Chấm kháng sinh lên bản mỏng đã hoạt hóa và tiến hành khai triển sắc ký với 3 hệ dung môi độc lập :
Hệ 1: Cloroform: Metanol: NH4OH 25% (2:2:1). Hệ 2: Butanol, Etanol, Dimetylformamide (3:1:1). Hệ 3: Etylacetat, Propanol, Acetonitril (2:3:1).
Kết quả sắc ký lớp mỏng khai triển với các hệ dung môi được trình bày ở bảng 19.
Bảng 19: Kết quả tách các thành phần kháng sinh trong dịch lên men bằng sắc ký lớp mỏng.
Hệ dung môi khai triển
Rf
Mắt thường soi u v Ninhydrin Vi sinh vật
Hệ 1 - - - 0,78 Hệ 2 - - - 0 0,81 Hệ 3 - - - 0 0,85
Hình ảnh kết quả sắc ký lớp mỏng (hiện hình kháng sinh bằng vi sinh vật) được trình bày ở hình 5 (phần phụ lục).
Nhận xét:
- Kết quả hiện hình bằng vi sinh vật cho thấy có ít nhất 2 thành phần kháng sinh trong dịch lên men.
- Các thành phần kháng sinh không hiện màu dưới ánh sáng u v và không có phản ứng màu với thuốc thử ninhydrin.
T^hẩn 3»
KẾT LU6N vè ĐỂ XUẤT
Kết luân:
Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm trên chủng Streptomyces 27.271 chúng tôi thu được kết quả sau:
- Phân loại xạ khuẩn chủng Streptomyces 27.271 theo khóa phân loại ISP, cơ bản kết luận chủng phân loại là Streptomyces sioyaensis.
- Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp kháng sinh tốt là MT4. - Chọn lọc ngẫu nhiên các dạng chủng có hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao là các dạng chủng 1, 7, 20.
- Đột biến bằng ánh sáng u v (A = 254 nm) chọn các biến chủng sinh kháng sinh tôt là 14, 19, 29.
- Bước đầu tối ưu hoá môi trường cho quá trình lên men (từ MT4) thu được môi trường tối ưu (theo ý nghĩa kinh điển).
- Bước đầu lựa chọn dung môi chiết thích hợp kháng sinh từ dịch lên men: n-Butanol, pH chiết thích hợp là pH 10.
- Tách kháng sinh từ dịch lên men bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và căn bản kết luân là có ít nhất 2 thành phần kháng sinh trong dịch lên men.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men, thu được kết quả là kháng sinh ổn định hơn ở pH 9.
Đé xuất:
- Chủng Streptomyces 27.271 là chủng có hoạt tính sinh kháng sinh tốt và ổn định, cần tiến hành thêm các nghiên cứu về đột biến chủng và điều kiện lên men để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh.
- Cần nghiên cứu thêm về các phương pháp thích hợp chiết tách các thành phần kháng sinh trong dịch lên men.
- Cần tiến hành nghiên cứu thêm về các điều kiện lên men trên qui mô lớn hơn, nghiên cứu tinh chế sản phẩm để xác định cấu trúc các thành phần kháng sinh, thử tác dụng và độc tính của các kháng sinh khi điều kiện cho phép.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ môn Hoá phân tích (1998). Hoá phân tích I I, Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 43 - 72.
2. Bộ môn Hoá sinh (2004). Hoá sinh học, NXB Y học, tr. 94 — 119
3. Bộ môn Hoá sinh - Vi sinh (1999). Vi sinh học, Trung tâm thông tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tr.
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997). Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 39 - 41, 417 - 420.
5. Trần Tử Hiếu (2002). Hoá học phân tích, NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr. 3 5 2 -391.
6. Từ Minh Koóng (2004). Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất dược phẩm,
NXB Y học, tr. 42 - 50, 84 - 8 6.
7. Lê Đình Lương, Phan Cự nhân (1997). Cơ sở di truyền học , NXB Giáo dục, tr. 4 0 - 4 5 .
8. Từ Văn Mặc (2003). Phân tích hoá lý, phương pháp phổ nghiệm nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Khoa học kỹ thuật, tr. 73 - 96.
9. Nguyễn Kim Phụng (2004). Khối phổ- Lý thuyết - Bài tập - Bài giải, NXB Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, tr. 58 - 78.
10. Trần Thị Thanh (2003). Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr.17 - 52. 11. Cao Văn Thu (2000). Bài giảng kháng sinh - vitamin, tr. 1 - 25, 42 - 6 8 .
12. E. B. Shirling, D. Gottlieb (1966). Method for characterozation o f Streptomyces species, Int, Syst, Bacteriol Voỉ 16.
13. Freel Meyers, Oberthur M, Heide L, Kahne D, Walsh CT (2004).
“Assembly o f dimeric variants o f coumermycin by tandem action o f four biosynthetic emyms CouL, CouM, CouP, Nov N ”, Biochemistry 2004 Nov 30, 43-47.
14. John Lacey (2004). “Drug resistant Bacteria may find new foe in novel Drug Design Approach ”, http://Science daily.com/release/2004/08
15. Kammere B, Kachlich R, lauser s, Li SM, Heide L, G leiter CH (2004)
“Mass spectrometic phath way monitoring o f secondarỵ metabolites: Syntematic anallysis o f culture extract o f Streptomyces species
http://www.ncbi.clm.nih.gov/entrez/query.fcgi
16. Katja Stritzke, Stefan Schulz, Hartmut Laatsch, Elisabeth Helmke, Winfried Beil (2004). ‘Wớvổ/ caprolactones from a Marine Streptomycete”, Jounal of natural product Vol 67, N° 3, 395-401.
17. Scott s. Mitchell, Berỳamin Nicholson, Sy Teisan, Kin s. Lam, Barbara M. Potts (2004). “Aureoverticillactam, a novel 22- Atom Macrocyclic Lactam from the Marin Actinomycete Streptomyces aureoverticillactam”, Joumal
PHỤ LỤC
Hình 3: Kết quả tối ưu hoá thành phần cao nghô trong môi trường MT4 (vi sinh vật kiểm định: Proteus mirabilis).
Hình5: Kết quả sắc ký lớp mỏng (hiện hình kháng sinh bằng vi sinh vật; hệ dung môi khai triển: hệ 3).