu khuẩn ty cơ 0 chất 3 Melanin 0 4 Sắc tố hoà tan 0 5 Hình dạng chuỗi Thẳng - uốn cong bào tử (RF) 6 Bề mặt bào tử nhẵn bóng(sm) 7 Arabinose ± 8 Xylose + 9 Inositol + 1 0 Manitol + 11 Fructose 1 2 Rhamose ± 13 Saccorose + 14 Raffinose + - Nhận xét: Qua quá trình tra cứu khoá phân loại theo ISP chúng tôi không tìm được loài Streptomyces có đầy đủ tất cả các đặc điểm như chủng Streptomyces 9.25 có thể là một loài mới trong chi Streptomyces mới được tìm thấy. 35 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận: Sau thời gian tiến hành thực nghiệm cứu tôi đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả sau: - Kháng sinh do Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp trong quá trình lên men là một kháng sinh phổ rộng. Tác dụng khá tốt trển cả vi khuẩn Gram (+) và Gram(-). - Streptomyces 9.25 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất trên MT 2 và môi trường lên men chìm ( MT3'). - Sau khi cải tạo giống nhân tạo chúng tôi thu được 3 biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất đó là 9, 22 và 27. , 9/ - ơ jgH acid nhẹ là pH tối ưu cho quá trình bảo quản dịch lên men cũng . • như là pH cho quá trình chiết hoạt chất kháng sinh bằng dung môi CHC13. - Streptomyces 9.25 vừa có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ngoại bào và kháng sinh nội bào. - Chúng tôi tìm được dung môi n-butanol, methanol để chiết kháng sinh nội bào. - Sau quá trình thực hiện sắc ký, chúng tôi sơ bộ kết luận dịch chiết dịch lên men chủng Streptomyces 9.25 có ít nhất là 3 thành phần trong đó có 2 thành phần là hoạt chất kháng sinh. - Chủng Streptomyces 9.25 có thể là một loài trong chi Streptomyces mới được tìm thấy. 4.2. Đề xuất: Sau một thời gian nghiên cứu chúng tôi có một số các đề xuất sau: 36 - Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về chủng Streptomyces 9.25, đặc biệt tìm điều kiện tối ưu cho quá trình lên men và cải tạo giống. - Nghiên cứu sâu hơn quá trình chiết tách và tinh chế. - Nghiên cứu lên men ở quy mô lớn hơn để thu được hoạt chất tiếp tục nghiên cứu tiếp về tính chất lý hoá học, cấu trúc và tiến hành thử tiền lâm sàng nếu điều kiện cho phép. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chu Thị Lộc (1999), Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học, ĐH Dược Hà Nội,trang 2 9 -3 5 . 2. Bộ môn Công nghiệp dược, (2001), Kỹ thuật Sản xuất Dược Phẩm I, ĐH Dược Hà Nội, trang 142- 159. 3. Bộ môn Hóa dược (1998), Hoá dược II, ĐH Dược Hà Nội, trang 182 282. 4. Bộ môn Hoá phân tích, (2002), Hoá học phân tích II, ĐH Dược Hà Nội, trang49 -54. 5. Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Lệ Phi, (1999), Vi sinh học, ĐH Dược Hà Nội, trang 24,25. 6 . Giang Quốc Việt, Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora NO 108, Khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học 2001, ĐH Dược Hà nội. 7. Nguyễn Thị Hương, Khoá luận tốt nghiệp dược sỹ, 2001, Nghiên cứu cải tạo giống và phát triển công nghệ lên men kháng sinh nhờ chủng Micromonospora JSP9. 8. Nguyễn Thị Thanh Dung, 2002, Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Streptomyces 324. Khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học, ĐH Dược Hà nội 9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục, trang 3 9 -4 1 . 10.Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1978, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 3, Nxb Khoa học kỹ thuật. 11. John H. Kennedy, Hoàng Minh Châu dịch, 1996, Cơ sở hoá học phân tích 12. Arcamone, G. Cassinelli, G. F antini, A. Grein, p. Orezzi, c. Pol and c. Spalla, 2000, Adriamycin, 14 - Hydroxydaunomycin, a new Antitumor Antibiotic from s. peucetius var. caesius, Biotechnology and Bioengineering, Vol XI (6 ), pp.704-712 13. Emma Fr™ndberg, Carl Petersson, Lennart N. Lundgren, and Johan Schn™rer, 2000, Streptomyces halstedii K 122 produces the antifungal compounds bafilomycin B1 and Cl , Gan. J. Microbiol, Vol 46, pp 753758. 14. E.B Shirling and D.Gottlieb (1966): Methods for characterization o f Streptomyces species, International joural of systetamatic bacteriology, Vol. 16, No.3,p.313-340. 15. Hideo Nonomura(1974): K ey for classification and Identification o f 458 Species o f Streptomycetes Included in ISP, J.Frement Technol, Vol.52, No.2, p.78-92. PHỤ LỤC Ảnh 3: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch Ảnh 4: Kết quả sắc ký phát hiện vết kháng sinh bằng phương pháp v s v [...]... cho chủng Streptomyces 9. 25 sinh tổng hợp kháng sinh cao Chúng tôi quyết định chọn môi trường này lên men cho các quá trình tiếp theo 3.3.6 Kết quả so sánh khả năng sinh tổng hợp sinh kháng sinh giữa các chủng sau đột biến Bảng 7: So sánh kết quả thử khả năng STH kháng sinh của các biến chủng sau đột biến Biến chủng Sarcina lutea Shigella flexneri £>(mm) s D(mm) s Chủng gốc 11,65 1,14 15 ,99 1,77 9 13,05... 16 14,70 0,77 15, 79 1,70 17 12,57 2 ,1 1 13,32 1,07 18 14,01 0,28 14,36 0 ,94 19 13, 59 2,85 13,05 1 ,93 2 0 17 ,98 0 ,96 13,03 1,14 2 1 1 1 ,2 2 1,40 10,73 0 ,99 2 2 12,67 3,38 10,85 1,31 23 17,34 0, 59 13,81 1 ,2 2 24 14 ,97 1, 09 11,06 1 ,91 25 16,71 1 ,94 13, 79 0,85 26 15,74 1,35 12,41 0,80 27 12,56 0,76 13,10 0, 89 28 14,24 1,33 13,01 0,70 29 16,20 1 ,90 15,10 0, 69 30 11,46 4,38 13, 49 0, 49 Nhận xét: Qua quá... biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao đó là 3 , 5 , 6 , Trong 5 biến chủng đó tôi quyết định chọn chủng số 8 8 và 2 0 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo 3.3.4 Kết quả cải tạo giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo với các tác nhân ánh sáng uv (X = 254 nm) Tiến hành đột biến bào tử Streptomyces 9. 25 bằng uv % Độ sống sót = 0,204 % Thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của 32 biến chủng. .. hiệu chỉnh) Biến chủng Candida albicans Aspergillus niger D(mm) s D(mm) s 9 9,22 0 ,94 8,24 2 ,8 8 2 2 9, 20 1,43 10,87 0,40 27 9, 50 1, 09 10,08 1,56 Chứng 9, 79 0 ,99 0 ,0 0 0 ,0 0 29 3.3.5 Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường lên men chìm có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất Sau khi đã chọn được chủng giống tốt nhất sau quá trình sàng lọc ngẫu nhiên chúng tôi quyết định lên men chủng số 8 trên... hiệu chỉnh) Biến chủng Shigella flexneri Sarcina lutea D( mm) s ữ(mm) s 1 16, 09 2,87 14,08 0,46 2 11,18 0,88 11,38 1, 79 3 17,05 0,35 17,14 1,14 4 16,67 1 ,8 8 16,34 1,87 5 17 ,92 2 ,93 16,63 2,17 6 16 ,99 1,78 14,35 0, 79 7 16,41 1 ,99 14, 09 2,08 8 19, 00 0,54 16,18 1,32 9 15, 69 2 ,25 14,31 0,67 10 16,05 2,18 13, 09 1,08 11 12,18 1 ,1 2 11,16 1,77 1 2 1 0 ,6 6 0, 19 12,08 2 ,1 1 13 11,15 1,23 10 ,92 0,48 14 12,24... biến chủng sau khi đột biến làm mất khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Nhưng cũng có một số biến chủng sau khi đột biến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao và khả năng kháng nấm mạnh hơn so với chủng chứng ban đầu Do vậy chúng tôi quyết định giữ lại các biến chủng này làm các nghiên cứu tiếp theo đó là: 9, 22 và 27 Bảng 5 Kết quả thử hoạt tính chống nấm các chủng sau đột biến ( D đường kính trung bình... Pro 9, 10 10,30 0 ,0 0 8,50 0 ,0 0 0 ,0 0 0 ,0 0 Nhận xét: Chủng Streptomyces 9. 25 phát triển tốt trên các môi trường MT1, MT2, MT4 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt trên các môi trường này, nhưng tốt nhất trên MT 2 Do vậy chúng tôi quyết định chọn MT 2 làm môi trường giữ giống, và các môi trường MT1, MT2 và MT4 nghiên cứu trong các quá trình lên men tiếp theo Kháng sinh do Streptomyces 9. 25 tạo... tác dụng trên vi khuẩn G(-) mạnh hơn trên G(+) và mạnh nhất với trực khuẩn mủ xanh 3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Chủng Streptomyces 9. 25 đã được nuôi cấy trên 7 môi trường đặc khác nhau đủ ngày tuổi, để đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh khi thay đổi môi trường để chọn môi trường tốt nhất cho quá trình nuôi cấy và lên men Kết... 9. 25 sinh tổng hợp trong MT 2 Bảng 1: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên môi trường phân lập MT 2 ( D : Đường kính vòng vô khuẩn) VSVKD G(+) D(mm) BC 11,52 BP 8,84 BS 8,54 9, 32 SL 8,76 STa G(-) Ec 9, 30 Pseu 12,56 Shi 9, 30 Typhi 9, 26 Pro 9, 68 Nhận xét: Ở môi trường phân lập (MT2), chủng Streptomyces 9. 25 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tác dụng trên cả vi khuẩn G(+) và G(-), nhưng... 1', MT 2', MT 3', thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, để tìm môi trường lên men có khả năng tạo điều kiện cho sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất Kết quả được giới thiệu ò bảng 6 Bảng 6: Kết quả lựa chọn môi trường lên men chìm Sarcina lutea Môi trường Shigella flexneri D( mm) s fl(mm) s MT1' 10,05 0 ,95 7,34 0, 39 MT2' 12,21 0,26 9, 59 0, 39 MT3' 13,54 0,26 10,14 0,54 Nhận ... nghiệp hoá Tiếp tục từ việc nghiên cứu lởi phát) lựa chọn đề tài có tên: Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ khuẩn streptomyces 9. 25" với mục tiêu sau: - Nghiên cứu cải tạo giống... Hà Nội Tuy nhiên chủng nguyên thuỷ ban đầu, khả sinh tổng hợp kháng sinh chưa cao Do vậy, nghiên cưú nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh nghiên cứu chiết tách tinh chế kháng sinh điều kiện cần... cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Nghiên cứu sơ phương pháp chiết tách tinh chế kháng sinh - Nhận dạng định tên chủng Streptomyces 9. 25 PHẦN II TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm chung streptomyces