Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ strepomyces 27 271

... chủng Streptomyces 27. 271 có hoạt tính sinh kháng sinh tốt ổn định Là sở để lựa chọn khoá luận: " Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces 27. 271" với mục tiêu sau:... công nghệ đại, kháng sinh thường nghiên cứu phát tổng hợp theo hướng: tổng hợp hoá học, bán tổng hợp sinh tổng hợp Do có nhiều ưu điểm mà phương pháp tổng hợp kháng sinh nhờ vi sinh vật cách thức... suất sinh tổng hợp kháng sinh - Cần nghiên cứu thêm phương pháp thích hợp chiết tách thành phần kháng sinh dịch lên men - Cần tiến hành nghiên cứu thêm điều kiện lên men qui mô lớn hơn, nghiên cứu

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI .......... A- Q •&............ ĐÀO THỊ THANH HƯỜNG GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 27.271 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 2000- 2005) L 'u * « r' ' \ V lc L h 7 NOI THỰC HIỆN PGS. TS. CAO VĂN THU BỘ MÔN VI SINH VÀ SINH HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI THÒI GIAN THỰC HIỆN: 2/2005 - 5/2005 NGƯÒI HƯỚNG DẪN Hà Nội, tháng 5 nấm 2005 M ò ỉ c ả m ỔVL Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS. TS. Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Vi sinh và Sinh học, bộ môn công nghiệp dược và các bộ môn khác đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bè bạn đã quan tâm, động viên tôi trong thời gian qua. Do trình độ bản thân và thời gian có hạn, khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của các thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn./ Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2005. Sinh viên Đào Thị Thanh Hường MỤC LỤC Đặt vấn đề........................................................................................................... 1 Phần 1: Tổng Q uan............................................................................................3 1.1 Kháng sinh................................................................................................... 3 1.1.1 Lịch sử......................................................................................................... 3 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh................................................................................ 3 1.1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh.........................................................4 1.2 Đại cương về xạ khuẩn Streptomyces........................................................ 5 1.2.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces.............................5 1.2.2. Phân loại Streptomyces............................................................................... 6 1.3. Các phương pháp cải tạo giống................................................................. 6 1.3.1. Đột biến ngẫu nhiên.................................................................................... 6 1.3.2. Đột biến nhân tạo........................................................................................ 7 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh.... ...................................................... 8 1.4.1 Lên men bề mặt............................................................................................ 8 1.4.2 Lên men chìm .............................................................................................. 8 1.5 Tách và tinh chế sản phẩm......................................................................... 10 1.5.1 Đại cương về các phương pháp tách.......................................................... 10 1.5.2 Chiết xuất kháng sinh................................................................................10 1.5.3 Phương pháp sắc k ý ................................................................................... 10 1.6. Một số kết quả nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh.............................12 1.6.1. Aureoverticillactam- Kháng sinh Macrocyclic Lactam mới từ Streptomyces aureoverticillatus....................................................................... 12 1.6.2. Phương pháp tổng hợp các kháng sinh aminocoumarin mới từ coumermycin A I ............................................................................................... 13 1.6.3. Nghiên cứu phát hiện kháng sinh caprolacton mới từ xạ khuẩn Streptomyces ở b iể n .............................................................................................13 1.6.4. Gen điều khiển sao chép sinh tổng hợp nikkomycin của Streptomyces ansochromogenes................................................................................................. 15 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả......................................................................... 15 2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm ............................................ 15 2.1.1 Nguyên vật liệu...........................................................................................15 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 19 2.2 Kết quả thực nghiệm................................................................................... 27 2.2.1 Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces 27.271............. 27 2.2.2 Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp ................................... 28 2.2.3 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên.................................................................... 30 2.2.4 Kết quả đột biến hoạt tính sinh kháng sinh của Streptomyces 27.271 ánh sáng u v .................................................................................................................31 2.2.5 Kết quả tối ưu hoá các thành phần trong môi trường (M T4)..................33 2.2.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men.................... 36 2.2.7. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men (phương pháp giếng thạch)....................................................................3 7 2.2.8 Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi khác nhau........................38 2.2.9 Kết quả tách kháng sinh trong dịch lên men bằng sắc ký lớp mỏng......39 Phần 3: Kết luận và đề x u ất................................................................................ 41 CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic AIDS : Aciquired Immunodeíiciency Syndrome B D[mm\ : Blue : Đường kính trung bình các vòng vô khuẩn Gr : Green Gy : Grey Ha : Hair HIV : Human immunodeíiciency Virus ISP : International Streptomyces Project MS : Mass spectrium MT : Môi trường MTdd : Môi trường dung dịch RA : Retinaculiaperti RF : RectiAexibiles s : Spirales s : Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh sm : Smooth sp : Spiny V : Violet vsv : Vi sinh vật VK : Vi khuẩn Wa : Warty w : White Y : Yellow CĐ[...]... khả năng sinh tổng hợp tạo kháng sinh trên 7 môi trường thử nghiệm, khi phát triển trên môi trường MT4 và môi trường MT6 chủng có hoạt tính sinh kháng sinh cao Chọn các môi trường này làm môi trường nuôi cấy Streptomyces 27. 271 trong các thí nghiệm tiếp theo - Kháng sinh do chủng Streptomyces 27. 271 là kháng sinh phổ tương đối rộng, có tác dụng lên cả các vi khuẩn gram dương và gram âm Kháng sinh tác... 20 có hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao và ổn định Chọn chủng này, đem cất giữ để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo 2.2.4Kết quả đột biến hoạt tính sinh kháng sinh của Streptomyces 27. 271 bằng ánh sáng u v Tiến hành đột biến bằng ánh sáng u v với các tham số sau: Ả = 254 nm, khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian chiếu 5 phút, độ sống sót 0,13% Đánh giá hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh của các biến... gốc từ novobiocin operon, sẽ gắn carbamoyl vào 1 hoặc 2 đầu của cơ chất Sự hoạt động theo dây truyền của 4 enzym CouL, CouM, CouP và NovN như vậy có thể tạo ra nhiều kháng sinh aminocoumarin với nhiều đặc tính khác nhau 1.6.3 Nghiên cứu phát hiện kháng sinh caprolacton mới từ xạ khuẩn Streptomyces ở biển [8 ], [9], [16] Trong các nghiên cứu phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ vi sinh. .. Streptomyces Streptomyces 27. 271 sioyaensis - + - + + Hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử Streptomyces 27. 271 được trình bày ở phụ lục hìnhl và hình 2 (phần phụ lục) Nhận xét: Như vậy theo phương pháp phân loại ISP về cơ bản có thể kết luận Streptomyces 27. 271 là Streptomyces sioyaensis 2.2.2 Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp Đánh giá hoạt tính sinh kháng sinh của xạ khuẩn Streptomyces... Streptomyces 27. 271 lên bề mặt các môi trường ủ ở 30°c trong 6 ngày đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch và đánh giá E Tôi ưu hóa các thành phần trong môi trường theo phương pháp kinh điển - Nguyên tắc: Thay đổi hàm lượng của từng nhân tố trong môi trường (trong khi hàm lượng các nhân tố khác giữ nguyên Đánh giá những ảnh hưởng biến đổi về lượng đó đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. .. về pH trung tính và đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch Lượng dịch còn lại trong các ống nghiệm đem để tiếp vào tủ lạnh 5 ngày sau chỉnh về pH trung tính và đem thử hoạt tính kháng sinh Từ đó lựa chọn pH tối ưu cho quá trình chiết kháng sinh từ dịch lên men I Phương pháp chiết kháng sinh trong dịch lên men bằng dung môi hữu cơ - Chiết kháng sinh bằng cloroform, butyl acetat, butanol,... kết quả nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh 1.6.1 Aureoxertỉciỉỉactam- Kháng sinh mới Macrocyclic Lactam vòng 22 nguyên tử từ Streptomyces aureoverticillatus [8 ], [9], [17] Dịch chiết từ môi trường nuôi xạ khuẩn Streptomyces aureoverticillatus cho thấy có chất chống lại HT 29 (tế bào ung thư trực tràng ở người) ở nồng độ 2,5 |ig/ml Tiến hành sắc ký trên cột C18, phân đoạn kèm theo thử nghiệm sinh học... tự phát 6 Đối với xạ khuẩn: các cá thể đột biến tự phát theo các tần số khác nhau Có cá thể hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh tăng hơn - 10 2 0 % so với các cá thể khác Như vậy, nhiệm vụ của cải tạo giống là tuyển chọn lấy các cá thể có hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 1.3.2 Đột biến nhân tạo [2] [4], [7], [11] - Tác nhân gây đột biến: Tác nhân lý học: TiaX,... Đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu chứng D Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp - Nguyên tắc: Chủng Streptomyces 27. 271 được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau (MT1, MT2, MT3, ,MT7) Thử hoạt tính sinh kháng sinh của xạ khuẩn để xác định môi trường mà xạ khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất - Tiến hành: Cân pha 7 môi trường, hấp tiệt trùng các môi trường ở 1 at/30 phút... môi trường làm 2 đĩa Cấy xạ khuẩn Streptomyces 27. 271 lên bề mặt các môi trường, ủ ở 30°c trong 6 ngày Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch và chọn tỉ lệ thích hợp cho thành phần đó F.Phương pháp lên men gián đoạn + Nhân giống : Lấy chủng Streptomyces 27. 271 trong ống giống gốc, chọn lọc tự nhiên, đột biến cấy truyền sang ống thạch nghiêng, giữ ở nhiệt độ 30°c trong 6 ngày cho phát